一种载脂蛋白e检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开的载脂蛋白E检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1的主要组成为：磷酸缓冲液10—50mmol/L；聚乙二醇10—40g/L；氯化钠50—200mmol/L；吐温200.02—0.2%；BSA0.1—1%；NaN30.1%；聚乙二醇为低聚聚乙二醇；试剂R2的主要组成为：磷酸缓冲液10—50mmol/L；氯化钠50—200mmol/L；吐温20?0.02—0.2%；ApoE抗体10—50%（v/v)；NaN30.1%；校准品的主要组成为：磷酸缓冲液10—50mmol/L；氯化钠50—200mmol/L；BSA0.1—1%；EDTA0.2-5mmol/L；吐温20?0.02—0.2%；NaN30.1%；ApoE抗原0—120mg/L。本发明应用方便，试剂稳定性好，检测结果准确性好，重复性好，使用方便，成本低廉，便于推广应用。
【专利说明】一种载脂蛋白E检测试剂盒
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种人体生物蛋白检测技术，特别是一种载脂蛋白E检测试剂盒。
[0003]本申请中下列表达式的意义为:
0.2M磷酸二氢钠:表示溶液中磷酸二氢钠浓度为0.2mol/L ；
0.1% NaN3:表示每 10mL 溶液中加 NaN30.1g ；
ApoE抗体10 — 50% (v/v):试剂R2中ApoE抗体添加量占试剂R2总体积的10 — 50%，以ml/ml计；
BSA:牛血清白蛋白；
EDTA:乙二胺四乙酸；
PBS:磷酸盐；
本申请中跟上述表达式类似之处，所表达意义均跟上述意义类似；本申请中类似表达式另有说明的除外。
[0004]
【背景技术】
[0005]载脂蛋白E (ApoE)是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。其分子量为34kD。ApoE可以在各种组织中合成，但肝脏为主，首先合成的是含有317个氨基酸的前肽，这个前肽在内质网中经过蛋白水解作用除去18个氨基酸的信号肽，再经过糖基化作用和细胞外液的脱唾液酸形成成熟的ApoE ；ApoE分泌入血液后转移到脂蛋白中。ApoE是脂蛋白所必须的结构蛋白，可通过与各组织细胞的受体结合，参与脂蛋白代谢，调节胆固醇水平，激活卵磷脂腿固醇脂舫蘸转移酶(LCAT)，并具有某种免疫调节作用。测定ApoE对诊断和治疗高脂血症动脉粥样硬化等疾病提供了重要理论依据。载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中，正常人血浆ApoE浓度为0.03?0.05g/L。Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。
[0006]已知测定ApoE的方法有层析法、电泳法、免疫分析法、其中层析法和电泳法操作繁琐，不能进行批量样本分析和直接上全自动生化分析仪等缺点，而免疫分析法中的免疫扩散法、放射免疫分析法、突光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、化学发光免疫分析法也存在诸多不足之处；如需特殊的设备，样品需处理，不能上全自动生化分析仪进行批量监测分析等。临床常用的免疫比浊法因其样本用量少，可直接在全自动生化分析仪上批量样本分析、操作简单受其欢迎；但目前建立的方法及试剂都存在一些缺点和不足，主要表现在:一是抗体效价不高，特异性、亲合力、亲和力不好；二是校准血清是以人血清为基，虽然乙肝表面抗原阴性、HIV检测阴性、丙氨酸氨基转移酶正常的人血清，但这也很难排除没有其他传染病的可能，给操作者带来不很大的危险性；而且校准血清为冻干品，每批的定值不一，使用前需用水复溶，操作极其不方便；另外，复溶后必须冰冻保存，特别是不能反复解冻使用，不但造成试剂浪费，而且质量得不到保证，测定结果差异大，其稳定性也不好；三是对高脂、黄疸、溶血样本抗干扰能力差；四是采用单点校准液定标，不符合曲线回归方程计算，导致出现高值偏低，低值偏高的现象，所测结果不准确；五是抗血清在短时间内出现沉淀，使上机操作困难，影响检测效果。
[0007]
【发明内容】
[0008]为解决上述问题，本发明公开了一种载脂蛋白E检测试剂盒，应用方便，试剂稳定性好，检测结果准确性好，使用方便，成本低廉，便于推广应用。
[0009]本发明公开的载脂蛋白E检测试剂盒，载脂蛋白E检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，
试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;聚乙二醇10 — 40g/L ;氯化钠50—200mmol/L ;吐温200.02—0.2% ；BSA0.1—1% ；NaN30.1% ;所述聚乙二醇为低聚聚乙二醇；优选地试剂Rl酸碱度为PH=7-8 ；
试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;氯化钠50— 200mmol/L ;吐温200.02—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN30.1% ;优选地试剂 Rl 酸碱度为 PH=7_8 ；
