一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种atp关联产物的方法
【专利摘要】本发明属于分析化学领域，公开了一种用高效液相色谱—二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法。使用带有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取后进样到高效液相色谱仪中，梯度洗脱；根据各ATP关联产物的保留时间及紫外吸收光谱，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物，检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下ATP关联物标准工作曲线或者回归方程计算待测样品提取液中ATP关联产物的含量。本方法的设备及分析条件要求简单，不用离子对试剂也可以同时测定水产品中多种ATP关联产物含量，可同时测10种，分离时间不超过25分钟。
【专利说明】-种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种 ATP关联产物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，涉及检测水产品中多种ATP关联产物的方法，特别涉 及用高效液相色谱一二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法。
【背景技术】
[0002] ATP关联产物是由嘿岭碱基、嚼巧碱基、尼克醜胺等与糖磯酸醋组成的一类化合 物，如H磯酸腺巧（adenosine triphosphate，ATP)、二磯酸腺巧（Adenosine Di地OS地ate, ADFO、腺巧酸（Adenosine Mono 地 OS 地 ate, AMP)、肌巧酸（Inosinic acid, IMP)、次黄嘿 岭核巧（Inosine, HxR)、次黄嘿岭（Hypoxanthine, Hx)、鸟巧酸（Guan}dic acid, GMP),腺 巧（Adenosine, AdR),腺嘿岭（Adenine, Ad)、黄嘿岭狂anthine, Xt)等。它们是水产动物 肌肉核巧酸的主要成分，与水产原料的风味和新鲜度紧密相关。在风味方面，如AMP有着 压抑苦味的特性，能使食物产生良好的甜味和咸味，化会产生苦味，IMP是水产动物肌肉 主要的呈味核巧酸，IMP增加食品鲜味的能力比谷氨酸轴强40倍。在鲜度方面，一般认 为鱼死后鱼肉内ATP依次降解为ADP、AMP、IMP、化R和版，其中化R、化量之和对ATP关 联物总量的比值即为K值。K值作为鱼类鲜度指标已被公认。对于贝类，SaitoHuArai和 wamoto嘲等对几种双壳动物的肌肉进行分析，发现在始蝴和扇贝中，ATP及其关联物的 降解过程为ATP - ADP - AMP - AdR -化R -化一 Xt,而在舟贝、毛赃和鲍鱼中按途径 ATP - ADP - AMP - AdR - Ad进行。因此，快速准确检测出鱼体中的ATP及其关联产物对 水产原料的风味和新鲜度有很重要的意义。
[0003] 目前国内外测定ATP关联物含量的方法主要有离子交换液相色谱法、毛细管电 泳法和反相液相色谱法等。离子交换色谱法对核巧酸等兼性离子化合物能很好的分离， 但其需要对分离柱进行平衡（再生），且分析时间较长；高效毛细管电泳法对各种呈味核 巧酸的分辨率较高，但仪器昂贵；反相高效液相色谱法具有快速、操作简便的优点，是目前 生物、食品等研究领域主要使用的方法，但W往的反相高效液相色谱法分离的核巧酸或种 类有限，或采用离子对试剂法分离，造成待测核巧酸相互有干扰或分析时间过长。如： 亚等用高效液相色谱法测定了马氏珠母贝肉中的ATP关联产物（食品与发酵工业，2008， 36(6) =137-141)，该法只测定了 6种ATP关联产物，可能存在其他核巧酸的干扰。杨文 错、陈舜胜等采用离子对高效液相色谱法测定了水产品中ATP降解产物（农业工程学 报，2007,（06). 217-222)、（水产学报，2011，35 (11). 1745-1752)，离子对高效液相色谱法 稳定时间过长，分离度不好，分析效率低，且对柱子污染大，暂时还没有一种设备要求低、不 采用离子对试剂、分析效率高且定性稳定、能够同时测定水产品中该9种ATP关联产物的高 效液相色谱法。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种操作简单、分离速度快、不使用离子对试剂且定量定性准 确，能够同时测定水产品中多种ATP关联产物的高效液相色谱-二极管阵列法，解决W上现 有技术中存在的分离效果不好、种类有限、分析时间过长、柱子污染严重及定性不准确等不 足。
