一种河豚毒素检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：A、已知浓度的标准品；B、缓冲体系L；C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，叠氮钠（防腐剂）0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120-200nm的胶乳颗粒0.6-0.8g/L；D、河豚毒素浓缩样品提取液10×。本发明具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
【专利说明】一种河豚毒素检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种河豚毒素检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是飩鱼类(俗称河豚鱼)及其它生物体内含有的一种生物碱(氨基全氢喹唑啉型化合物)，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一；其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致死。
[0003]申请号200410036380.0的发明专利公开了一种河豚毒素的简便快速的检测方法。该方法用强碱处理河豚毒素，得到与河豚毒素等摩尔量的2-氨基-6-羟甲基-8-羟基喹啉与草酸盐。利用草酸氧化酶将草酸盐催化氧化成过氧化氢。之后通过显色剂与过氧化氢反应显色，通过在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。该方法存在的缺陷是:操作复杂，检测时间长，无法进行大批量样品的同时测定。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种河豚毒素检测试剂盒，具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分:
A、已知浓度的标准品；
B、缓冲体系，所述缓冲体系各组分及其浓度为:pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲铵(反应促进剂)l_3g/L，叠氮钠(防腐剂)0.1-0.5g/L，吐温20 (表面活性剂)
0.5-1.5mol/L，柠檬酸 0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白 1-3 g/L ；
C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为:pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L,叠氮钠(防腐剂)0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒:其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120_200nm的胶乳颗粒 0.6-0.8 g/L ；
D、河豚毒素浓缩样品提取液1X各组分及其浓度为:甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸铵 l_3g/L。
[0006]本发明的检测原理为胶乳增强免疫比浊法，具体为:河豚毒素浓缩样品提取液稀释至正常浓度提取样品后得样品提取液，缓冲体系中加入样品提取液，然后加入检测液，检测液中与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒上的河豚毒素单克隆抗体与样品提取液中河豚毒素特异性结合形成可溶性抗原抗体复合物，形成的浊度和样品中河豚毒素的含量成正相关关系。
[0007]与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒分为小粒径颗粒(30-50 nm)、中粒径颗粒(60-90 nm)和大粒径颗粒(120-200 nm)三部分，小粒径颗粒比表面积大，交联的河豚毒素单克隆抗体较多，增加了检测的线性范围。大粒径颗粒较大，结合河豚毒素后容易显现浊度，提高了检测的灵敏度。中粒径颗粒能保证检测线性范围的同时，还能增强浊度显示，保证了检测的稳定性。控制与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的含量异常重要，对于检测起到了核心作用。大粒径颗粒(120-200 nm)的浓度、中粒径颗粒(60-90 nm)浓度较大容易显现浊度，小粒径颗粒浓度0.1-0.2g/L，保证了检测的线性范围，这样检测效果最佳。
[0008]作为优选，标准品浓度分别为O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0009]作为优选，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下:
(1)、在离心管内分别加入150-180μ L纳米胶乳颗粒，1200-1400yL pH 7.4
0.01-0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，300-400 μ L EDAC水溶液，磁力搅拌3-5小时，4°C, 12000g离心60-80min,弃上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超声振荡l-2min；
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液 300-400 μ L,搅拌 20-30min ；
(4)、4°C，1000g离心60-80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
[0010]纳米I父乳颗粒为市售广品，广品为乳液状，广品中纳米I父乳颗粒含量为20%(w/v);EDAC水溶液浓度为0.2g/ml。河豚毒素单克隆抗体有三株，三株河豚毒素单克隆抗体与河豚毒素有不同结合位点，这样检测的灵敏度、特异性更好。
[0011]用河豚毒素单克隆抗体和带氨基的纳米胶乳颗粒进行化学交联，优化缓冲液的浓度、pH、离心参数、超声条件控制等，得到了检测性能佳的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
[0012]作为优选，步骤(2)所述的超声振荡期间，超声I秒，间隔3-4秒。
[0013]作为优选，所述纳米胶乳颗粒的粒径为30-50nm、60-90nm或120_200nm。
[0014]本发明的有益效果是:具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
【具体实施方式】
