用于检测25-羟基维生素d的检测剂及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测羟基维生素D的检测剂及其制备方法，以及其在25-羟基维生素D免疫学检测中的应用。该检测剂包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物，以及被所述偶联物包被的磁球。通过对25-羟基维生素D抗原衍生物进行上述修饰，所产生的检测剂的稳定性得到明显改善，对25-羟基维生素D检测的特异性和准确性也得到提高。本发明进一步提供包含所述检测剂的25-羟基维生素D检测试剂盒，其稳定性好、准确度高、通用性强。
【专利说明】用于检测25-羟基维生素D的检测剂及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物免疫学检测领域，具体涉及一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]维生素D是一种脂溶性维生素。人体中的维生素D仅有小部分来源于食物(< 10%),体内所需的维生素D的90%来源于阳光中紫外线照射皮肤产生。维生素D在体内出现的主要形式是维生素D2 (麦角钙化醇)和维生素D3 (胆钙化醇)。维生素D2的营养来源主要是一些蔬菜、酵母和真菌类食物，维生素D3是由皮下的7-脱氢胆固醇在阳光的作用下转化而成。
[0003]食物源和自身合成的维生素D2和维生素D3经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶作用下分别转化为25-0H维生素D2和25-0H维生素D3，总称为25-0H维生素D。血清或血浆中25-0H维生素D的含量能反映事物摄入和自身合成的维生素D总量，因此25-0H维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标。
[0004]25-羟基维生素D是人体内存储维生素D的主要形式，是人体内代谢活动不可缺少的营养物质。除了具有传统意义上的骨骼效应，还具有影响自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、肿瘤等非骨骼效应。研究发现，维生素D缺乏会直接影响人类基因的表达，这些基因与风湿性关节炎和糖尿病等众多疾病有关。
[0005]目前，临床上对维生素D的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。建立一种快速，简便，灵敏，准确可靠的检测维生素D水平的方法尤为重要。25-羟基维生素D的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，由于存在仪器昂贵、样本前处理复杂、过程繁琐费时等缺陷，该方法的应用受到限制。免疫学方法具有灵敏、快速、特异和简便等优势，现在成为维生素D测定的主流方法。在目前的市场上，用于测定25-羟基维生素D的主流产品是意大利Diasorin公司生产的检测试剂盒，检测方法是采用标记ABEI (N- (4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺)的25-羟基维生素D抗原衍生物和样本中的抗原与包被于磁性微球上的25-羟基维生素D抗体竞争结合，然后加入激发底物产生发光信号，从而实现25-羟基维生素D的定量检测，图1更形象地展示了其操作原理(具体操作步骤及实验条件可参考其DiaSorin-VD说明书)。在检测过程中，标记ABEI的25-羟基维生素D抗原衍生物的稳定性是影响检测稳定性的最主要的因素，而25-羟基维生素D抗原衍生物是一种稳定性差，遇光、遇热等都会导致活性下降的物质，因此上述检测试剂盒中的试剂稳定性差，活性易下降。
[0006]因此，免疫学竞争法测定所采用的25-羟基维生素D抗原衍生物的不稳定性导致了 25-羟基维生素D免疫学方法测定试剂不能长期稳定地保存，从而影响其使用和检测结果，且保存条件苛刻，不方便储存和运输，这成为目前此类方法大规模商品化应用的瓶颈。
【发明内容】
[0007]针对以上缺陷，本发明提供一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其是将25-羟基维生素D抗原衍生物偶联至载体蛋白后固定到磁性微球上，通过固定至磁性微球使得抗原衍生物的稳定性得到显著提高，同时该衍生物的特定结构使得25-羟基维生素D的测定更加准确。
[0008]本发明还提供了上述用于检测25-羟基维生素D的检测剂的制备方法以及采用上述检测剂对25-羟基维生素D进行免疫学检测的方法，还提供了包含所述25-羟基维生素D检测剂的试剂盒。
[0009]根据本发明，提供了一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物，以及被所述偶联物包被的磁球。
[0010]在现有技术中，用于检测25-羟基维生素D的25-羟基维生素D抗原衍生物被发光标记物标记，而25-羟基维生素D抗体则包被磁球，其作用原理如图1所示。然而，该产品存在稳定性较差的缺点。因为25-羟基维生素D抗原衍生物具有光敏性，且容易被氧化，用发光标记物标记25-羟基维生素D抗原衍生物的过程中容易造成其部分失活，而且发光标记物标记的25-羟基维生素D抗原衍生物在溶液中的长期稳定性不好，容易造成活性下降。因此，用于检测25-羟基维生素D的这类检测剂的保存条件较为苛刻，稳定性较差，从而造成使用期限较短、使用效果较差。
[0011]本发明将25-羟基维生素D抗原衍生物包被在固相载体磁球上，一方面减少了25-羟基维生素D抗原衍生物分子的自由度，另一方面磁球的颜色屏蔽了部分光照对25-羟基维生素D抗原衍生物分子的影响，因此大大增强了 25-羟基维生素D抗原衍生物在溶液中的稳定性，从而可以延长其有效使用期限以及提高测定结果的准确性。
[0012]在本发明中，用于制备所述检测剂的25-羟基维生素D抗原衍生物可以是本领域中常用的，例如在美国专利申请US20130059825A1中所描述的25-羟基维生素D抗原衍生物，该专利申请的内容通过引用而并入本文中。
