短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法
【专利摘要】本发明公开了一种短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色方法，属于分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域。本发明包括如下步骤：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，再用去离子水进行漂洗，然后用花青素类核酸染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。本发明无需使用放射性同位素，简便易行，染色效果好，能够检出长度为5-11个碱基的短链寡核苷酸；标本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸即可进行分析；且检测灵敏度高，比直接花青素染色提高200倍以上。
【专利说明】短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域，具体是在电泳后采用 甲醇固定，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和 SYBR Green II RNA gel stain 两种花青素类核酸染料中的一种进行染色，对长度为5-11个碱基的寡核苷酸进行检测的 方法。
【背景技术】
[0002] 寡核苷酸主要是指20个以下碱基的短链核苷酸，包括脱氧寡核糖核酸（DNA)及寡 核糖核酸（RNA)，在自然界中广泛存在，也可以是人工合成的产物，人工合成的寡核苷酸主 要用于PCR、核酸分子杂交、核酸连接反应和RNA干扰等过程。寡核苷酸质量的好坏可直接 影响上述过程的成败，因此在上述试验中常常需要检测寡核苷酸的长度和质量。目前检测 寡核苷酸长度和质量的简便有效的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0003] 寡核苷酸经过聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，必须用放射性同位素标记或非放射性同 位素染色才能显现出来。由于放射性同位素标记可以进行原位放射自显影，短链寡核苷酸 扩散丢失较少，因此放射性同位素标记的优点是受检寡核苷酸的最小长度不受限制，其缺 点是可对操作人员造成损伤，对环境造成污染，放射废物不易处理等，现已几乎被非放射性 同位素染色所取代。
[0004] 目前寡核苷酸的非同位素染色方法主要有溴乙锭（EB)染色、不对称花青素类染 色（包括SYBR Green I、SYBR Green II和SYBR Gold等）和银染色等。EB染色的最大优 点是价格便宜，操作简单，但EB是一种强致癌物质，易对环境造成污染或对操作人员造成 损害，且灵敏度不够高。不对称花青素的灵敏度比EB高，背景低，无需洗脱过程，未发现有 致癌性，在凝胶中检测DNA和RNA的灵敏度比EB高出10倍以上，可用于检测双链和单链 DNA以及RNA等，其主要缺点是成本较高，不够稳定，易受pH值等因素的影响。银染法的优 点主要是敏感度高，可接近甚至达到放射性同位素的水平，是目前检测寡核苷酸比较常用 的染色方法之一。
[0005] 以上介绍的核酸染色方法对于15个碱基以上的长链寡核苷酸的检测都比较有 效。但除了银染法之外，上述其它染色方法都不能有效检测短链寡核苷酸，这是因为寡核苷 酸片段较短，尤其是当其长度只有11及11个碱基以下时，寡核苷酸在染色的过程中容易从 凝胶中扩散出来，从而造成染色失败。但采用银染法又有操作步骤较多，耗时较长，不能检 出某些寡核苷酸的缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种比银染法更简便的短链 寡核苷酸非放射性同位素染色方法，用于检测5-11个碱基长度的短链寡核苷酸。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用 甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，防止或尽量减少其扩散，然后用去离子 水进行漂洗，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和 SYBR Green II RNA gel stain 两种花青素类染料中的一种染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。其 中 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 主要用于双链 DNA 染色，而 SYBR Green II RNA gel stain则主要用于RNA及单链DNA染色。
[0008] 进一步地，上述对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为：
[0009] (1)准备样品
[0010] 将寡核苷酸配制成1〇〇μΜ的溶液，然后在微量紫外分光光度计上测定其 实际浓度；配制甲酰胺加样缓冲液，其配方为：96〇 μ 1甲酰胺，4〇μ 1 250mmol/L、 EDTA (ρΗ8· 0)，0· 05% (w/v)溴酚蓝；
[0011] ⑵制作浓度为15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶中丙烯酰胺与甲叉双 丙烯酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为4-7M，凝胶的大小为10X 10cm，厚度为0. 3_。凝 胶和电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0. 5XTBE。
[0012] 优选地，5-10个碱基的寡核苷酸选用30-45% (w/v)的凝胶，10-15个碱基的寡核 苷酸选用20-30% (w/v)的凝胶，15个碱基以上（含15个）的寡核苷酸选用15-25% (w/ v)的凝胶。
[0013] 优选地，15-35% (w/v)凝胶中的尿素浓度为7M，40% (w/v)凝胶中的尿素浓度为 6M，45% (w/v)的凝胶中的尿素浓度为4M。
