一种用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法及其应用。样本中目标分析物或二级分析物可与检测试剂反应生成不溶性沉积物，导致反应区的疏水性增强，分析物浓度与反应区疏水性增强程度成正比；反应区的疏水性程度将决定在设定的时间或距离(如反应区末端）内亲水性彩色试剂溶液从反应区流入定量区的体积，定量区中彩色印迹的长度与流入其中的彩色试剂溶液体积成正比，而与反应区的疏水性程度成反比。因此，样本中分析物浓度与定量区的彩色印迹长度成反比，通过使用带刻度的直尺测量定量区中彩色印迹的长度即可实现样本中分析物的快速定量检测。该方法可应用于尿液、血液、血清、唾液、水等各种液体样本中目标分析物的定量检测。
【专利说明】一种用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于快速检测试纸产品开发及其应用【技术领域】，特别涉及一种用于快速检 测试纸的免仪器定量分析方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 快速检测试纸作为一种简单、低成本的分析工具已经被广泛应用于现实生活的方 方面面，例如，测孕试纸、尿液检测试纸、pH试纸、亚硝酸盐检测试纸、农残检测试纸等。然 而，除了胶体金免疫层析试纸和家用血糖仪外，绝大多数的传统快速检测试纸只能实现样 本中分析物的半定量或定性分析，极大地限制了它们的实际应用。近年来，新型的快速检测 试纸和相关的定量分析方法不断被报道。本发明中的试纸属于新型快速检测试纸，也被称 为纸微流控分析装置（Microfluidic paper-based analytical device)、纸上微流控芯片 (Paper-based microfluidics)或纸上实验室（Lab-〇n-paper)〇
[0003] 目前文献报道的快速检测试纸定量方法主要包括电化学检测法、荧光分析法、色 度法、化学发光法、光电转换法等。尽管这些方法能够快速检测试纸的定量分析，但是所涉 及的专业分析仪器(例如，电化学工作站、荧光分析仪、化学分析仪等）体积庞大且价格昂 贵，因而显著增加了分析成本，同时操作步骤相对繁琐费时，并对操作人员要求较高的专业 技能，尤其不能满足日益增加的即时检验与现场分析要求，难以在各种领域获得广泛应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法及其应用。
[0005] 本发明的用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法的原理：样本中目标分析物或 二级分析物可与检测试剂反应生成不溶性沉积物，导致反应区的疏水性增强，分析物浓度 与反应区疏水性增强程度成正比；反应区的疏水性程度将决定在设定的时间或距离（如反 应区末端）内亲水性彩色试剂溶液从反应区流入定量区的体积，定量区中彩色印迹的长度 与流入其中的彩色试剂溶液体积成正比，而与反应区的疏水性程度成反比。因此，样本中分 析物浓度与定量区的彩色印迹长度成反比，通过使用带刻度的直尺测量定量区中彩色印迹 的长度即可实现样本中分析物的快速定量检测。
[0006] 本发明的用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法的具体步骤为： (1)快速检测试纸的制作：利用滤纸、层析纸、宣纸或硝酸纤维素膜结合现有试纸制作 方法制作快速检测试纸，其结构是疏水性材料与亲水性纸体的图案化复合结构或者是图案 化亲水性纸体，至少包括样本添加区、用于固定检测试剂的反应区和定量区三个连续的部 分。
[0007] ⑵在用于固定检测试剂的反应区中添加酶和底物。
[0008] (3)在添加区中滴加检测样本，当样本流经反应区时，样本中目标分析物或二级分 析物与反应区中添加的酶和底物反应生成不溶性沉积物，导致反应区的疏水性增强，随后 滴加在添加区的3微升至20微升亲水性彩色试剂溶液在毛细管作用下流经反应区并流入 定量区，当达到设定的时间或流经设定的距离时，使用微量移液器或吸水纸将添加区中多 余的未水性彩色试剂移除。
[0009] (4)当试纸中的亲水性彩色试剂在定量区中不再流动后，使用带刻度的直尺测量 定量区中彩色印迹的长度，即完成样本中分析物的快速定量检测。
[0010] 所述现有试纸制作方法为石蜡打印机印刷法、手工绘图法、机械绘图法、光刻蚀法 和激光剪纸法中的一种。
[0011] 所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶和碱性磷酸酶中的一种。
[0012] 所述底物为二甲基联苯胺或四甲基联苯胺。
[0013] 本发明的用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法应用于尿液、血液、血清、唾 液、水等各种液体样本中目标分析物的定量检测。
[0014] 本发明的方法不需要任何额外专业仪器，仅使用廉价的带刻度直尺即可实现分析 物的定量检测，分析成本低廉。同时，定量分析过程简单、快速，操作人员几乎无需任何专业 技能培训。此外，该方法可直接推广至现有快速检测试纸平台，因而在疾病即时诊断与现场 筛查、现场环境监测、食品安全等诸多领域具有非常广阔的商业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为具有圆形样本添加区、圆形反应区和长方形定量区的图案化复合结构的试 纸。
[0016] 图中标记：1-为石錯；2-为滤纸；3-为样本添加区；4-为反应区；5-为定量区。
[0017] 图2为本发明实施例中检测不同浓度过氧化氢的试纸(左）和印迹长度与过氧化 氢浓度之间的校正曲线(右)。
[0018] 图3为本发明实施例中检测不同浓度葡萄糖的试纸(左)和印迹长度与葡萄糖浓度 之间的校正曲线(右)。
