一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，该方法是通过考察注射疫苗后机体血清抗体水平来评价的，具体技术方法是创新性的建立了针对PPV的ELISA抗体效价评价方法。具有操作简便、特异和敏感等特点，为PPV灭活苗抗体检测提供一种有效技术手段。
【专利说明】一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗【技术领域】，具体涉及一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方 法。
【背景技术】
[0002] 猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV)引起初孕母猪的繁殖障碍性疾病，主要表 现为胚胎和胎猪的感染和死亡，而母猪通常表现为亚临床症状。血清学阴性初孕母猪在妊 娠期小于70天感染PPV，可导致胚胎或胎猪的感染，从而产生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖 障碍症状。PPV在世界各地普遍存在，目前已成为导致胚胎和胎猪感染和死亡的主要病原之 一。该病毒除了能直接导致母猪繁殖障碍外，还与仔猪的肠炎性腹泻和仔猪皮炎相关。另 外，PPV与猪圆环病毒2型混合感染，诱发断奶仔猪多系统衰竭综合症也有报道。
[0003] 目前，所使用的猪细小病毒灭活疫苗效力的评价方法为经典的血凝抑制试验。所 用到的试验动物为猪或者是豚鼠，由于PPV抗体阴性猪很难找，而且试验成本又高，选用对 PPV敏感的豚鼠来代替猪完成疫苗的效力评价得到了专家的认可。对于豚鼠的使用，试验前 一定要测定豚鼠体内是否有PPV HI抗体，只有PPV HI抗体阴性豚鼠，才能用于PPV灭活疫 苗的效力检测，由于豚鼠接触PPV后，体内就会产生PPV抗体，因此，在每次试验前均应做好 相应的监测筛选，保证使用PPV抗体阴性豚鼠，在每次试验中，也要设立阴性对照组，以防 试验过程中感染PPV。在这些过程中，我们要通过HI试验筛选和测定抗体，血清样品需要进 行白陶土等的处理，对血凝价的判定，4单位HA的标定，试验用PBS液PH控制等，整个试验 过程对操作者的要求相对较高，试验的周期较长，结果的人为因素影响较大，该方法大都只 能作为定性或相对定量，无法进行精确定量。该过程使用的试剂和豚鼠红细胞影响对疫苗 效果的评价。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评 价方法，以实现测定周期短，结果易判断，成本低的技术目的。
[0005] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] -种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，包括以下步骤：
[0007] 1)制备标准阴性血清与标准阳性血清：
[0008] 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，经白陶土溶液处理后作为标准阴性血清；选择灭 活疫苗免疫阴性豚鼠后血清，经白陶土溶液处理，血凝抑制价> 1:64的血清，作为标准阳 性血清；
[0009] 2)病毒抗原的浓缩、纯化；
[0010] 3)抗原的包被；
[0011] 4)检测：
[0012] 在酶标板上加入稀释后的待测血清100μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ;
[0013] 加入已经包被PPV纯化抗原，37°C作用0· 5?L 5h ;
[0014] 弃去一抗，用PBST洗涤；
[0015] 加入PBS稀释的HRP标记羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0· 5?1. 5h ;
[0016] 弃去二抗，用PBST洗涤；
[0017] 加入显色液进行避光显色15?25min ;
[0018] 每孔加入50 μ 1终止液终止显色；
[0019] 酶标仪读取0D45(I的值。
[0020] 优选的，所述步骤2)包括以下步骤：
[0021] 利用IBRS-2或ST细胞培养病毒，待细胞病变达到80%以上时，收获病毒培养液， 反复冻融收获保存备用；将病毒培养液经4°C 5000rmp/min离心30min，去沉淀，上清液再经 10000rpm/min 4°C离心60min，取上清；上清装入透析袋中用0.01M pH7.4PBS缓冲液，透析 3-4d，每天换液4次；然后用PEG6000浓缩，获得病毒浓缩液，于-20°C保存备用。
[0022] 优选的，步骤3)包括以下步骤：
[0023] 以阳性血清与阴性血清在不同抗原浓度下的0D45(I值之差最大作为选定最适血清 稀释度的标准确定最适血清稀释度，以此稀释度对应的抗原稀释度为最适抗原包被浓度； 利用上述最适血清稀释度和最适抗原包被浓度为条件对抗原执行包被。
[0024] 优选的，步骤3)执行抗原包被时抗原包被浓度为15?30ug/mL。
[0025] 优选的，步骤3)执行抗原包被时阳性血清的稀释倍数为1:4?1:16。
[0026] 在以上技术方案中当检测结果、即0D45(I值彡2. 1时判别为抗体阳性、即疫苗已产 生效力；当检测结果、即〇〇45。值< 2. 1时判别为抗体阴性、即疫苗未产生效力。
[0027] 本发明具有如下技术优越性：
[0028] (1)本发明的检测方法检测周期短，检测到结果判定仅需3小时左右，而目前HI抑 制试验检测时间需要4?6小时。
[0029] (2)该方法稳定性优于HI方法，操作简单，可重复性好，批间差异稳定。
