一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分指纹图谱的检测方法，包括主要步骤为：供试品溶液及对照品溶液的制备、测定，并获得供试品溶液和对照品溶液的液相色谱图进行比较后，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。本发明可以对蟾酥中2种主要的吲哚类生物碱成分同时进行有效的定性和定量分析，方法简便、可行、准确，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好，能够有效地控制蟾酥质量，并为蟾酥的临床用药提供参考。
【专利说明】一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药成分分析检测【技术领域】，具体涉及一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法。
【背景技术】
[0002]2010版《中国药典(一部)》收载蟾酥作为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufogar gar i z an s Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥后制得的药材。其性状呈扁圆形团块状或片状，团块状者质坚，不易折断，断面呈棕褐色，角质状，微有光泽；片状者质脆，易碎，断面红棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，开窍醒神的功效，主治痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，腹痛吐泻等疾病，具有非常良好的疗效。
[0003]蟾酥中化学成分复杂，主要成分有蟾蜍留二烯类、强心留烯蟾毒类、吲哚碱类、甾醇类以及肾上腺素、多糖、蛋白质、氨基酸和有机酸等。其中，吲哚碱类成分，也称为吲哚类生物碱成分，是蟾酥中非常重要的一类化学成分，具有非常好的提高机体免疫力，并具有一定的抗肿瘤能力。目前，蟾酥中所含的吲哚碱类成分主要有5-羟色胺和5-羟色胺衍生物，其中5-羟色胺和蟾毒色胺作为蟾酥中所含的吲哚类生物碱中两种重要组成成分，非常需要进行定性定量分析。
[0004]目前，对于蟾酥中吲哚类生物碱成分，《中国药典》仅通过对二甲氨基苯甲醛显色法进行鉴别，现有技术未收载同时检测5-羟色胺和蟾毒色胺的定量方法及其相关条件。因此，有必要采用优化的前处理及检测条件，建立蟾酥中吲哚类生物碱成分:5_羟色胺和蟾毒色胺的的测定方法，此方法弥补了生物碱类成分依靠显色反应鉴别的专属性不足的缺点，可更全面、有效的控制蟾酥的质量。
【发明内容】
[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，采用优化条件的前处理和检测方法对2种吲哚类生物碱成分:5_羟色胺和蟾毒色胺的同时进行定性定量分析，进而反映蟾酥药材的内在质量，为蟾酥药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。
[0006]为实现上述目的，本发明首先提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，包括以下步骤:
[0007]较佳的，所述蟾酥药材中吲哚类生物碱成分为5-羟色胺和蟾毒色胺。
[0008]I)供试品溶液的制备:将蟾酥细粉加入乙醇水溶液，超声提取后，冷却、摇匀；离心，吸取上清液加热蒸干，加入溶剂溶解并定容，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液；
[0009]较佳的，所述乙醇水溶液为50%乙醇水溶液。具体的，所述50%乙醇水溶液为体积百分数为50%的乙醇。
[0010]进一步的，加入的50%乙醇水溶液为蟾酥细粉的100-800倍量。优选的，所述加入的50%乙醇水溶液为蟾酥细粉的200倍量。
[0011]具体的，所述加入的50%乙醇水溶液为蟾酥细粉的100-800倍量是指，每0.1g的蟾酥细粉中加入50%乙醇水溶液1-SOml。优选的，当所述蟾酥细粉的重量为0.1g时，所述50%乙醇水溶液的加入量为20ml。
[0012]较佳的，所述蟾酥细粉加入乙醇水溶液后，需精密称重。
[0013]较佳的，所述超声提取、冷却后，需再称重，并用50%乙醇水溶液补足失重。
[0014]较佳的，所述超声提取时间为20-60min。优选的，所述超声提取时间为20min。
[0015]较佳的,所述离心时间为20min ;所述离心转速为4000rpm。
[0016]较佳的，所述吸取上清液加热蒸干是指:将精密吸取的一定体积的上清液置于蒸发皿中，放入恒温水浴中加热、蒸至近干。进一步的，所述吸取上清液的体积为3ml。
[0017]较佳的，所述溶解并定容时使用的溶剂为20%乙醇水溶液。具体的，所述20%乙醇水溶液为体积百分数为20%的乙醇。进一步的，所述加入20%乙醇水溶液的定容体积为1ml0
[0018]较佳的，所述滤膜为0.45 μ m滤膜。
[0019]所述续滤液是指:过滤膜时，初滤液后的溶液即为续滤液。 [0020]2)对照品溶液的制备:将5-羟色胺和蟾毒色胺对照品加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；
[0021]较佳的，所述对照品溶液中5-羟色胺的CAS号为50-67-9 ;蟾毒色胺的CAS号为487-93-4。
[0022]较佳的，所述对照品溶液中各成分的含量范围为:5_羟色胺120.0-1800.(^8/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
[0023]优选的，所述对照品溶液中各成分的含量范围为:5_羟色胺120.0 μ g/ml、蟾毒色胺 14.4 μ g/ml ο
[0024]较佳的，所述溶解并定容时使用的溶剂为20%乙醇水溶液。具体的，所述20%乙醇水溶液为体积百分数为20%的乙醇。
[0025]3)定性检测:采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；
