一种血液及尿液中硫化氢的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液及尿液中硫化氢的检测方法，利用血清和尿液中游离H2S、HS-、S2-与过量金属离子和碱溶液使形成硫化物与生成的氢氧化物形成共沉淀，同时使血浆和尿液中蛋白变性析出，与基体分离；用对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液溶解与三氯化铁作用下衍生形成亚甲基蓝，用高效液相色谱进行定量测定，检测限可达0.02μg/mL；方法具有准确度、灵敏度高、简单快速等特点。
【专利说明】一种血液及尿液中硫化氢的检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于体内药物检测【技术领域】，具体涉及一种血液及尿液中硫化氢的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 内源性硫化氢（H2S)是一种新近发现的气体信号分子，对神经、心血管、消化、呼 吸、代谢以及生殖系统的生理功能具有重要的调节意义，而且参与这些系统的许多疾病的 病理生理调节，尤其与心血管系统紧密相连，拓展了 h2s在心血管系统的药理学领域，以h2s 为靶点的治疗具有潜在的临床应用前景。越来越多的证据表明内源性h2s与多种疾病有着 密切的关系，在临床多种疾病中，内源性H 2s的生成和代谢发生了改变，并进一步影响了疾 病的发展过程。一种可靠、准确的血液、尿液中内源性H2S的测定方法对监测体内H 2S含量 及相关疾病的预测及诊断有重要意义。
[0003] H2S检测方法主要包括亚甲基兰分光光度法、硫离子选择电极法、荧光衍生法、气 相色谱法、荧光探针及免疫分析法等。目前现有H 2s检测技术主要集中在大气、水等环境样 品中。其检测灵敏度在lmg/kg，而体内内源性硫化氢（H2S)含量在Mmol级。研究小组之前 已利用分散液液微萃取结合光度法对血液及尿液H 2S检测进行了研究，取得了不错的效果， 申请了发明专利（201410062197. 1)，进一步研究发现，血液及尿液基体的颜色及三氯化铁 对测定还是有一定干扰。本发明利用共沉淀分离替代液液微萃取，高效液相色谱（HPLC)法 替代光度法，一是利用共沉淀分离，由于微量的硫离子与金属离子形成的硫化物如ZnS沉 淀能完全与金属氢氧化物如Zn (0H) 2共沉淀，硫离子与蛋白得到了很好分离，消除了基体 干扰，对硫离子进行了浓缩富集，检测限可达0. 〇2Pg/mL ;二是后续的衍生物直接与液相色 谱检测匹配，减少了操作步骤。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度高、准确性 好，定量检测血液、尿液中硫化氢的方法。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： (1) 硫化氢标准工作曲线的制作：分别取S2^浓度为5μ g/mL的Na2S标准溶液20、40、 60、80、100 μ L，用蒸馈水稀释至5mL，摇勻，加入共沉淀剂，立即润旋混合30s，离心，去除上 清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 2-0. 5%的对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L， 将沉淀充分溶解，再加入质量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin， 用蒸馏水定容至〇. 5mL，摇匀，进高效液相色谱在选定色谱条件进行测定；得到硫化氢回归 方程、相关系数、相对标准偏差、回收率； (2) 样品检测： I、尿液的检测：取5mL尿液，加入共沉淀剂，立即涡旋混合30s，离心，去除上清液，向 沉淀中加入质量体积比浓度为〇. 2-0. 5%的对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L，涡旋混 合30s，离心，取出上清液，向上清液中加入质量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液 50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇匀，进高效液相色谱在选定色谱条件下进行 测定，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含量； II、血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取血清定容至5 mL，加入共沉淀 齐U，立即涡旋混合30s，离心，去除上清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 2-0. 5%的对 氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L，涡旋混合30s，离心，取出上清液，向上清液中加入质 量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇 匀，进高效液相色谱在选定色谱条件下进行测定，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含 量； 其中，步骤（1 )、（2)中所述的对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐 酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的。