【具体实施方式】
[0019] 实施例： 本实施例用于不同浓度过氧化氢样本的免仪器定量分析，具体步骤为： (1)根据图1的示意图，采用激光剪纸法制备具有圆形样本添加区、圆形反应区和长 方形定量区的图案化复合结构的试纸，先将半精炼固体石蜡制作成厚度约为1_的石蜡薄 片，随后将之平放于滤纸表面，进而利用激光雕刻仪将预先设计的图形在设定的参数(雕刻 电流和雕刻速度分别为6mA和20mm/s)下输出至石錯片表面，被激光雕刻的石錯部分受热 熔解，并被相应位置的滤纸吸收，进而在滤纸中冷凝后形成疏水性间隔，最后得到具有样本 添加区、反应区和定量区的图案化复合试纸。
[0020] (2)先在试纸用于固定检测试剂的反应区的亲水性区域滴加 0. 4 μ L浓度为2 mg/ mL的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺的乙醇溶液，室温下干燥，继续在干燥的3, 3'，5, 5' -四甲基 联苯胺表面滴加〇. 4 μ L浓度为lmg/mL的辣根过氧化物酶溶液（10mM磷酸盐缓冲溶液配 制，pH为7)，室温下干燥。
[0021] (3)过氧化氢的免仪器定量分析。在样本添加区滴加1 μ L含有不同浓度的过氧 化氢样本溶液（10mM磷酸盐缓冲溶液配制，pH为7)。样本溶液在毛细管作用下从添加区流 经反应区时，反应区中的辣根过氧化物酶可以催化样本中的过氧化氢与3, 3'，5, 5' -四甲 基联苯胺反应，由此生成的不溶性沉积物导致反应区的疏水性增强。待样本添加区和反应 区溶液干燥后，继续在添加区滴加4 μ L亲水性蓝墨水。当该墨水溶液刚好流到反应区末端 时，使用微量移液器或吸水纸将添加区中多余的墨水移除。
[0022] (4)2分钟后，试纸中的蓝色试剂在定量区中不再流动后，使用带毫米级刻度的直 尺测量定量区中彩色印迹的长度分别为3. 8mm、5. 9 mm、8. 7 mm、10. 7 mm、11.8 mm。画图分 析得到印迹长度与过氧化氢浓度之间的校正曲线(见图2右)。
[0023] 本实施例用于不同浓度葡萄糖样本的免仪器定量分析，具体实施过程如下： (1)采用实施例1中相同的方法制作相同图案化复合结构试纸。具体实施过程同例1。
[0024] (2)先在试纸用于固定检测试剂的反应区的亲水性区域滴加0. 4 μ L浓度为2 mg/ mL的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺的乙醇溶液，室温下干燥。继续在干燥的3, 3'，5, 5' -四甲 基联苯胺表面滴加0.4 μ L浓度为1 mg/mL的辣根过氧化物酶溶液（10 mM磷酸盐缓冲溶 液配制，pH为7)，室温下干燥。继续在辣根过氧化物酶表面滴加1 μ L浓度为0. 01 mg/mL 的葡萄糖氧化酶溶液（10 mM磷酸盐缓冲溶液配制，pH为7)，室温下干燥。
[0025] (3)过氧化氢的免仪器定量分析。在样本添加区滴加1 μ L含有不同浓度的葡萄 糖样本溶液（10 mM磷酸盐缓冲溶液配制，pH为7)。样本溶液在毛细管作用下从添加区流 经反应区时，反应区中的葡糖糖氧化酶将催化葡萄糖生成过氧化氢，而辣根过氧化物酶可 以催化过氧化氢与3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺反应生成不溶性沉积物，进而导致反应区的 疏水性增强。待样本添加区和反应区溶液干燥后，继续在添加区滴加4 μ L亲水性蓝墨水。 当该墨水溶液刚好流到反应区末端时，使用微量移液器或吸水纸将添加区中多余的墨水移 除。
[0026] (4) 1. 5分钟后，试纸中的蓝色试剂在定量区中不再流动后，使用带毫米级刻度的 直尺测量定量区中彩色印迹的长度。样本中葡萄糖的浓度与定量区的彩色印迹长度成反 比。（见图3右)。
【权利要求】
1. 一种用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法，其特征在于具体步骤为： (1) 快速检测试纸的制作：利用滤纸、层析纸、宣纸或硝酸纤维素膜结合现有试纸制作 方法制作快速检测试纸，其结构是疏水性材料与亲水性纸体的图案化复合结构或者是图案 化亲水性纸体，至少包括样本添加区、用于固定检测试剂的反应区和定量区三个连续的部 分； (2) 在用于固定检测试剂的反应区中添加酶和底物； (3) 在添加区中滴加检测样本，当样本流经反应区时，样本中目标分析物或二级分析物 与反应区中添加的酶和底物反应生成不溶性沉积物，导致反应区的疏水性增强，随后滴加 在添加区的3微升至20微升亲水性彩色试剂溶液在毛细管作用下流经反应区并流入定量 区，当达到设定的时间或流经设定的距离时，使用微量移液器或吸水纸将添加区中多余的 亲水性彩色试剂移除； (4) 当试纸中的亲水性彩色试剂在定量区中不再流动后，使用带刻度的直尺测量定量 区中彩色印迹的长度，即完成样本中分析物的快速定量检测； 所述现有试纸制作方法为石蜡打印机印刷法、手工绘图法、机械绘图法、光刻蚀法和激 光剪纸法中的一种； 所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶和碱性磷酸酶中的一种； 所述底物为二甲基联苯胺或四甲基联苯胺。
2. 如权利要求1所述的用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法的应用，其特征在于 该用于快速检测试纸的免仪器定量分析方法应用于尿液、血液、血清、唾液和水液体样本中 目标分析物的定量检测。
【文档编号】G01N33/558GK104215758SQ201410481665
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月20日 优先权日:2014年9月20日
【发明者】张云, 聂瑾芳, 覃举夫, 李静献, 张举 申请人:桂林理工大学