[0026]4)定量检测:采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。
[0027]较佳的,所述高效液相色谱法的色谱条件为:色谱柱:Alltima C18(250mmX4.6mm,5 μ m)色谱柱；柱温:25-35 °C，优选25 V ;检测波长:275nm ;流速:0.7-0.8ml/min,优选0.7ml/min ;进样量:10 μ I ;流动相:乙腈_0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，其中，A相为乙腈，B相为0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液；分析时间:25min;等度洗脱。
[0028]进一步的，所述等度洗脱在0_25min，以流动相A相:B相体积比为5:95进行洗脱。
[0029]进一步的，所述0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液为重量百分数为0.5%的磷酸二氢钾缓冲水溶液。
[0030]较佳的，所述外标法是指:分别移取一系列不同体积的步骤B)所述混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得混合对照品溶液中吲哚类生物碱2种主要活性成分含量与峰面积的线性关系，以每一种活性成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应吲哚类生物碱成分的含量。
[0031]优选的，所述混合对照品溶液的移取体积为1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10μ 1、15μ I。
[0032]如上所述，本发明的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，针对吲哚类生物碱极性较大，在一般色谱柱上几乎无保留且分离度差的特点，经过对色谱柱筛选以及流动相系统、样品制备、分析等条件的优化考察，采用优化反应条件的前处理和高效液相分析方法建立了蟾酥中2种吲哚类生物碱成分的同时、简单、准确的定量定性检测方法。其中，本发明采用流动相:乙腈一0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，无需复杂的梯度洗脱程序，在简单的等度洗脱条件下就能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形，进行同步测定。本发明通过对吲哚类生物碱2种成分的定量分析，定量分析结果中2种成分的回归方程的相关系数R2均大于0.9997，回收率均大于99%，RSD均小于2.0%,测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的定性定量分析方法同步、简便、可行、准确，能够有效地控制蟾酥质量，并为蟾酥的临床用药提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1显示为本发明的不同提取方法比较液相色谱图1A、1B、1C
[0034]图2显示为本发明的不同缓冲盐浓度比较液相色谱图2A、2B、2C [0035]图3显示为本发明的不同缓冲液pH值比较液相色谱图3A、3B、3C
[0036]图4显示为本发明的不同色谱柱比较液相色谱图4A、4B、4C
[0037]图5显示为本发明的不同流速、柱温比较液相色谱图5A、5B、5C
[0038]图6显示为本发明的吲哚类生物碱中2种成分的对照品液相色谱图，其中，1:5-羟色胺、I1:蟾毒色胺
[0039]图7显示为本发明的吲哚类生物碱中2种成分的混合样品液相色谱图，其中，1:5-羟色胺、I1:蟾毒色胺
[0040]图8显示为本发明的吲哚类生物碱中5-羟色胺的回归方程和线性范围示意图
[0041]图9显示为本发明的吲哚类生物碱中蟾毒色胺的回归方程和线性范围示意图
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0043]以下实施例使用的材料、试剂和仪器如下:
[0044]1、材料、试剂
[0045]蟾酥(上海华宇药业有限公司);乙醇(分析纯，上海豪申化学试剂有限公司);磷酸(色谱级，TEDIA公司)；磷酸二氢钾(优级纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，TEDIA公司)；5_羟色胺、蟾毒色胺(HPLC纯度≥98%、批号20130630，上海克里克生物医药科技有限公司)；
[0046]2、仪器[0047]具塞锥形瓶、移液管及其相关玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；50ml圆底蒸发皿(上海喜泊达玻璃仪器有限公司)；HSS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；滤膜(0.45 μ m，上海安谱科学仪器有限公司)；TDL-40型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；色谱柱:Nucleosil C18(德国MACHEREY — NAGEL公司)、AllitmaC18 (25OmmX 4.6mm, 5 μ m)(美国 GRACE 公司)、Waters Symmetry C18 (美国沃特世科技有限公司);SB-5200超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);Agilentl260液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。
[0048]实施例1蟾酥药材中2种吲哚类生物碱成分的测定
[0049]I实验部分
[0050]1.1样品前处理