[0005] 所测定的ATP关联产物为H磯酸腺巧（adenosine tri地OS地ate, ATP)、二磯 酸腺巧（Adenosine Di 地 OS 地 ate, ADFO、腺巧酸（Adenosine Mono 地 OS 地 ate, AMP)、肌巧 酸（Inosinic acid, IMP)、次黄嘿岭核巧（Inosine, HxR)、次黄嘿岭（Hypoxanthine, Hx)、 鸟巧酸（Guan}dic acid, GMP),腺巧（Adenosine, AdR),腺嘿岭（Adenine, Ad)和黄嘿岭 狂anthine, Xt)中的至少一种。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 使用带有DAD (二极管阵列）检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取 液加入到高效液相色谱仪中，梯度洗脱。
[0008] 用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物的最佳检测波长（紫外最大吸 收波长和200?400nm下的紫外吸收光谱，根据特征光谱确定各色谱峰是哪一种ATP关联 产物。
[0009] 10种ATP关联产物的紫外最大吸收波长分别为；H磯酸腺巧259. Inm、二磯酸腺巧 253. 2nm、腺巧酸248. 4nm、肌巧酸259. Inm、次黄嘿岭核巧248. 4nm、次黄嘿岭259. Inm、鸟巧 酸 260. 3nm、腺巧 248. 4nm、腺嘿岭 259. Inm、黄嘿岭 267. 4nm。
[0010] 检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下标准工作曲线或者回归 方程计算ATP关联产物的含量。
[0011] 液相色谱柱采用通用型，填料选自十八焼基键合相娃胶；流动相由甲醇（A相）和 15mmol/L磯酸氨二钟缓冲液炬相）组成，磯酸氨二钟缓冲液抑调为5. 9,梯度洗脱。
[0012] 色谱条件为，分析柱；填料选自十八焼基键合相娃胶的通用型液相色谱柱；流速： 0. 5?1. 5血/min,优选为1.0血/min ;进样量为8?12 y 1，优选为IOy 1 ;柱温为30? 35°C，优选为30?32°C。优选的，W规格为4. 6X250mm i.d，5ym的waters C18色谱柱为 固定相。
[0013] 流动相由A相的有机溶剂和B相的缓冲液组成；A相为甲醇或己膳，B相为抑5. 8? 6. 0、浓度为15?60mmol/L的缓冲液，例如磯酸氨二钟缓冲液，磯酸二氨钟缓冲液、磯酸氨 二轴缓冲液、巧樣酸-巧樣酸轴缓冲液或己酸-己酸轴缓冲液。优选为抑5. 8?6. 0、浓度 为15?60mmol/L的磯酸氨二钟缓冲液；更优选浓度抑5. 8?5. 9、浓度为15?25mmol/的 磯酸氨二钟缓冲液。
[0014] 梯度洗脱程序如下：
[00巧]第一阶段；A相0%、B相100% ;持续时间为5. 5?6. 5min;
[001引第二阶段；瞬时调整为A相7%?9%、B相91 %?93%，并W该个梯度洗脱；持续 时间为8. 5?IOmin ;
[0017] 第H阶段；两种流动相匀速变化到A相32%?40%，B相60%?68% ;持续时间 为 4. 5 ?6min ;
[001引第四阶段巧种流动相匀速变化到A相32%?40%，B相60%?68% ;持续时间 为 1. 5 ?Smin ;
[0019] 第五阶段：两种流动相匀速变化到A相0%、B相100% ;持续时间为2. 5?4min。 上述比例均为体积比。
[0020] 或者，优选的梯度洗脱程序为：
[0021] 第一阶段为第 0. 00 ?6. OOmin ;A 相 0 %、B 相 100 % ;
[0022] 第二阶段为第6. 00?15. OOmin,在第二阶段开始时（可W是第6. 00?6. Olmin 时），瞬时调整为A相7%?9%、B相91%?93% (优选为A相8%，B相92% )并W该个 梯度洗脱；
[0023] 第H阶段为第15. 00?20. OOmin ;两种流动相匀速变化到A相32%?40%，B相 60%?68% (优选为A相35%，B相65% );
[0024] 第四阶段为第20. 00?22. OOmin ;两种流动相匀速变化到A相36%?43%，B相 57%?62% % (优选为 A 相 35%，B 相 65% );
[00巧]第五阶段为第22. 00?25. OOmin;两种流动相匀速变化到A相0%、B相100%。
