一种测定蓝藻蓄积无机正磷酸盐的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定蓝藻蓄积无机正磷酸盐的方法，采集所需测定藻液适量，离心得沉淀物，加入适量去离子水混匀，恒温水浴2h，使得藻细胞与胶鞘分离，得均匀藻液，加入三氯乙酸抽提，取上清液，调节pH至中性，测定正磷酸盐浓度。本方法可以可以快速的测定具有厚胶被的蓝藻如群体微囊藻和蓝藻水华样品所蓄积的正磷酸盐含量，而且只测定正磷酸盐的蓄积量，避免了藻体中有机磷和聚磷颗粒对测定正磷酸盐量的影响。采用本方法测定蓝藻蓄积正磷酸盐浓度，简单易行，适应范围广。
【专利说明】一种测定蓝藻蓄积无机正磷酸盐的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及测定蓝藻或蓝藻水华样品中所蓄积的无机正磷酸盐的方法。
【背景技术】
[0002]富营养化已成为我国大多数淡水水体面临的环境问题，蓝藻水华的频繁发生是富营养湖泊的一个重要特征。磷与浮游植物生物量之间存在显著的相关性，所以磷被认为是湖泊水体中藻类种群和密度的第一限制性元素。为适应磷限制环境，部分蓝藻已发展出一些适应机制，其一就是能吸收过量的磷储存在细胞内。蓝藻具有蓄积磷的能力是其在磷限制水体中占优势的原因之一，研究蓝藻对于磷的蓄积行为对于揭示蓝藻水华发生机理及其防治有着重要意义。
[0003]国内外学者针对于蓝藻对磷吸收的问题开展了广泛的研究。在研究蓝藻对磷代谢和蓄积行为过程中，需要测定藻体的各种磷形态。正磷酸盐是唯一能被藻类吸收利用的磷形态，因此对于蓝藻蓄积的正磷酸盐量的测定也是必不可少的研究内容之一。关于测定藻体蓄积的磷，目前文献报道的方法主要有消解的方法测定细胞内磷(易文利等，不同质量浓度的磷对铜绿微囊藻生长及细胞内磷的影响，环境科学研究，2004)，三氯乙酸抽提的方法(杨柳燕等，铜绿微囊藻磷代谢过程研究，农业环境科学学报，2005),无机酸抽提和直接显色的方法等(张胜花等，不同氮磷营养条件下铜绿微囊藻对正磷酸盐的蓄积效果，长江流域资源与环境，2008)测定藻体蓄积正磷酸盐。消解的方法即将藻液加入过硫酸钾溶液，置于121°C的高压锅中消解，冷却后测定其中正磷酸盐含量。三氯乙酸抽提和无机酸抽提的方法分别是将适量藻液加入三氯乙酸或无机酸进行抽提，抽提后的藻液过滤得上清液，调为中性后测定其中正磷酸盐含量。直接显色法，是指取藻液适量，加入抗坏血酸和钥酸盐显色剂，显色后离心测定吸光度值，换算成正磷酸盐浓度。在对单细胞铜绿微囊藻的相关研究中，对比所列几种方法，采用消解的方法，藻体内的有机磷被消解，所测得的正磷酸盐浓度值要比其他的两种方法大，但又无法区分其中有机磷的量，所以消解的方法不能真实反应藻类蓄积正磷酸盐的量。采用无机酸抽提与有机酸抽提的结果无显著性差异&>0.05)，说明无机酸抽提法可以应用于对室内单细胞藻类蓄积的正磷酸的提取。直接显色法测定的结果与三氯乙酸抽提法和无机酸抽提法测定的结果一致，说明对于单细胞铜绿微囊藻可以采用直接显色法测定其蓄积的正磷酸盐浓度(张胜花等，不同氮磷营养条件下铜绿微囊藻对正磷酸盐的蓄积效果，长江流域资源与环境，2008)。
[0004]虽然，对于类似单细胞铜绿微囊藻这样的蓝藻，现有方法已经可以解决测定藻体正磷酸盐浓度的问题，但野外水体中存在的一些藻类往往具有较厚的胶鞘(如群体铜绿微囊藻)，此时采用无机酸和有机酸抽提的方法，无法破坏其外部的胶鞘层，从而蓄积的磷无法释放出来，而采用消解的方法所测定的是藻体蓄积的磷以及作为藻细胞组成的有机磷，因此无法正确得出蓄积磷量。针对上述不足，进一步开发蓝藻正磷酸盐蓄积量的测定方法十分必要。
【发明内容】
[0005]为了解决现有的蓝藻蓄积正磷酸盐的测定方法不能广泛用于测定野外蓝藻水华或类似具有较厚胶鞘的藻体实际蓄积正磷酸盐量的不足，本发明提供一种测定蓝藻蓄积正磷酸盐的方法，测定方法简单，适应范围广。
[0006]本发明的技术方案为:采集所需测定藻液，离心后，加入适量水混匀，水浴，加入三氯乙酸抽提，取上清液，测定正磷酸盐浓度。具体通过以下步骤实现:
第一步，采集所需测定的藻液适量，12 000 r X mirT1,10°C离心15min,弃去上清液，得浓缩藻液。
[0007]第二步，将浓缩藻液加入5mL去离子水混匀后，于控温精确的水浴锅中30°C水浴2h，使得藻细胞与外在胶被分离，得均匀藻液。
[0008]第三步，将上述均匀藻液，加入ImL 10%三氯乙酸抽提10 min后，12 000r XmirT1，10°C离心15 min,取上清液，加入一滴酚酞，加NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴H2SO4使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液。
[0009]第四步，将待测溶液加去离子水稀释到10 mL，加入0.2 mL抗坏血酸溶液后加入0.4 mL钥酸盐显色剂,显色15 min,于分光光度计700 nm处测定吸光度值。对比磷标准曲线，换算成磷浓度。
[0010]本方法的优点:
本发明提供了一种测定蓝藻蓄积正磷酸盐的方法，同现有的测定方法相比，具有以下优点:
1、本方法可以快速的测定具有厚胶被的蓝藻如群体微囊藻和蓝藻水华样品所蓄积的正磷酸盐含量；
2、本方法可以只测定正磷酸盐的蓄积量，避免了藻体中有机磷和聚磷颗粒对测定正磷酸盐量的影响。
【具体实施方式】