[0051]供试品溶液的制备:精密称定0.1g的蟾酥细粉，精密加入50%乙醇水溶液，称定重量，超声提取，冷却后，再称定重量，用50%乙醇水溶液补足失重，摇匀。采用离心机离心，离心时间为20min、离心转速为4000rpm。再精密吸取3ml的上清液置于蒸发皿中加热、蒸至近干。加入20%乙醇水溶液溶解并定容至10ml，过0.45 μ m滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0052]对照品溶液的制备:分别精密称取5-羟色胺和蟾毒色胺对照品适量，加20%乙醇水溶液溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；其中，各成分的含量范围为:5_羟色胺120.0-1800.0 μ g/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
[0053]1.2色谱条件
[0054]高效液相色谱法的色谱条件为:色谱柱:Alltima C18 (250mmX 4.6mm, 5 μ m)色谱柱；柱温:25-35°C，优选 25V ;检测波长:275nm ;流速:0.7-0.8ml/min，优选 0.7ml/min ;进样量:10μ I ;流动相:乙腈-0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，其中，A相为乙腈，B相为0.5%磷酸二氢钾缓冲溶液；分析时间:25min ;等度洗脱。
[0055]等度洗脱在0-25min，以流动相A相:B相体积比为5:95进行洗脱。
[0056]1.3 测定
[0057]采用外标法,分别吸取体积为1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10 μ 1、15 μ I的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，绘制标准曲线。再吸取体积为10μ I的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析。将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；根据色谱峰面积，计算获得供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。
[0058]2结果与讨论
[0059]2.1前处理条件的优化
[0060]2.1.1提取方法的选择
[0061]分别比较了热回流、超声和冷浸提取法，其中，采用热回流提取方法提取I小时；采用超声提取方法超声20min ;采用冷浸提取法冷浸过夜提取。蟾酥药材在不同提取方法下采用相同的HPLC检测条件测定结果见图1、表I。
[0062]表I三种提取方法对2种成分的色谱峰面积的影响结果
[0063]
【权利要求】
1.一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，包括以下步骤: 1)供试品溶液的制备:将蟾酥细粉加入乙醇水溶液，超声提取后，冷却、摇匀；离心，吸取上清液加热蒸干，加入溶剂溶解并定容，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液； 2)对照品溶液的制备:将5-羟色胺和蟾毒色胺对照品加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液； 3)定性检测:采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分； 4)定量检测:采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。
2.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述加入的乙醇水溶液为50%乙醇水溶液，为蟾酥细粉的100-800倍量；所述超声提取时间为20-60min。
3.根据权利要求2所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述加入的50%乙醇为蟾酥细粉的200倍量；所述超声提取时间为20mino
4.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述离心时间为20min ;所述离心转速为4000rpm。
5.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述蟾酥细粉加入乙醇水溶液后，需精密称重；所述超声提取、冷却后，需再称重，并用50%乙醇水溶液补足失重。
6.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述对照品溶液中各成分的含量范围为:5_羟色胺120.0-1800.0yg/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
7.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤I)或2)中，所述溶解并定容时使用的溶剂为20%乙醇水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为:色谱柱=Alltima C18色谱柱；柱温:25_35°C ;检测波长:275nm;流速:0.7-0.8ml/min ;进样量:10μ I ;流动相:乙腈-0.5 %磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸调缓冲溶液PH至3.2，其中，A相为乙腈，B相为0.5%磷酸二氢钾水溶液；分析时间:25min ;等度洗脱。
9.根据权利要求8所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述等度洗脱在0-25min，以流动相A相:B相体积比为5:95进行洗脱。
【文档编号】G01N30/02GK104034823SQ201410307184
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】顾佳敏, 姜鹏, 陈忠樑, 詹常森, 向阳, 朱佳娴, 许雯雯 申请人:上海和黄药业有限公司, 菏泽和黄生物资源技术有限公司