一种食用香精香料中七种成分同时测定的方法
【专利摘要】本发明公开了一种食用香精香料中七种成分同时测定的方法，包括以下步骤：萃取溶液的配制、标准溶液的配制、样品溶液的制备、超高效液相色谱-串联质谱分析以及含量的计算。本发明通过对食用香精香料中七种成分测定方法的前处理条件、液相色谱条件和质谱条件的优化，建立了一种简便、快速、高通量的测定方法，本发明具有操作简单、灵敏度高、回收率好、重现性好且检测时间短、溶剂消耗小、检测通量高、检测效率高的优点。
【专利说明】一种食用香精香料中七种成分同时测定的方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明属于理化检验【技术领域】，具体涉及一种食用香精香料中七种成分水杨酸、 环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯同时测定的方法。
【背景技术】
[0003] 水杨酸又名邻羟基苯甲酸，是重要的精细化工原料，在医药工业中，水杨酸是一种 用途极广泛的消毒、防腐剂，许多国家都将水杨酸列为限用添加剂，在我国水杨酸禁止用于 食品加工生产，我国国标GB 7916-1987规定其最高允许用量质量分数为0.15%。水杨酸为 有机酸类防腐剂，在酸性条件下具有较强的抗真菌性质，毒理学试验研究表明，防腐剂成分 用量过多会对人体肝脏产生危害，甚至致癌。美国食品药品管理局、美国皮肤病学会认为水 杨酸的安全限量为〇· 5%-2· 0%。目前已报道测定水杨酸的检测方法有光度法、气相色谱法、 液相色谱法等。
[0004] 苯甲酸是食品工业中常用的防腐剂，能有效防止酵母、霉菌、细菌的生长，但过量、 长期食用会危害人体肝脏、肾脏功能。国家标准GB2760 - 2007中明确规定了苯甲酸的最 大使用限量。在进出口贸易中，日本等国要求这种物质的检出量小于lmg/kg，而我国标准 GB/T 23495-2009中苯甲酸为1.8mg/kg，GB/T 5009.29-2003中苯甲酸的检出限均为lmg/ kg。目前已报道测定苯甲酸的检测方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等。
[0005] 对羟基苯甲酸酯(又称尼泊金酯)，因其良好的杀菌能力和稳定性，被广泛应用于 食品、饮料、化妆品等诸多领域，主要作为防腐剂。尼泊金酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等， 其抑菌作用随着醇烃基碳原子数的增加而增加，且碳链愈长，毒性愈小，用量愈少。生产过 程中，通常是将几种酯混合使用，在提高溶解度的同时具有更好的防腐性能。国内外大量的 实际应用也证实了混用的尼泊金酯比单一的抑菌效果强。尼泊金酯虽有良好的防腐作用， 但也有一定的毒性。中国、加拿大、日本和欧盟等许多国家和国际组织对食品中对羟基苯甲 酸酯类防腐剂的使用制定了添加限量。Routledge等首次发现对羟基苯甲酸酯具有雌激素 活性，且其过量使用会危害人体健康。中国食品添加剂的使用标准GB 2760-2011规定了单 一品种和混合使用的最大使用量，其中对羟基苯甲酸丙酯被明确禁止使用，对羟基苯甲酸 丁酯也未被列入允许使用名单。尼泊金酯的测定方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、 气相色谱法、气相色谱-质谱法等。
[0006] 甜蜜素，化学名为环己基氨基磺酸钠，是一种低热量人工合成甜味剂，是食品生产 中常用的人工合成非营养型甜味剂，其甜度是蔗糖30-40倍，使用成本低，因此在饮料、糕 点、蜜饯等食品中广泛添加。近年来，食品中甜蜜素含量超标及在禁止添加甜蜜素的食品中 添加甜蜜素的报道日渐增多，因此，甜蜜素过量食用，就会因摄入过量对人体的肝脏和神经 系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。甜蜜素的测 定方法主要有气相色谱/质谱法、离子色谱法、液相色谱-串联质谱法等。
[0007] 目前，国内外公开文献无关于这七种成分同时检测的方法。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种食用香精香料中七种成分水杨酸、环己基氨基磺酸 钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯同时测定的方法。
[0010] 本发明针对现有技术的不足，通过长期的研究和探索，在方法对比、优化的基础上 提出了一种食用香精香料中七种成分(水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸 甲酯、乙酯、丙酯、丁酯）同时测定的方法，用于检测食用香精香料中的水杨酸、环己基氨基 磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯。本发明考察研究了食用香精香料中 水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的前处理条件、液 相色谱条件和质谱条件，为简便、快速、高通量的测定食用香精香料中的七种成分提供了技 术支持。
[0011] 本发明的技术方案为：所述的测定方法包括以下步骤： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制备成体积比7:3的甲醇-水溶液即为萃取溶液； B、 标准溶液的配制：用含内标的萃取溶液分别配制水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲 酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的标准溶液； C、 样品溶液的制备：使用含内标的萃取溶液萃取食用香精香料样品，过有机相滤膜后 得到样品溶液； D、 超高效液相色谱-串联质谱仪分析：利用超高效液相色谱-串联质谱仪分别对标准 溶液和样品溶液进行检测分析； E、 食用香精香料中七种成分水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的计算。
