一种基于循环酶法的标记方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于循环酶法的标记方法，技术方案是：以可用循环酶法进行检测的物质作为标记物，标记待检测物的抗原或抗体；本发明还公开了所述标记方法用于血清中低含量抗原或抗体检测的方法及其检测试剂盒。本发明通过循环酶法放大检测的信号，提高待检测物的检测灵敏度；采用基于分光光度法原理的检测方法，仪器设备简单，操作简单、快速，适宜于大面积的推广应用。
【专利说明】
一种基于循环酶法的标记方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学测定分析领域，特别涉及一种基于循环酶法检测底物的标记方法及循环酶法的标记方法在免疫学测定中的应用。
【背景技术】
[0002]自从1961年Lowry OH等应用两种工具酶建立循环酶测定方法：即6_磷酸葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶的催化特性及酶偶联反应的原理，使反应体系中NADP+与NADPH之间循环变化，对循环中生成的大量的6-磷酸葡萄糖酸，用指示酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化，检测终产物NADPH，从而能提高检出能力。ChiMMY等改进Lowry OH酶循环法，即酶双循环法，其操作方法包括待检测样品酶循环、工具酶灭活、加入指示酶双循环及对终产物检测。近些年来酶循环法技术也在不断改进，并作为一种放大反应信号的检测方法被广泛应用于一些低含量样本体外诊断试剂盒的开发中，市面上现有的基于循环酶法的检测试剂盒有总胆汁酸检测试剂盒、同型半胱氨酸检测试剂盒等，此外还有很多基于酶法的检测项目如：腺苷脱氨酶、糖化血红蛋白、单胺氧化酶等项目都是可以用循环酶法进行检测的。
[0003]在人的体液样本中还有一些疾病的标志物，他们的含量很低，但是又不能用循环酶法对其反应信号进行放大用于检测中，而只能用一些更高灵敏度的检测方法学，如：化学发光或者其他分子生物学的检测手段对这些指标实行检测，如：胰蛋白酶原2、甲胎蛋白、胰岛素、生长激素、乙肝病毒等等。但是与基于分光光度法原理的检测方法来说，化学发光法检测试剂盒试剂相对较贵、检测成本相对较高、自动化程度相对低且检测耗时长；分子生物学对实验室要求很严格，且对操作人员的要求极其严格，且需要配备专门的仪器以及特定环境要求的检测实验室，且检测周期相对较长，不利于快速和及时检测，总的来说化学发光检测方法和分子生物学检测方法都要求特殊的检测仪器，且配套的试剂及仪器成本很高，不利于大面积的推广应用。比较而言，常规的基于分光光度法原理的检测方法检测成本低，对设备、人员以及配套的检测环境要求较低，且基于现有的全自动生化及酶联免疫检测方法的普及,可以实现样本的全自动化检测,大大减少了人工成本及实验成本。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种基于循环酶法的标记方法，能够对待检测抗原或抗体的检测信号进行放大，提高待检测抗原或抗体的检测灵敏度。
[0005]本发明的另一目的是以此标记方法为基础，用于低含量物质的免疫学检测，以及结合此标记方法和分光光度法对低含量物质进行检测的试剂盒产品。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0007]一种基于循环酶法的标记方法，以可用循环酶法进行检测的物质作为标记物，标记待检测物的抗原或抗体。
[0008]进一步地，所述标记物为总胆汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脱氨酶、糖化血红蛋白或单胺氧化酶，优选为同型半胱氨酸或总胆汁酸。
[0009]上述的标记方法在血清中低含量抗原或抗体的免疫学检测中的应用，方法如下：
[0010]I)以待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒作为固相载体，与待检测物的样本溶液混匀，反应；
[0011]2)向上述I)溶液中加入标记物标记的待检测物的抗原或抗体溶液,混匀，反应；