[0006] 所述共沉淀剂为无机盐硫酸锌、醋酸锌、醋酸铅、硫酸铝、硫酸镁中的一种与碱 性物质氢氧化钠、氨水、碳酸钠中的一种的组合物，其中无机盐的质量浓度百分比浓度 为50-70%、用量为100-200 μ L ;碱性物质氢氧化钠和碳酸钠的质量百分比浓度为浓度为 2-4mol/L、用量为 100-200 μ L。
[0007] 所述离心时间5-lOmin，离心速率3000-6000r / min。
[0008] 所述高效液相色谱测定的色谱条件为：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液为甲 醇与水按体积比50 :50的比例混合制得，洗脱方式为等度洗脱；流速为1. OmL/min ;进样量 为10 μ L，柱温25°C ;紫外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm。
[0009] 相对于现有技术，本发明具有以下显著优点： 1、微量的硫离子与金属离子形成的硫化物如ZnS沉淀能完全与金属氢氧化物如Zn (OH) 2共沉淀，与基体分离，用对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液溶解与三氯化铁作用下衍生 形成亚甲基蓝，既使硫离子与蛋白得到了分离，又对硫离子进行了浓缩富集，检测限可达 0.02 μ g/mL。
[0010] 2、衍生后的亚甲基蓝直接进入结合高效液相色谱分析，简化了检测步骤，消除了 三价铁离子、尿液、血液基体对显色反应的干扰，且有效地提高了该仪器的测定灵敏度，是 一种针对体内硫化氢的检测方法，提供快速、简便、直观的定性和定量测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是经过共沉淀之后与共沉淀之前H2S分离富集效果对比示意图；A为尿液中 H2S加标浓度为50ng/mL经过共淀处理后的色谱图；B为尿液中H2S加标浓度为50ng/mL未 经过共沉淀处理的色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0013] 实施例1 :利用本发明检测人体尿液中硫化氢的含量，具体步骤如下： 1、硫化氢标准工作曲线的制作：分别取s21 农度为5 μ g/mL的Na2S标准溶液20、40、 60、80、100 μ L，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，加入质量百分比浓度为50%硫酸锌溶液100 μ L 和3mol/L氢氧化钠 lOOyL，立即润旋混合30s，3000r/min离心10 min,去除上清液，向 沉淀中加入质量体积比浓度为0. 2%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐 酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L，将沉淀充分 溶解，再加入质量百分比浓度为50%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容 至0. 5mL，摇匀，在选定液相色谱测定的色谱条件：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液为 甲醇：水(体积比50 ::50)，洗脱方式为等度洗脱；流速为1. OmL/min，进样量为1〇μ?，柱温 25°C ;紫外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm下测定；得到线性回归方程 y=392. 80x-4. 3667,相关系数R2=0. 9952,6次平行测定，相对标准偏差RSD=1. 21%、回收率 =94. 5% ； 2、尿液的检测：取5mL尿液，加入质量百分比浓度为50%硫酸锌溶液100 μ L和3mol/ L氢氧化钠100 μ L，立即润旋混合30s，3000r/min离心10 min,去除上清液，向沉淀中加 入质量体积比浓度为〇. 2%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液 是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L，涡旋混合30s，3000r/ min离心lOmin，取出上清液，向上清液中加入质量百分比浓度为50%的三氯化铁水溶液 50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇勻，进高效液相在665nm波长处进行测定，测 定峰面积，代入步骤（1)所得的线性回归方程，计算出尿液中硫化氢的含量为〇.〇25Pg/mL (见图1)。
[0014] 实施例2 :利用本发明检测人体血液中硫化氢的含量 1、 硫化氢标准工作曲线的制作：分别取疒浓度为Syg/mL的Na2S标准溶液20、 40、60、80、100 μ L，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，加入质量百分比浓度为60%醋酸锌溶液 120 μ L和浓氨水150 μ L，立即润旋混合30s，5000r/min离心8min，去除上清液，向沉淀 中加入质量体积比浓度为0.3%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐酸 盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L，将沉淀充分溶 解，再加入质量百分比浓度为55%三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至 0. 