[0012] B步骤中所述标准溶液的配制是：分别称取水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、 对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯各20mg，用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶中，定 容至刻度，分别得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 10mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕 色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液0. 5~2mL至50mL棕 色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液lmL至50mL棕色 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取0. lmL、0. 5mL、lmL、 2mL、5mL的一级混合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入lmL -级内标 标准溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。
[0013] 取〇· 4mL内标储备液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含内标的 萃取溶液。所述含内标的萃取溶液中的内标物为水杨酸-d4。
[0014] C步骤中所述样品溶液的制备方法是：称取0· 5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准 确加入25mL含内标的萃取溶液，用I50r/min振荡萃取2〇min，取上清液过有机相滤膜，滤 液为样品溶液。所述的有机相滤膜为0.22 μ m聚醚砜滤膜。所述振荡萃取的振荡频率为 120-180r/min，萃取时间为 l〇-3〇min。
[0015] D步骤中所述的色谱分析条件为：色谱柱：C18，1_ 7 μ m，2· IX 100mm柱；流动相为 甲醇A和0· 05%甲酸水溶液B ;流速：〇. 4mL/min ;进样量：5μ L ;柱温：40°C;样品温度：10°C; 采用梯度洗脱程序，即初始A是10%, B是90%，lmin时A是35%，B是65%，4min时A是65%， B 是 35%，6min 时初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 时 A 是 90%，B 是 10%，8min 时 A 是 10%，B 是 90%，lOmin时A是10%, B是90%。所述的质谱条件为：电喷雾离子源（ESI)负离子模式，扫 描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为-4500V，离子源温度600°C，气帘气：25Psi ;雾化 气：55Psi ;辅助加热气：50Psi ;水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙 酯、丙酯、丁酯和水杨酸_d4的定量离子对分别为：m/z 92. 9、79· 9、77· 0、92· 0、91· 9、92· 0、 92. 1、96. 9。其它质谱参数见表1。
[0016] E步骤中所述含量的计算是：首先以标准溶液所检测出的目标物和内标物的色谱 峰面积比对应其相应浓度比进行回归分析得到标准曲线线性方程，然后将样品溶液检出的 目标物的色谱峰面积，代入标准曲线线性方程，即得到样品中水杨酸、环己基氨基磺酸钠、 苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的含量。
[0017] 本发明针对现有技术的不足，通过对食用香精香料中水杨酸、环己基氨基磺酸钠、 苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的前处理条件、色谱条件和质谱条件的优化， 建立了一种简便、快速、高通量的测定方法，为食用香精香料中的七种成分的检测提供了技 术支持。本发明具有操作简单、灵敏度高、回收率好、重现性好且检测时间短、溶剂消耗小、 检测通量高、检测效率高的优点，对于监督食用香精香料的质量安全具有非常重要的意义。
[0018]
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明的测定方法的流程图。
[0020] 图2为水杨酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0021]图3为环己基氨基磺酸钠的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0022] 图4为苯甲酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0023]图5为对羟基苯甲酸甲酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0024]图6为对羟基苯甲酸乙酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0025]图7为对羟基苯甲酸丙酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0026]图8为对羟基苯甲酸丁酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图。