[0026] 优选的，流动相在使用前用0. 22?0. 5 y m(优选为0. 45 y m)的水相微孔滤膜过 滤后，超声脱气3?10分钟。
[0027] 优选的，检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据标准工作曲线或者回归方程计 算ATP关联产物的含量。用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物的最佳检测波 长（紫外最大吸收波长），并根据H维色谱图对样品中的10种ATP关联产物进行进一步定 性，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物。
[0028] 待测样品提取液的制备方法为：
[0029] a.取水产品样品，按照Ig ;1?3ml的的用量比，与预冷到0?4°C、质量浓度为 3%?6%的高氯酸溶液混合均质进行浸提，0?4°C下2000?8000巧m离也5?20min，收 集上清液；
[0030] b.取沉淀按上述步骤a的方法操作重复1?3次，合并上清液；
[0031] C.加入KOH或化OH将抑中和至5. 5?6. 0 (优选为5. 8?6. 0,更优选5. 9)，过 滤去除高氯酸钟或高氯酸轴结晶固体，再用流动相B相中的缓冲液定容；
[003引 d.用孔径为0. 22?0. 5 y m的滤膜（优选为0. 45 U m)过滤，即获得待测样品提取 液。
[0033] 标准工作曲线或回归方程的建立方法为；分别称取ATP关联物标准品，用流动相 的B相配制成不同浓度的标准溶液，进行液相色谱测定，根据保留时间和二极管阵列检测 器扫描图谱定性，W核巧酸浓度为横坐标，所测相应核巧酸色谱峰面积为纵坐标作图，并绘 制标准工作曲线或者拟合回归方程。
[0034] 上述方法可用外标法定量分析水产品中多种ATP关联产物的含量。
[00巧]水产品样品前处理的具体方案为：
[0036] (1)新鲜水产品肉与0?10°C的5wt%?8wt%的高氯酸匀浆1?2min，两者比例 为Ig ;1. 3?3ml ;超声提取3?Smin后，低温离也；分离上清液和沉淀；
[0037] (2)步骤（1)的沉淀用0?1(TC的5wt%?8wt%的高氯酸再次匀浆，超声提取 3?Smin后，低温离也；分离上清液和沉淀；并重复1?3次；
[00測 做合并步骤（1)和步骤（2)的上清液，加入KOH或化OH中和至抑=5. 8? 6. 0 (优选5. 9)，去除高氯酸盐结晶，加入流动相B相溶解定容，再用孔径为0. 4?0. 6 y m 滤膜过滤。
[0039] 本发明的创新在于用常规的液相色谱仪及C18色谱柱即可进行检测，设备及分析 条件要求简单，通过选择合适的流动相条件、合适的抑W及梯度洗脱程序，不用离子对试 剂也可W同时测定水产品中多种ATP关联产物含量，最多可同时测10种；分离时间不超过 25分钟。本方法不使用离子对试剂，可大大提高检测效率，延长色谱柱的使用寿命；具有污 染柱子少、操作快速简便、灵敏度高等优点，同时采用二极管阵列检测器对样品进行扫描， 定性更准确，明显优于已公开的技术，因此是一项非常值得广泛应用和推广的技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1实施例1的10种ATP关联物（100 y g/mL浓度的溶液）的紫外210-400皿的 扫描光谱图
[0041] 图2为实施例1的10种ATP关联产物的H维色谱图
[0042] 图3为实施例1的10种ATP关联产物标准品混合溶液（每种物质浓度为50 U g/ mL)液相色谱图（柱温32 C )
[0043] 图4为实施例2中华绒馨蟹肉样品的液相色谱图
[0044] 图5为实施例2斑节对邮肉样品的液相色谱图
[0045] 图6为实施例3的10种ATP关联产物标准品混合溶液（每种物质浓度为100 y g/ mL)液相色谱图（柱温3(TC )
[0046] 图7为实施例4秀丽白邮肉样品的液相色谱图
[0047] 图8为实施例4凡纳滨对邮肉样品的液相色谱图
[0048] 图9为实施例4哈氏仿对邮肉样品的液相色谱图
[0049] 图10为实施例4文始肉样品的液相色谱图
[0050] 图11为实施例4白始肉样品的液相色谱图
[005。 图12为对比例1 (A) 10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图（柱温 32°C )
[0052] 图13为对比例1炬)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图 [005引图14为对比例2 (A) 10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图