5mL，摇匀，在选定液相色谱测定的色谱条件：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液位甲 醇：水（体积比50 ::50)，洗脱方式为等度洗脱；流速为1.0mL/min，进样量为lOyL，柱温 25°C ;紫外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm下测定；得到线性回归方程 7=421.4(^-2.4211，相关系数记=0.9969,6次平行测定，相对标准偏差1?0=2.10%、回收率= 96. 1% ； 2、 血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液定容至5 mL，加入质量 百分比浓度为60%醋酸锌溶液120 μ L和浓氨水150 μ L，立即涡旋混合30s，5000r/min离 心8 min，去除上清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 3%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶 液(对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得 的）200μ L，涡旋混合30s，3000r/min离心10 min，取出上清液，向上清液中加入质量百分 比浓度为55%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇匀，进高效液 相在665nm波长下进行测定，测定峰面积，代入步骤（1)所得的线性回归方程，计算出血液 中硫化氢的含量为0. (MOPg/mL。
[0015] 实施例3 :利用本发明检测人体血液中硫化氢的含量 1、硫化氢标准工作曲线的制作：分别取s21 农度为5 μ g/mL的Na2S标准溶液20、40、 60、80、100 μ L，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，加入质量百分比浓度为65%醋酸铅溶液110 μ L 和4mol/L碳酸钠200μ L，立即润旋混合30s，6000r/min离心5min，去除上清液，向沉 淀中加入质量体积比浓度为〇. 5%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐 酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L将沉淀充分 溶解，再加入质量百分比浓度为60%三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容 至0. 5mL，摇匀，在选定液相色谱测定的色谱条件：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液位 甲醇：水(体积比50 ::50)，洗脱方式为等度洗脱；流速为l.OmL/min;进样量为10yL，柱 温25°C ;紫外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm下测定；得到线性回归方程 y=213. 30x-l. 3456,相关系数R2=0. 9975,6次平行测定，相对标准偏差RSD=1. 67%、回收率 =93. 4% ； 2、血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液定容至5 mL，加入质量 百分比浓度为65%醋酸铅溶液110 μ L和4mol/L碳酸钠200 μ L，立即涡旋混合30s，6000r/ min离心5min，去除上清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 5%对氨基二甲基苯胺盐酸 盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中 制得的）200 μ L，涡旋混合30s，6000r/min离心5min，取出上清液，向上清液中加入质量百 分比浓度为60%的三氯化铁水溶液50 μ L静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇匀，进高效 液相在665nm波长下进行测定，测定峰面积，代入步骤（1)所得的线性回归方程，计算出血 液中硫化氢的含量为〇. 〇8(^g/mL。
[0016] 实施例4 :利用本发明检测人体血液中硫化氢的含量 1、硫化氢标准工作曲线的制作：分别取s21 农度为5 μ g/mL的Na2S标准溶液20、40、 60、80、100 μ L，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，加入质量百分比浓度为70%硫酸镁溶液200 μ L 和2mol/L氢氧化钠溶液150μ L，立即涡旋混合30s，6000r/min离心8min，去除上清液， 向沉淀中加入质量体积比浓度为〇. 4%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺 盐酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L，将沉淀充 分溶解，再加入质量百分比浓度为50%三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容 至0. 