[0011]下面通过几个具体的实施例对本发明做进一步的说明。
[0012]实施例1:采用MIII培养液预培养单细胞铜绿微囊藻(FACHB905)，转接培养12天后，分别采用消解法、传统三氯乙酸抽提法和本方法测定蓄积的正磷酸盐含量。具体步骤为，取3份2 mL单细胞铜绿微囊藻藻液,12 000 rXmirT1离心15 min,弃上清液,得3份沉淀物。一份用5 mL蒸馏水取出，加入ImL 5%过硫酸钾，121°C消化30min，得待测液A。一份加I mL 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1离心15 min,取上清液后加入酹酞一滴,力口NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴H2SO4使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液B。一份加去离子水5 mL，30°C水浴2h后，加Iml 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1离心15分钟，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴H2SO4使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液C。将待测溶液A、B和C放入10 mL比色管，加水至10 mL，加入0.25 mL10%抗坏血酸和0.4 mL钥酸盐溶液后，显色15 min，在可见光700 nm处，用721分光光度计比色测定溶液正磷酸盐含量。实验平行三次，根据藻体积换算成藻液中磷浓度。
[0013]测定结果如表I所示，单细胞铜绿微囊藻蓄积正磷酸盐采用本方法与传统三氯乙酸抽提法无显著性差异(ρ>0.05)，而消解法测得值与本方法和传统三氯乙酸抽提法之间存在显著性差异(/7〈0.01)。
[0014]表1、三种方法测定单细胞铜绿微囊藻蓄积磷量比较
实施例2:采用MIII培养液预培养群体微囊藻(FACHB 1178)，分别采用消解法、传统三氯乙酸抽提法和本方法测定蓄积的正磷酸盐含量。具体步骤为，取3份2 mL单细胞铜绿微囊藻藻液，12 000 rXmirT1离心15 min,弃上清液,得3份沉淀物。一份用5 mL蒸懼水取出，加入ImL 5%过硫酸钾，121°C消化30min，得待测液A’。一份加I mL 10%三氯乙酸抽提，12 000 rXmirT1离心15 min，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴H2SO4使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液B’。一份加去离子水5 mL, 30°C水浴2h后，加Iml 10%三氯乙酸抽提，12 000 r XmirT1离心15分钟，取上清液后加入酚酞一滴，加NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴H2SO4使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液C’。将待测溶液A’、B’和C，放入10 mL比色管，加水至10 mL，加入0.25 mL 10%抗坏血酸和0.4 mL钥酸盐溶液后，显色15 min，在可见光700 nm处，用721分光光度计比色测定溶液正磷酸盐含量。实验平行三次，根据藻体积换算成藻液中磷浓度。
[0015]测定结果如表2所示，消解法、传统三氯乙酸抽提法和本方法所测蓄积磷量之间皆有显著性差异(/7〈0.01)。群体铜绿微囊藻蓄积正磷酸盐采用传统三氯乙酸抽提法无法破坏胶被，很难提取出蓄积的正磷酸盐，而本方法可以通过剥离群体微囊藻细胞外胶被后再用三氯乙酸抽提出所蓄积的正磷酸盐。消解法因为同时包含了藻体所含有机磷和聚磷颗粒，因而测得值与本方法之间存在显著性差异(ρ<0.01)。
[0016]表2、三种方法测定单细胞铜绿微囊藻蓄积磷量比较
【权利要求】
1.一种测定蓝藻蓄积无机正磷酸盐的方法，其特征在于含有以下步骤: 第一步，采集所需测定的藻液适量，12000 r X mirT1,10°C离心15min,弃去上清液,得浓缩藻液； 第二步，将浓缩藻液加入5mL去离子水混匀后，水浴，使得藻细胞与外在胶被分离，得均匀藻液； 第三步，将上述均匀藻液，加入ImL 10%三氯乙酸抽提10 min后，12 000 r X mirT1，10°C离心15 min,取上清液，加入一滴酚酞，加NaOH直到溶液呈粉红色，然后加一滴比304使溶液呈无色，得呈中性的待测溶液； 第四步，将待测溶液加去离子水稀释到10 mL，加入0.2 mL抗坏血酸溶液后加入0.4 mL钥酸盐显色剂，显色15 min，于分光光度计700 nm处测定吸光度值； 对比磷标准曲线，换算成磷浓度。
2.如权利要求1所述的一种测定蓝藻蓄积无机正磷酸盐的方法，其特征在于第二步，待测藻液水浴条件为置于精确控温30°C下水浴2h，得到藻细胞与外在胶被分离的均匀溶液。
【文档编号】G01N21/31GK103969205SQ201410230844
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】张胜花, 张赛男, 赵静 申请人:云南大学