[0054] 图15为对比例2炬)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图
【具体实施方式】
[0055] W下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0056] 实施例1分离检测10种ATP关联物
[0057] (1)标准样品溶液的制备：用抑=5. 9、浓度为15mmol/L的磯酸氨二钟缓冲溶液 (流动相B相）为溶剂，分别称取10种ATP关联物标准品ATP、GMP、IMP、ADP、化、AMP、At 化R、AdR和Xt,配制浓度液分别为0. Ol?750 y g/mL的ATP关联物系列标准溶液。
[005引 似最佳紫外检测波长的确定：取浓度为100 y g/mL的标准溶液，用二极管阵列检 测器扫描确定检测10种ATP关联产物的210?440nm下的紫外吸收光谱和最佳检测波长 (紫外最大吸收波长），确定ATP、GMP、IMP、ADP、化、AMP、At化R、AdR和Xt的最佳紫外检 测波长分别为 259. 1、253. 2、248. 4、259. 1、248. 4、259. 1、260. 3、248. 4、259. 1、267. 4皿，结 果图1。
[0059] (3)将10种ATP关联物标准品用抑=5. 9、浓度为15mmol/L磯酸氨二钟缓冲 液制成混合溶液，每种ATP关联物浓度为100 y g/mU进行液相色谱测定，使用Waters e2695高效液相色谱仪进行检测（美国Waters)，并且配有Waters 2996二极管阵列检测 器及Empower色谱软件。液相色谱柱采用通用型，填料选自十八焼基键合相娃胶，Waters Atlantis T3C18 (4. 6 X 250mm，Sum)。
[0060] 色谱条件为；Waters Atlantis T3C18 (4. 6 X 250mm，5 ym)色谱柱，流速 I. 0血/ min ;进样量为10 y I ;柱温为3(TC。进样量10 y L，流速Iml/min。
[0061] 10种ATP关联产物经自动进样器进样后到达色谱柱分离，用二极管阵列检测器进 行检测分析。
[0062] 用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物洗脱色谱峰的最佳检测波长 和210?440nm下的紫外吸收光谱，对样品中的10种ATP关联产物进行进一步定性，确定 各色谱峰是哪一种ATP关联产物。H维色谱图和液相色谱图结果如图2和图3。
[006引流动相由甲醇（A相）和抑=5. 9、浓度为15mmol/L磯酸氨二钟缓冲液炬相）组 成，磯酸氨二钟缓冲液抑调为5. 9,按表1的程序梯度洗脱。A相和B相先用0. 45 y m的水 相微孔滤膜过滤并超声脱气5分钟。
[0064] 表1梯度洗脱程序
[0065]
【权利要求】
1. 一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法，其 特征在于，包括如下步骤： 使用带有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取液加入到高 效液相色谱仪中，梯度洗脱；根据各ATP关联产物的保留时间和210?400nm下的紫外吸收 光谱，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物； 色谱条件为，分析柱：填料选自十八烷基键合相硅胶的通用型液相色谱柱；流速： 0· 5?1. 5mL/min ;进样量为8?12 μ 1 ;柱温为30?35°C ; 洗脱程序为： 第一阶段：A相0%、B相100% ;持续时间为5. 5?6. 5min ; 第二阶段：瞬时调整为A相7%?9 %、B相91 %?93%，并以这个梯度洗脱；持续时间 为 8. 5 ?lOmin ; 第三阶段：两种流动相匀速变化到A相32 %?40 %，B相60 %?68 % ;持续时间为 4. 5 ?6min ; 第四阶段：两种流动相匀速变化到A相32%?40%，B相60%?68% ;持续时间为 L 5 ?3min ; 第五阶段：两种流动相匀速变化到A相0%、B相100% ;持续时间为2. 5?4min ;上述 比例均为体积比； 所述流动相由A相的有机溶剂和B相的缓冲液组成；A相为甲醇或乙腈，B相为pH5. 8? 6. 0、浓度为15?60mmol/L的磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液、 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液； 检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下ATP关联物标准工作曲线或 者回归方程计算待测样品提取液中ATP关联产物的含量。
2. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 的方法，其特征在于，所测定的ATP关联物为三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次 黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、鸟苷酸、腺苷、腺嘌呤和黄嘌呤中的至少一种。
3. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 的方法，其特征在于，所述的流动相A相为甲醇。
4. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 的方法，其特征在于，所述的流动相B相为pH5. 8?6. 0、浓度为15?60mmol/L的磷酸氢二 钾缓冲液。
5. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 含量的方法，其特征在于，色谱条件为：分析柱选自十八烷基键合相硅胶的通用型液相色谱 柱；流速〇· 5?L 5mL/min ;进样量为8?12 μ 1 ;柱温为30?35°C。
6. 权利要求5所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 含量的方法，其特征在于，流速为1. OmL/min ;进样量为10 μ 1 ;柱温选为30?32°C。
7. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为： 第一阶段为第〇· 〇〇?6. OOmin :A相0 %、B相100 % ; 第二阶段为第6. 00?15. OOmin，在第二阶段开始时（可以是第6. 00?6. Olmin时）， 瞬时调整为A相7%?9%、B相91%?93%，并以这个梯度洗脱；持续时间为8. 5?lOmin ; 第三阶段为第15. 00?20. OOmin :两种流动相匀速变化到A相32 %?40%，B相 60%?68% ; 第四阶段为第20. 00?22. OOmin :两种流动相匀速变化到A相36 %?43%，B相 57%?62%% ; 第五阶段为第22. 00?25. OOmin :两种流动相匀速变化到A相0 %、B相100 %。
8. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为： 第一阶段为第〇· 〇〇?6. OOmin :A相0 %、B相100 % ; 第二阶段为第6. 00?15. OOmin，在第二阶段开始时瞬时调整为A相8%，B相92%并 以这个梯度洗脱； 第三阶段为第15. 00?20. OOmin :两种流动相匀速变化到A相35%，B相65% ; 第四阶段为第20. 00?22. OOmin :两种流动相匀速变化到A相35%，B相65% ; 第五阶段为第22. 00?25. OOmin :两种流动相匀速变化到A相0%、B相100%。
9. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物 含量的方法，其特征在于，所述流动相在使用前用〇. 22?0. 5 μ m的水相微孔滤膜过滤后， 超声脱气3?10分钟。
10. 权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产 物含量的方法，其特征在于，水产品待测样品提取液的制备方法为： a. 取水产品样品，按照lg :1?3ml的的用量比，与预冷到0?4°C、质量浓度为3%? 6(%的高氯酸溶液混合均质进行浸提，0?4 1€下2000?8000印1]1离心5?201]1；[11，收集上清 液； b. 取沉淀按上述步骤a的方法操作重复1?3次，合并上清液； c. 加入K0H或NaOH将pH中和至5. 8?6. 0,过滤去除高氯酸钾或高氯酸钠结晶固体， 再用流动相B相中的缓冲液定容； d. 用孔径为0. 22?0. 5 μ m的滤膜过滤，即获得待测样品提取液。
【文档编号】G01N30/06GK104237412SQ201410477961
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】邱伟强, 陈舜胜, 谢晶, 曲映红, 施文正, 宋雪, 王丹妮, 王帅, 秦晓, 黄鑫, 晋颖颖 申请人:上海海洋大学