5mL，摇匀，在选定液相色谱测定的色谱条件：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液位 甲醇：水(体积比50 ::50)，洗脱方式为等度洗脱；流速为1.0mL/min ;进样量为10yL，柱 温25°C ;紫外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm下测定；得到线性回归方程 y=256. ΙΟχ-4. 1290,相关系数R2=0. 9990,6次平行测定，相对标准偏差RSD=2. 21%、回收率 =97. 1% ； 尿液的检测：取5mL尿液，加入质量百分比浓度为70%硫酸镁溶液200 μ L和2mol/L氢 氧化钠溶液150 μ L，立即润旋混合30s，6000r/min离心8 min,去除上清液，向沉淀中加入 质量体积比浓度为〇. 4%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液(对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液是 将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的）200 μ L，涡旋混合30s，5000r/min 离心8 min，取出上清液，向上清液中加入质量百分比浓度为50%的三氯化铁水溶液50 μ L， 静置lOmin，用蒸馈水定容至0. 5mL，摇勻，进高效液相在665nm波长处进行测定，测定峰面 积，代入步骤（1)所得的线性回归方程，计算出尿液中硫化氢的含量为0. 〇75Pg/mL。
【权利要求】
1. 一种血液及尿液中硫化氢的检测方法，其特征在于按如下步骤进行： (1) 硫化氢标准工作曲线的制作：分别取Sh浓度为5μ g/mL的Na2S标准溶液20、40、 60、80、100 μ L，用蒸馈水稀释至5mL，摇勻，加入共沉淀剂，立即润旋混合30s，离心，去除上 清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 2-0. 5%的对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L， 将沉淀充分溶解，再加入质量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin， 用蒸馏水定容至〇. 5mL，摇匀，进高效液相色谱在选定色谱条件进行测定；得到硫化氢回归 方程、相关系数、相对标准偏差、回收率； (2) 样品检测：
1. 尿液的检测：取5mL尿液，加入共沉淀剂，立即涡旋混合30s，离心，去除上清液，向 沉淀中加入质量体积比浓度为〇. 2-0. 5%的对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L，涡旋混 合30s，离心，取出上清液，向上清液中加入质量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液 50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇匀，进高效液相色谱在选定色谱条件下进行 测定，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含量； II、血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取血清定容至5 mL，加入共沉淀 齐U，立即涡旋混合30s，离心，去除上清液，向沉淀中加入质量体积比浓度为0. 2-0. 5%的对 氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液200 μ L，涡旋混合30s，离心，取出上清液，向上清液中加入质 量百分比浓度为50-60%的三氯化铁水溶液50 μ L，静置lOmin，用蒸馏水定容至0. 5mL，摇 匀，进高效液相色谱在选定色谱条件下进行测定，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含 量。
2. 根据权利要求1所述的血液及尿液中硫化氢的检测方法，其特征在于：对氨基二甲 基苯胺盐酸盐溶液是将对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于6mol/L盐酸中制得的。
3. 根据权利要求1所述的血液及尿液中硫化氢的检测方法，其特征在于：共沉淀 剂为无机盐硫酸锌、醋酸锌、醋酸铅、硫酸铝、硫酸镁中的一种与碱性物质氢氧化钠、浓 氨水、碳酸钠中的一种的组合物，其中无机盐的质量浓度百分比浓度为50-70%、用量为 100-200 μ L ;碱性物质氢氧化钠和碳酸钠的质量百分比浓度为浓度为2-4mol/L、用量为 100-200 μ L。
4. 根据权利要求1所述的血液及尿液中硫化氢的检测方法，其特征在于：离心时间 5-lOmin，离心速率 3000-6000r / min。
5. 根据权利要求1所述的血液及尿液中硫化氢的检测方法，其特征在于：所述高效液 相色谱测定的色谱条件为：固定相为C18的分析色谱柱，洗脱液为甲醇与水按体积比50 :50 的比例混合制得，洗脱方式为等度洗脱；流速为1. OmL/min ;进样量为10 μ L，柱温25°C ;紫 外-可见光二极管阵列检测器的检测波长为665nm。
【文档编号】G01N30/02GK104155376SQ201410382081
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】杨亚玲, 赵娇 申请人:昆明理工大学