[0014] (3)变性处理：将1μ g的寡核苷酸与2μ 1加样缓冲液混勻，于95°C变性30-60秒， 迅速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构；
[0015] (4)电泳：将上述已变性的寡核苷酸加样于15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶 上进行电泳，电压为200-600V，电泳时间为1-4. 5小时，电泳温度为20-30°C。
[0016] 进一步地，本发明用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上的具体步骤 为：将凝胶浸入甲醇固定液中，4-30°C浸泡1. 5-2小时，甲醇固定液为含有10% (v/v)乙酸 的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量为50ml/胶。通过甲醇固定液的固定，可以有 效防止短链寡核苷酸从染色剂中扩散出来，从而能使5-11个碱基长度的寡核苷酸被成功 检测。
[0017] 凝胶被固定后，用去离子水（200ml/胶）漂洗3次，每次3分钟。
[0018] 优选地，上述凝胶的浸泡温度根据寡核苷酸中碱基长度来确定，片段越短，浸泡温 度越低，以减少扩散。其中，8个及8个以上碱基长度的寡核苷酸的浸泡温度为15-30°C，8 个以下碱基长度可用选用4-15°C。
[0019] 优选地，在电泳时，不同的凝胶浓度选用不同的电压：15%凝胶，为200V ;20%凝 胶，300V ;25%凝胶，400V ;30-35%凝胶，500V ;40-45%凝胶，600V。同时，电泳的时间也根 据凝胶的浓度来确定，15-25%的凝胶电泳时间为1小时；30%的凝胶电泳时间为1. 5小时； 35-40%的凝胶电泳时间为3-3. 5小时；45%的凝胶电泳时间为4. 5小时。
[0020] 进一步地，本发明的方法中用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色是指将 2μ1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye加入10ml去离子水中，混勻后将凝胶充分浸 入其中，不留气泡，常温下浸泡30-60分钟。用SYBR Green II RNA gel stain染色是指将 Ιμ? 10000X的SYBR Green II RNA gel stain加入10ml去离子水中，混匀后将凝胶充分 浸入其中，不留气泡，常温下浸泡30-60分钟。
[0021] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0022] 1、电泳结束之后凝胶染色之前，加入甲醇固定过程，使寡核苷酸固定于凝胶之中， 防止或尽量减少其扩撒，从而保证有足够的寡核苷酸能被染色，本发明通过简便易行的方 法，能够检出长度为5-11个碱基的短链寡核苷酸，克服了采用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain直接染色难以检出长度小于11个碱基的寡核 苷酸的技术问题。
[0023] 2、本发明无须放射性同位素，使用安全，且相比银染法操作步骤少，产生的污染 少，操作更简便。
[0024] 3、本发明通过增加甲醇固定过程，能显著提高SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain染色对短链寡核苷酸的灵敏度，比直接SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色提高200倍以上，标本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸 即可进行分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1实施例1实验1中11种寡核苷酸的15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0026] 图2实施例1实验2中7中寡核苷酸的40%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0027] 图3灵敏度检测结果图，其中A为用本发明的方法对寡核苷酸oligo八11进行甲醇 固定和染色后的检测结果图，B为直接用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye进行染色 后的检测结果图。
【具体实施方式】
[0028] 本发明检测长度为5-11个碱基的寡核苷酸的原理是：寡核苷酸聚丙烯酰胺凝胶 电泳结束后，凝胶上的寡核苷酸必须经过染色才能显示出来，但是在染色的过程中，短链 寡核苷酸，尤其是11个碱基以下的寡核苷酸很容易从凝胶扩撒到染液及洗涤液中，从而 使染色失败。因此本发明的关键是在常规电泳结束之后，凝胶染色之前，加入甲醇固定过 程，使寡核苷酸固定于凝胶之中，防止或尽量减少其扩撒，从而保证有足够的寡核苷酸能被 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye或SYBR Green II RNA gel stain染色，最后用紫外 透视仪或凝胶成像仪来观察结果。下面通过实施例对本发明作进一步详述：
[0029] 实施例1染色效果实验
[0030] 实验试剂：受检寡核苷酸为 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、oligo (CG3) 2、oligo (ACG) 3、oligo T9、oligo A7C4、oligo (A5T)、oligo (ACGT) 2、oligo C8、oligo C7、oligo C6、oligo C5、oligo T7、oligo Tj^Poligo T5，由上海生工合成，其序列见 表1。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、Tris、Na2EDTA · 2H20、硼酸、甲醇、乙酸、四甲基乙二 胺（TEMED)、过硫酸铵、甲酰胺和溴酚蓝均为分析纯，均购自上海生工。SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain分别购自上海生工和北京索莱宝科技 有限公司。