[0015]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0016]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0017]本发明的三株河豚毒素单克隆抗体是按照现有技术记载:王健伟等，抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其特性的初步研究，卫生研究，1996年，9月第25卷第5期，308-311页记载的方法获得(1G3、4G3、6D9三株)。
[0018]实施例1:
一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分:
A、已知浓度的标准品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0019]B、缓冲体系:所述缓冲体系各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.0lmol/L,溴化己二甲铵lg/L,叠氮钠0.lg/L,吐温20 0.5mol/L,朽1檬酸1.6 g/L,牛血清白蛋白Ig/L。
[0020]C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.01mol/L,叠氮钠0.lg/L,与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒:其中粒径为30nm的胶乳颗粒0.lg/L,粒径为60nm的胶乳颗粒0.2g/L，粒径为120nm的胶乳颗粒0.6g/L。
[0021]与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下:
(1)、在离心管内分别加入150μI纳米胶乳颗粒(市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20% (w/v)，粒径为30nm、60nm或120nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒)，1200 μ I pH 7.4 0.01mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株(1G3、4G3、6D9三株)，300 μ I EDAC水溶液(浓度为0.2g/ml )，磁力搅拌3小时，4°C，12000g离心60min,弃上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超声振荡lmin，超声振荡期间，超声I秒，间隔3秒；
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液)重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液300 μ 1，搅拌20min ；
(4)、4°C，1000g离心60min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、
0.01mol/L的PBS缓冲液)重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
[0022]D、河豚毒素浓缩样品提取液10X各组分及其浓度为:甲醇10g/L，乙酸2g/L，乙酸铵 3g/L。
[0023]实施例2:
一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分:
A、已知浓度的标准品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0024]B、缓冲体系:所述缓冲体系各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.03mol/L，溴化己二甲铵3g/L，叠氮钠0.5g/L，吐温20 1.5mol/L，柠檬酸0.8g/L，牛血清白蛋白3g/L。
[0025]C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.03mol/L,叠氮钠0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒:其中粒径为50nm的胶乳颗粒0.2g/L，粒径为90nm的胶乳颗粒0.4g/L，粒径为200nm的胶乳颗粒0.8 g/L。
[0026]与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下:
(1)、在离心管内分别加入180μI纳米胶乳颗粒(市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20% (w/v)，粒径为50nm、90nm或200nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒)，1400 μ I pH 7.4 0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，400 μ IEDAC水溶液(浓度为0.2g/ml)，磁力搅拌5小时，4°C,12000g离心80min，弃上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超声振荡2min，超声振荡期间，超声I秒，间隔4秒；
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、0.03mol/L的PBS缓冲液)重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液400 μ 1，搅拌30min ；
(4)、4°C，1000g离心80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、
0.03mol/L的PBS缓冲液)重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
[0027]D、河豚毒素浓缩样品提取液10X各组分及其浓度为:甲醇15g/L，乙酸5g/L，乙酸铵 Ig/Lο
[0028]实施例3:
一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分:
A、已知浓度的标准品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0029]B、缓冲体系:所述缓冲体系各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.02mol/L,溴化己二甲铵2g/L,叠氮钠0.3g/L,吐温20 lmol/L,朽1檬酸lg/L,牛血清白蛋白2 g/L。
[0030]C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为:pH 7.4的PBS缓冲液0.02mol/L,叠氮钠0.2g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒:其中粒径为40nm的胶乳颗粒0.15g/L，粒径为70nm的胶乳颗粒0.3g/L，粒径为160nm的胶乳颗粒0.7 g/L。