[0027]图9为标准溶液中水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、 丙酯、丁酯的色谱图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0029] 实施例丄： 本发明所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，包括以下步骤： (1) 卒取溶液的配制：取甲醇制备成体积比7:3的甲醇-水溶液即为萃取溶液； (2) 标准溶液的配制：用含内标的萃取溶液分别配制水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲 酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的标准溶液； (3) 样品溶液的制备：使用含内标的萃取溶液萃取食用香精香料样品，过有机相滤膜后 得到样品溶液； (4) 超高效液相色谱-串联质谱仪分析：利用超高效液相色谱-串联质谱仪分别对标 准溶液和样品溶液进行检测分析； (5) 食用香精香料中七种成分水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的计算。
[0030] B步骤中所述标准溶液的配制是：分别称取水杨酸、环己基氨基磺酸钠 、苯甲酸、 对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯各2〇mg,用甲醇溶解后转移至1 〇〇mL棕色容量瓶中，定 容至刻度，分别得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 l〇mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕 色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液0. 5?2mL至50mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液lmL至50mL棕 色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取0. lmL、0. 5mL、 lmL、2mL、5mL的一级混合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入lmL -级 内标标准溶液，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。所述分别取单一标准储备液 〇_5mL-2mL具体为分别取水杨酸、环己基氨基磺酸钠 、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯 单一标准储备液〇· 5mL和取苯甲酸单一标准储备液2mL。
[0031] 取〇.4mL内标储备液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含内标的 萃取溶液。所述含内标的萃取溶液中的内标物为水杨酸-d4。
[0032] C步骤中所述样品溶液的制备方法是：称取〇· 5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准确 加入25mL含内标的萃取溶液，用150r/min振荡萃取20min，取上清液过有机相滤膜，滤液为 样品溶液。样品溶液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。
[0033] 所述的有机相滤膜为0. 22 μ m聚醚砜滤膜。D步骤所述的液相色谱分析条件为： 色谱柱：C18,1. 7 μ m, 2. 1 X 100_柱；流动相为甲醇A和0· 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/ min;进样量：5yL;柱温：40°C ;样品温度：10°C ;采用梯度洗脱程序，即初始A是10%，B是 90%，lmin 时 A 是 35%，B 是 65%, 4min 时 A 是 65%，B 是 35%，6min 时初始 A 是 90%，B 是 10%， 7min 时 A 是 90%，B 是 10%, 8min 时 A 是 10%，B 是 90%，lOmin 时 A 是 10%，B 是 90%。所述 的质谱条件为：电喷雾离子源（ESI)负离子模式，扫描方式为多反应监测模式，电喷雾电压 为-4 5〇OV,离子源温度600°C，气帘气：25Psi ;雾化气：55Psi ;辅助加热气：50Psi ;水杨酸、 环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和水杨酸-d4的定量离子 对分别为：m/z 92. 9、79· 9、77· 0、92. 0、91. 9、92· 0、92. 1、96· 9。其它质谱参数见表 1。
[0034]表1食用香精香料中七种成分的质谱参数表 .... 而丽-~棚" ,μμμμμ,-1，- ΜΜ' ΜΙΜ? MmmmK==-mmm mmmm.....^immm.....' mmmmmmmi mrnii_____ "f·1 ~~爾? -丨丨丨… +..-.