校准品的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;氯化钠50— 200mmol/L ；BSA0.1—1% ；EDTA0.2-5mmol/L ;吐温 200.02—0.2% ；NaN30.1% ；ApoE 抗原 0 — 120mg/L，优选地试剂Rl酸碱度为PH=7-8。
[0010]作为一种优选，试剂Rl中聚乙二醇的数均分子量为6000。
[0011]作为一种优选，试剂R1、试剂R2和校准品中的磷酸缓冲液为由0.2M磷酸二氢钠标准液和0.2M磷酸氢二钠标准液混合配置，标准液混合后，经由去离子水稀释至特定浓度(以磷酸根离子浓度计)。
[0012]作为一种优选，试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 30mmol/L ;聚乙二醇10—30g/L ;氯化钠 50— 200mmol/L ;吐温 200.08—0.15% ；BSA0.1—1% ；NaN30.1%。
[0013]作为一种优选，试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液25— 40mmol/L ;氯化钠50—150mmol/L ;吐温 200.05—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN30.1%。
[0014]作为一种优选，所述校准品的主要组成为:磷酸缓冲液15 — 45mmol/L ;氯化钠 50—150mmol/L ；BSA0.3—0.7% ；EDTA0.2_5mmol/L ；吐温 200.02—0.15% ；NaN30.1% ；ApoE 抗原 50—100mg/L。
[0015]人体组织的正常PH值应是在7 — 7.4。血液的正常PH值是在7.35— 7.45。血液的PH值始终要保持一个较稳定的状态，如果血液PH值下降0.2，给机体的输氧量就会减少69。4%，造成整个机体组织缺氧。本申请中控制试剂R1、试剂R2以及校准品的PH 7.0-8.0，可以有效地控制试剂盒的检测环境，对检测样本形成缓冲，保持检测反应在正常人生理酸碱环境下进行，提高与标准样的可比性，从而提高试剂盒的检测质量和精准性，降低非人为因素对测试的影响。
[0016]原理:
(I)免疫球蛋白提纯原理:当抗血清中加入33% — 45%饱和硫酸铵时免疫球蛋白被沉淀，即获得纯度较高的IgG (免疫球蛋白G)。
[0017](2)免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。基本原理是:在样本中加入Rl试剂使抗原位点暴露，然后加入R2试剂。R2试剂中的高特异性的ApoE抗体与样本中ApoE抗原形成免疫复合物而产生浊度。当R2试剂中ApoE抗体浓度固定时，形成的免疫复合物和反应液的浊度，随着样本中抗原量的增加而增加。在规定波长下测定该复合物的吸光值，参照校准曲线，即可计算出样本中ApoE的含量。
[0018](3)DEAE原理基于离子交换层析:蛋白具有等电点，但蛋白处于不同的pH条件下，其带电也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白，所以这类蛋白被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等方法，将吸附在柱子上的蛋白洗脱下来。结合较弱的蛋白首先被洗脱下来。
[0019]
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1、SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析ApoE抗体纯度；
图2、ApoE检测试剂盒A、试剂盒B及对照试剂盒的标准曲线；
图3、Apo检测试剂盒A与市售对照试剂的血清相关性比较；
图4、Apo检测试剂盒B与市售对照试剂的血清相关性比较。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解下述【具体实施方式】仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
[0023]本发明公开的载脂蛋白E检测试剂盒，载脂蛋白E检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，
试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;聚乙二醇10 — 40g/L ;氯化钠50—200mmol/L ;吐温200.02—0.2% ；BSA0.1—1% ；NaN30.1% ;所述聚乙二醇为低聚聚乙二醇；优选地试剂Rl酸碱度为PH=7-8 ；
试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;氯化钠50— 200mmol/L ;吐温200.02—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN30.1% ;优选地试剂 Rl 酸碱度为 PH=7_8 ；