[0031]与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下:
(1)、在离心管内分别加入170μI纳米胶乳颗粒(市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20% (w/v)，粒径为40nm、70nm或160nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒)，1300μ I pH 7.4 0.02mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，350 μ IEDAC水溶液(浓度为0.2g/ml)，磁力搅拌4小时，4°C,12000g离心70min，弃上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超声振荡1.5min，超声振荡期间，超声I秒，间隔3秒；
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、0.02mol/L的PBS缓冲液)重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液350 μ 1，搅拌25min ；
(4)、4°C，1000g离心70min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液(pH7.4、
0.02mol/L的PBS缓冲液)重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
[0032]D、河豚毒素浓缩样品提取液1X各组分及其浓度为:甲醇12g/L，乙酸3g/L，乙酸铵 2g/L。
[0033]本发明的试剂盒产品具体规格如下:
组份名称I剂量标准品X7瓶*_Iml/瓶缓冲体系_50ml
检测液_15ml
河豚毒素浓缩样品提取液1X |50ml
本发明的试剂盒产品:贮藏条件:保存试剂盒于2~8V ;保存期:该产品有效期为12个月。
[0034]河豚毒素浓缩样品提取液1X使用时:用去离子水将河豚毒素浓缩样品提取液1X按1:9体积比进行稀释，即:1份河豚毒素浓缩样品提取液+9份去离子水，配好的样品提取液在4°C环境可保存一个月。
[0035]样品提取方法为:
河豚鱼冷冻样品，装于密封塑料袋中于流水下急速解冻，整体鱼用蒸馏水清洗后，用滤纸吸干，然后将鱼分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精束)等部分，用蒸馏水洗去血污，再用滤纸吸干，分别将解剖后取得的样品剪碎，充分均质。称取上述均质样品1.0 g土 0.02g于50 mL聚苯乙烯离心管中，加入样品提取液ImL,润流混合3min ;于4000印111,离心1min,取50 μ L分析。
[0036]样本中的河豚毒素与胶乳颗粒表面的抗体结合，相邻的胶乳颗粒彼此交联，使测量溶液浊度增加，根据500nm处吸光度的增加，与标准曲线比较，可计算出样本中河豚毒素的含量。
[0037]本发明的性能评价:
性能特征:线性范围:2-100 Ug /L ;分析灵敏度:Λ A彡0.005/20 μ g/L ;测量精密度:CV ( 7.0% ;批间差彡10.0% ;稳定性:12个月。可以大批量同时测定。
[0038]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【权利要求】
1.一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于:所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分: A、已知浓度的标准品； B、缓冲体系，所述缓冲体系各组分及其浓度为:pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲铵 l_3g/L，叠氮钠 0.1-0.5g/L，吐温 20 0.5-1.5mol/L，柠檬酸 0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白1-3 g/L ； C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为:pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L,叠氮钠0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒:其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120_200nm的胶乳颗粒0.6-0.8 g/L ； D、河豚毒素浓缩样品提取液1X各组分及其浓度为:甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸铵 l_3g/L。
2.根据权利要求1所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于:标准品浓度分别为Oμ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L, 100 μ g/L。
3.根据权利要求1所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于:与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下: (1)、在离心管内分别加入150-180yL纳米胶乳颗粒，1200-1400 μ L pH 7.40.01-0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，300-400 μ L EDAC水溶液，磁力搅拌3-5小时，4°C, 12000g离心60-80min,弃上清液； (2)、沉淀置于冰浴中，超声振荡l-2min； (3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液 300-400 μ L,搅拌 20-30min ； (4)、4°C，1000g离心60-80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于:步骤(2)所述的超声振荡期间，超声I秒，间隔3-4秒。
5.根据权利要求3所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于:所述纳米胶乳颗粒的粒径为 30-50nm、60-90nm 或 120_200nm。
【文档编号】G01N33/577GK104133063SQ201410251894
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】张小军, 严忠雍, 梅光明, 龙举 申请人:浙江省海洋水产研究所