[0030] (3)特异性好，可准确判定阴阳性结果，而目前HI效价筛选小鼠时只能检测到 < 23以下，通过本发明建立的ELISA方法可以精确的确定阴性小鼠，可以更严格的筛选阴 性小鼠。
[0031] (4)对抗体水平的评价，本发明建立的ELISA方法检测结果与HI效价测定结果符 合率达到100%。
[0032] 本发明采用纯化的细小病毒抗原，用病毒包被ELISA板，然后与待检豚鼠血清抗 体及制备的豚鼠阳性血清进行反应，然后与辣根过氧化物酶标记的猪抗豚鼠二抗反应，最 后通过TMB显色，同时利用购入的国标产品猪细小病毒灭活疫苗免疫豚鼠（PPV HK8)后采 血分离血清，制备出针对于PPV的阳性标准血清，同时采集阴性豚鼠（PPV HK8)血清作为 阴性对照，利用酶标仪检测结果。用于在细小病毒灭活疫苗的效力试验中阴性豚鼠的筛选， 以及抗体水平的评价。该方法与常规血凝抑制（HI)试验比较：测定周期短，结果更易判断， 敏感性更高，特异性更好。本研究建立的ELISA具有操作简便、特异和敏感等特点，为PPV 灭活苗豚鼠效力试验抗体检测提供一种有效技术手段。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1猪细小病毒灭活疫苗评价用豚鼠的筛选
[0034] 1.豚鼠的购入：购入10只豚鼠，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0035] 2.采血分离血清，分别进行ELISA抗体和HI抗体效价的测定。
[0036] 2· 1HI抗体效价测定
[0037] 2. 1. 1抗原制备：对豚鼠红细胞血凝价达1 :128以上且病毒含量达 1051^105(|/0.11111时，经甲醛灭活，灭菌彻底后作为血凝抑制试验抗原。以50%红细胞凝集 (HA 5CI)的抗原最高稀释度作为抗原效价结果判定终点。抗原HA5(I效价不低于1:128。
[0038] 2. 1. 2阳性血清和阴性血清对照样品的制造：选择3-6月龄健康易感仔猪，采集血 清测定HI效价为0的血清作为阴性血清对照。选择灭活疫苗（BJ-2株）免疫猪只后制备 血清，其一个抗原工作量（即4HA 5(I)进行血凝抑制试验测定，HI效价> 1 :128,作为阳性对 照血清。
[0039] 2. 1. 3猪细小病毒血凝和抗猪细小病毒血清抗体血凝抑制试验操作步骤
[0040] 2· 1. 3· 1血凝素工作液制备
[0041] ①血凝素凝集价测定：用生理盐水将血凝素稀释成不同倍数，加入0. 5%豚鼠红 细胞悬液。将96孔板在振荡器上摇匀，置于20-301：，20-401^11判定结果，使50%红细胞凝 集的最高稀释度，作为判定终点。
[0042] 表1血凝素凝集价测定流程数据
[0043]
【权利要求】
1. 一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 制备标准阴性血清与标准阳性血清： 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，经白陶土溶液处理后作为标准阴性血清；选择灭活疫 苗免疫阴性豚鼠后血清，经白陶土溶液处理，血凝抑制价> 1:64的血清，作为标准阳性血 清； 2) 病毒抗原的浓缩、纯化； 3) 抗原的包被； 4) 检测： 在酶标板上加入稀释后的待测血清1〇〇μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 加入已经包被PPV纯化抗原，37°C作用0. 5?1. 5h ; 弃去一抗，用PBST洗涤； 加入PBS稀释的HRP标记羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 弃去二抗，用PBST洗涤； 加入显色液进行避光显色15?25min ; 每孔加入50 μ 1终止液终止显色； 酶标仪读取〇D45(l的值。
2. 根据权利要求1所述的一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，其特征在于步 骤2)包括以下步骤： 利用IBRS-2或ST细胞培养病毒，待细胞病变达到80%以上时，收获病毒培养液，反 复冻融收获保存备用；将病毒培养液经4°C 5000rmp/min离心30min，去沉淀，上清液再经 10000rpm/min 4°C离心60min，取上清；上清装入透析袋中用0· 01M pH7. 4PBS缓冲液，透析 3-4d，每天换液4次；然后用PEG6000浓缩，获得病毒浓缩液，于-20°C保存备用。
3. 根据权利要求1所述的一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，其特征在于步 骤3)包括以下步骤： 以阳性血清与阴性血清在不同抗原浓度下的〇D45(l值之差最大作为选定最适血清稀释 度的标准确定最适血清稀释度，以此稀释度对应的抗原稀释度为最适抗原包被浓度；利用 上述最适血清稀释度和最适抗原包被浓度为条件对抗原执行包被。
4. 根据权利要求1所述的一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，其特征在于步 骤3)执行抗原包被时抗原包被浓度为15?30ug/mL。
5. 根据权利要求1所述的一种猪细小病毒灭活疫苗免疫效力评价方法，其特征在于步 骤3)执行抗原包被时阳性血清的稀释倍数为1:4?1:16。
【文档编号】G01N33/96GK104215781SQ201410449450
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】吕茂杰, 杨保收, 盛长忠, 梁武 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司