[0013]在一些具体实施方案中，25-羟基维生素D抗原衍生物具有如下结构式(I):
[0014]
【权利要求】
1.一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物，以及被所述偶联物包被的磁球。
2.根据权利要求1所述的检测剂，其特征在于，所述25-羟基维生素D抗原衍生物的结构式为:
其中，m 为 0、1、2 或 3，η 为 2、3、4、5 或 6。
3.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述蛋白载体选自牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛Y球蛋白和人Y球蛋白中的任一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述磁球表面带有环氧基、磺酰基、羧基、氨基、醛基、酰胺基、巯基和羟基中的一种或多种基团。
5.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述磁球的粒径大小为0.8-3.0 μ mD
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的用于检测25-羟基维生素D的检测剂的制备方法，包括使用所述25-羟基维生素D抗原衍生物和蛋白载体形成的偶联物包被磁球。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在包被磁球之前，使用第一活化剂将磁球进行活化处理，并将经所述活化处理后的磁球分散于缓冲液中，并加入25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物进行反应，经固液分离，清洗固体，得到所述检测剂； 其中，所述第一活化剂为N，N-二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的至少一种或其与N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐中的至少一种的混合物。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物的制备步骤，所述制备步骤包括使所述25-羟基维生素D抗原衍生物和所述蛋白载体在偶联剂和溶剂的存在下进行偶联反应生成所述偶联物； 其中，所述偶联剂选自戊二醛、N, N’ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯中的至少一种；和/或所述溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、氯仿中的至少一种。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物的制备步骤，所述制备步骤包括: m)使25-羟基维生素D抗原衍生物带有羧基，并使用第二活化剂进行活化； η)将活化后的25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体在溶剂的存在下进行偶联，经分离得到所述偶联物； 其中，所述第二活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐中的至少一种和N，N- 二环己基碳二亚胺、1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的至少一种的混合物；和/或所述溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、氯仿中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体的摩尔比为10-20:1。
11.一种用于检测25-羟基维生素D的免疫学方法，包括使结合标记物的25-羟基维生素D抗体和如权利要求1-5中任一项所述的检测剂与待测样本中的25-羟基维生素D竞争结合 ?
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述标记物选自荧光标记物、发光标记物、生物素标记物、金标记物或酶标记物。
13.一种用于检测25-羟基维生素D的发光免疫学方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: a)将待测样本与发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体进行温育； b)向步骤a)的混合物中加入如权利要求1-5中任一项所述的检测剂，使所述发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体与所述检测剂和待测样本中的25-羟基维生素D竞争结合； c)磁分离，得到发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体与所述检测剂的结合物； d)向步骤c)得到的结合物中加入激发底物，使其产生发光信号； e)根据步骤d)测定的发光信号强度计算待测样本中的25-羟基维生素D含量。
14.一种25-羟基维生素D免疫学检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括结合标记物的25-羟基维生素D抗体，以及如权利要求1-5中的任一项所述的用于检测25-羟基维生素D的检测剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物选自荧光标记物、发光标记物、生物素标记物、金标记物或酶标记物。
【文档编号】G01N33/82GK104076155SQ201410328010
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】饶微, 李婷华, 杜凯, 袁锦云, 罗凯, 余慧玲 申请人:深圳市新产业生物医学工程股份有限公司