【权利要求】
1. 一种食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于包括以下步骤： A、 萃取溶液的配制：取甲醇制备成体积比7:3的甲醇-水溶液即为萃取溶液； B、 标准溶液的配制：用含内标的萃取溶液分别配制水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲 酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的标准溶液； C、 样品溶液的制备：使用含内标的萃取溶液萃取食用香精香料样品，过有机相滤膜后 得到样品溶液； D、 超高效液相色谱-串联质谱仪分析：利用超高效液相色谱-串联质谱仪分别对标准 溶液和样品溶液进行检测分析； E、 食用香精香料中七种成分水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、 乙酯、丙酯、丁酯含量的计算。
2. 根据权利要求1所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于B步骤 中所述标准溶液的配制是：分别称取水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲 酯、乙酯、丙酯、丁酯各20mg，用甲醇溶解后转移至lOOmL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别 得到单一标准储备液；称取水杨酸-d4 10mg，用甲醇溶解后转移至50mL棕色容量瓶中，甲 醇定容至刻度，得到内标储备液；分别取单一标准储备液〇. 5~2mL至50mL棕色容量瓶中，用 甲醇定容至刻度，得到一级混合标准溶液；取内标储备液lmL至50mL棕色容量瓶中，用甲醇 定容至刻度，得到一级内标标准溶液；分别准确移取〇. lmL、0. 5mL、lmL、2mL、5mL的一级混 合标准溶液至50mL棕色容量瓶中，每个棕色容量瓶均加入lmL -级内标标准溶液,用萃取 溶液定容至刻度，得到系列标准溶液。
3. 根据权利要求1所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于取 0.4mL内标储备液至1L棕色容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到含内标的萃取溶液。
4. 根据权利要求1或3所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于所 述含内标的萃取溶液中的内标物为水杨酸-d4。
5. 根据权利要求1所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于C步骤 中所述样品溶液的制备方法是：称取〇. 5g试样于50mL具塞锥形瓶中，准确加入25mL含内 标的萃取溶液，用150r/min振荡萃取20min，取上清液过有机相滤膜，滤液为样品溶液。
6. 根据权利要求1或5所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于所 述的有机相滤膜为〇. 22 μ m聚醚砜滤膜。
7. 根据权利要求1所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于D步骤 中所述的液相色谱分析条件为：色谱柱采用C18,1. 7 μ m，2. 1 X 100mm色谱柱；流动相为甲 醇A和0. 05%甲酸水溶液B ;流速：0. 4mL/min ;进样量：5 μ L ;柱温：40°C ;样品温度：10°C ; 采用梯度洗脱程序，即初始A是10%，B是90%，lmin时A是35%，B是65%，4min时A是65%， B 是 35%，6min 时初始 A 是 90%，B 是 10%，7min 时 A 是 90%，B 是 10%，8min 时 A 是 10%，B 是 90%，lOmin时A是10%，B是90% ;所述的质谱条件为采用电喷雾离子源（ESI)负离子模式，扫 描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为-4500V，离子源温度600°C，气帘气：25Psi，雾化 气：55Psi，辅助加热气：50Psi，水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙 酯、丙酯、丁酯和水杨酸-d4的定量离子对分别为：m/z 92. 9、79. 9、77. 0、92. 0、91. 9、92. 0、 92. 1 λ 96. 9 〇
8. 根据权利要求1所述食用香精香料中七种成分同时测定的方法，其特征在于Ε步骤 中所述含量的计算是：首先以标准溶液所检测出的目标物和内标物的色谱峰面积比对应其 相应浓度比进行回归分析得到标准曲线线性方程，然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰 面积，代入标准曲线线性方程，即得到样品中水杨酸、环己基氨基磺酸钠、苯甲酸、对羟基苯 甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的含量。
【文档编号】G01N30/02GK104297359SQ201410362880
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】王素娟, 缪明明, 秦云华, 张承明, 夏建军, 王岚, 蒋次清, 陈进雄, 罗林 申请人:云南中烟工业有限责任公司