[0031] 实验 1 :对 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、 oligo(CG3)2、oligo(ACG)3、oligo T9、oligo A7C4、oligo(A5T)和 oligo(ACGT)2 等 11 种寡 核苷酸进行15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、甲醇固定和SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色。
[0032] 具体过程按下述操作：
[0033] 1、寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0034] (1)准备样品：
[0035] 将寡核苷酸配制成100 μ Μ的溶液，然后在微量紫外分光光度计上测定其实际浓 度；
[0036] 甲酰胺加样缓冲液：960μ 1 甲酰胺，40μ 1250mmol/LEDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v) 溴酚蓝；
[0037] (2)制作变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶浓度为15% (w/v)，凝胶中丙烯酰胺与甲叉双 丙烯酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为7M，凝胶的大小为10X 10cm，厚度为0. 3mm，凝胶 和电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0. 5XTBE ;
[0038] (3)变性处理：将1 μ g的寡核苷酸与2 μ 1加样缓冲液混勻，于95°C变性30秒，迅 速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构；
[0039] (4)电泳：将上述已变性的寡核苷酸加样于15% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶上 进行电泳，电压为200V,电泳时间为1小时，电泳温度为25°C。
[0040] 2、甲醇固定液固定凝胶
[0041] 电泳结束后将其中一份凝胶浸入甲醇固定液中，25°C浸泡1. 5小时，甲醇固定液 为含有10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量为50ml/胶。凝胶被 固定后，用去离子水（200ml/胶）漂洗3次，每次3分钟。
[0042] 3、用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 对凝胶进行染色
[0043] 将 2 μ 1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 加入 10ml 去离子水中，混勻后将 甲醇固定后的凝胶充分浸入其中，不留气泡，常温下浸泡50分钟。
[0044] 4、结果：所有的受检寡核苷酸均被检出（如图1所示）。在图1中，第1和第13 泳道为 DNAmarkerl(GeneRuler? Ultra low Range DNA ladder, Fermentas,购自上海生 工）；第 2-12 泳道依次为 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、 oligo(CG3)2、oligo(ACG)3、oligo T9、oligo A7C4、oligo(A5T)和 oligo(ACGT)2。
[0045] 实验 2 :对 oligo C8、oligo C7、oligo C6、oligo C5、oligo T7、oligo T6 和 oligo 丁5等7种寡核苷酸进行40%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SYBR Green II RNA gel stain染 色。
[0046] 具体过程按下述操作：
[0047] 1、寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0048] (1)准备样品：
[0049] 将寡核苷酸配制成100 μ Μ的溶液，然后在微量紫外分光光度计上测定其实际浓 度；
[0050] 甲酰胺加样缓冲液：960μ 1 甲酰胺，40μ 1250mmol/LEDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v) 溴酚蓝；
[0051] (2)制作变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶浓度为40% (w/v)，凝胶中丙烯酰胺与甲叉双 丙烯酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为6M，凝胶的大小为10X 10cm，厚度为0. 3mm，凝胶 和电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0. 5XTBE ;
[0052] (3)变性处理：将1 μ g的寡核苷酸与2 μ 1加样缓冲液混勻，于95°C变性60秒，迅 速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构；
[0053] (4)电泳：将上述已变性的寡核苷酸加样于40% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶上 进行电泳，电压为600V，电泳时间为3. 5小时，电泳温度为25°C。
[0054] 2、甲醇固定液固定凝胶
[0055] 电泳结束后将其中一份凝胶浸入甲醇固定液中，25°C浸泡1. 5小时，甲醇固定液 为含有10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量为50ml/胶。凝胶被 固定后，用去离子水（200ml/胶）漂洗3次，每次3分钟。
[0056] 3、用 SYBR Green II RNA gel stain 对凝胶进行染色
[0057] 将 1 μ 1 10000X 的 SYBR Green II RNA gel stain 加入 10ml 去离子水中，混匀后 将甲醇固定后的凝胶充分浸入其中，不留气泡，常温下浸泡30分钟。