校准品的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;氯化钠50— 200mmol/L ；BSA0.1一1% ；EDTA0.2-5mmol/L ;吐温 200.02—0.2% ；NaN30.1% ；ApoE 抗原 0 — 120mg/L，优选地试剂Rl酸碱度为PH=7-8。
[0024]作为一种优选，试剂Rl中聚乙二醇的数均分子量为6000。
[0025]作为一种优选，试剂R1、试剂R2和校准品中的磷酸缓冲液为由0.2M磷酸二氢钠标准液和0.2M磷酸氢二钠标准液混合配置，标准液混合后，经由去离子水稀释至特定浓度(以磷酸根离子浓度计)。其中磷酸缓冲液为Na2HPO4标准液与NaH2PO4标准液混合物配置，两者体积比满足:x*V (Na2HPO4)=0.3* (x_l)*V (NaH2PO4), I 彡 x 彡 5。例如，配置 0.1M 磷酸缓冲液，可以选择当 X 约等于 1.87794 时，V (Na2HPO4) =12.3ml ；V (NaH2PO4) =87.7ml,再经去离子水稀释至200ml即可。
[0026]作为一种优选，试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 30mmol/L ;聚乙二醇10—30g/L ;氯化钠 50—200mmol/L ;吐温 200.08—0.15% ；BSA0.1— 1% ；NaN3 0.1%。
[0027]作为一种优选，试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液25— 40mmol/L ;氯化钠50—150mmol/L ;吐温 200.05—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN30.1%。
[0028]作为一种优选，所述校准品的主要组成为:磷酸缓冲液15 — 45mmol/L ；氯化钠 50—150mmol/L ；BSA0.3—0.7% ；EDTA0.2_5mmol/L ；吐温 200.02—0.15% ；NaN3
0.1% ；ApoE 抗原 50—100mg/L。
实施例
【权利要求】
1.一种载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述载脂蛋白E检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品， 所述试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液 10 — 50mmol/L;聚乙二醇 10 — 40g/L ;氯化钠50— 200mmol/L ;吐温 200.02—0.2% ；BSA0.1— 1% ；NaN30.1% ;所述聚乙二醇为低聚聚乙二醇； 所述试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液10 — 50mmol/L ;氯化钠50—200mmol/L ;吐温 20 0.02—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN30.1% ； 所述校准品的主要组成为:磷酸缓冲液 10—50mmol/L;氯化钠50—200mmol/L ；BSA0.1— 1% ；EDTA0.2_5mmol/L ;吐温 200.02—0.2% ；NaN30.1%;ΑροΕ 抗原 O — 120mg/L。
2.根据权利要求1所述的载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述试剂Rl中聚乙二醇的数均分子量为6000。
3.根据权利要求1所述的载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述试剂R1、试剂R2和校准品中的磷酸缓冲液为由0.2M磷酸二氢钠标准液和0.2M磷酸氢二钠标准液混合配置。
4.根据权利要求1所述的载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述试剂Rl的主要组成为:磷酸缓冲液 10 — 30mmol/L ;聚乙二醇 10 — 30g/L ;氯化钠50—200mmol/L ;吐温 20 0.08—0.15% ；BSA 0.1—1% ；NaN3 0.1%。
5.根据权利要求1所述的载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述试剂R2的主要组成为:磷酸缓冲液25— 40mmol/L ;氯化钠50— 150mmol/L ;吐温200.05—0.2% ；ApoE 抗体 10—50% (v/v) ；NaN3 0.1%。
6.根据权利要求1所述的载脂蛋白E检测试剂盒，其特征在于:所述校准品的主要组成为:磷酸缓冲液 15—45臟01/1;氯化钠50— 150mmol/L ;BSA0.3—.0.7% ；EDTA 0.2-5mmol/L ;吐温 20 0.02—0.15% ；NaN3 0.1% ；ApoE 抗原.50一100mg/L。
【文档编号】G01N33/68GK104198730SQ201410429303
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】方蓉, 张闻, 陈媛, 陈思思, 周海滨, 王建飞 申请人:宁波瑞源生物科技有限公司