[0058] 4、结果：尽管oligo C5和oligo T5的电泳带很弱，但所有的寡核苷酸电泳带均能 看到，如图 2 所示，第 1-7 泳道为依次为 oligo C5、oligo C7、oligo C6、oligo C8、oligo Τ5、 oligo T6和 oligo T7〇
[0059] 实施例2染色灵敏度实验
[0060] 实施例1的染色结果表明本发明能够检出5-11碱基长度的寡核苷酸，现以寡核 苷酸oligo An作为标样对本发明方法的灵敏度做进一步检测：实验分成实验组和对照组。 实验组 oligo An 的上样量依次为 0· 01、0· 02、0· 04、0· 06、0· 08、0· 1、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8 和 1 μ g ;对照组oligo An的上样量依次为为2 μ g、4 μ g、6 μ g、8 μ g和10 μ g。变性聚丙烯酰 胺凝胶的浓度为15%，电压为200V，25°C，电泳1小时。电泳结束后，实验组先用甲醇固定 液将寡核苷酸固定，再用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye进行染色，而对照组则不用 甲醇固定，直接进行 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 染色。
[0061] 实验组的检测结果如图3中A所示，对照组的检测结果如图3中B所示。在A中， 第 1 泳道为 DNA markerl(GeneRuler? Ultra low Range DNA ladder, Fermentas,购自上 海生工）；第 2-12 泳道的 oligo 的上样量依次为 0· 01、0· 02、0· 04、0· 06、0· 08、0· 1、0· 2、 0. 4、0. 6、0. 8和lyg，另外，第11泳道还加入了 DNA marker 1。在图Β中，第1泳道为DNA marker 1 ;第2-6泳道的oligo 的上样量依次为2、4、6、8和10 μ g，未发现oligon的电 泳带。
[0062] 从图中可以看出，实验组能检出的最小上样量为0. 04μ g/孔，而对照组即使上样 量已经高达10 μ g/孔，仍不能检出。
[〇〇63] 本实施例的实验表明采用本发明的检测方法对短链寡核苷酸具有很高的灵敏度， 经甲醇固定后，可以提高SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色对寡核苷酸的灵敏度 200 倍（10/0. 04)以上。
【权利要求】
1. 短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于包括如下步骤：首先对寡核苷酸 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，再用 去离子水进行漂洗，然后用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和 SYBR Green II RNA gel stain两种花青素类核酸染料中的一种进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观 察结果。
2. 根据权利要求1所述的短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述对 寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为： (1) 准备样品：将寡核苷酸配制成ΙΟΟμΜ的溶液，然后在微量紫外分光光度计上 测定其实际浓度；配制甲酰胺加样缓冲液，其配方为：960μ 1甲酰胺，40μ 1 250mmol/L EDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v)溴酚蓝； (2) 制作浓度为15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯 酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为4-7M，凝胶的大小为10X 10cm，厚度为0. 3_ ;凝胶和 电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0. 5XTBE ; (3) 变性处理：将1 μ g的寡核苷酸与2-3 μ 1甲酰胺加样缓冲液混勻，于95°C变性 30-60秒，迅速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构； (4) 电泳：将上述已变性的寡核苷酸加样于15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶上进 行电泳，电压为200-600V，电泳时间为1-4. 5小时，电泳温度为20-30°C。
3. 根据权利要求2所述的短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述将 寡核苷酸固定是指将凝胶浸入甲醇固定液中，4-30°C浸泡1. 5-2小时，甲醇固定液为含有 10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液，其用量为50ml/胶。
4. 根据权利要求3所述的短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色是指将2μ1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye加入10ml去离子水中，混匀后将凝胶充分浸入其中，不留气泡，常温下浸泡30-60分钟。
5. 根据权利要求3所述的短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述用 SYBR Green II RNA gel stain染色是指将1 μ 1 10000X的SYBR Green II RNA gel stain 加入l〇ml去离子水中，混匀后将凝胶充分浸入其中，不留气泡，常温下浸泡30分钟。
【文档编号】G01N1/30GK104101528SQ201410307331
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】李卫, 张小龙 申请人:广西医科大学