[0012]3)对上述2)得到的体系进行分离，洗涤，重悬；
[0013]4)以循环酶法检测方法为基础，对重悬后的溶液进行检测，利用循环酶法检测试剂盒检测标记物的含量，从而间接得出待检测物的含量。
[0014]进一步地，所述磁颗粒是指以四氧化三铁为内核、表面包裹带有氨基、羧基、巯基或其他易于偶联的活性基团的聚合物。
[0015]进一步地,所述磁颗粒直径为5nm_l μ m。
[0016]进一步地，用于血清中低含量抗原或抗体的检测，包括：胰蛋白酶原2、附睾蛋白4、降钙素原、乙肝抗体和HIV抗体。
[0017]利用上述的标记方法检测血清中低含量抗原或抗体的检测试剂盒，包括待检测物的校准品、待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒溶液、浓缩洗涤液、可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液和可用循环酶法检测的底物的检测试剂盒。
[0018]进一步地，所述校准品的原料为标准级，纯度不低于90% ;所述待检测物的抗原为基因工程重组制备的抗原或天然抗原或化学偶联反应得到的抗原，所述待检测物的抗体为单克隆抗体，所述待检测物的抗原和所述待检测物的抗体的纯度不低于95% ;所述浓缩洗涤液为磷酸缓冲液。
[0019]进一步地，所述的可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液的制备方法如下：将待检测物的抗原或抗体于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，向待检测物的抗原或抗体溶液中加入可用循环酶法检测的底物溶液，室温下反应，之后转入透析袋内并于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，加入甘油后于_20°C避光保存备用。
[0020]进一步地，所述待检测物的抗原或抗体与所述可用循环酶法检测的底物的质量比为 1:10-50。
[0021 ] 本发明利用循环酶法标记方法、磁分离方法及现有的生化检测方法作为待检测物检测的通用技术平台。以循环酶法检测的底物标记待检测物的抗原或抗体，通过循环酶法放大底物信号，间接放大待检测物信号；以待检测物的抗原或抗体分子包被的磁颗粒作为捕获试剂，利用磁性分离原理将待检测的样本与反应体系分离。用本发明的技术原理制备出来的检测试剂盒，可结合分光光度法进行检测，可用于检测医学病原微生物、临床疾病诊断标志物、环境分子检测、食品安全检测以及其他各种可基于免疫学反应进行检测的物质。
[0022]本发明具有以下优点：
[0023]I)循环酶法可以放大反应的信号，提高待检测物的检测灵敏度；
[0024]2)采用基于分光光度法原理的检测方法，利用了分光光度法的灵敏度高；仪器设备简单，操作简单、快速；应用范围广等诸多优良特性，适宜于大面积的推广应用；
[0025]3)样本前处理结合磁分离方法可以有效的去除检测样本中的干扰性组分，保证检测结果的准确性和可靠程度。
【具体实施方式】
[0026]本发明实施例提供一种基于循环酶法的标记方法，具体如下：以可用循环酶法进行检测的物质作为标记物，标记待检测物的抗原或抗体。所述标记物为总胆汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脱氨酶、糖化血红蛋白或单胺氧化酶，优选为同型半胱氨酸或总胆汁酸。（待检测物指的是待检测的低含量的抗体或抗原，当待检测物为抗原时，标记物标记的是待检测物的抗体；当待检测物为抗体时，标记物标记的是待检测物的抗原。）
[0027]基于循环酶法的标记方法在血清中低含量抗原或抗体的免疫学检测中的应用，方法如下：
[0028]I)以待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒作为固相载体，与待检测物的样本溶液混匀，反应。当待检测物为抗原时，则用待检测物的抗体包被磁颗粒；当待检测物为抗体时，则用待检测物的抗原包被磁颗粒；所述磁颗粒是指以四氧化三铁为内核、表面包裹带有氨基（NH2-)、羧基（-C00H)、巯基（-SH)或其他易于偶联的活性基团的聚合物，磁颗粒直径为5nm_lμ m。
[0029]2)向上述I)溶液中加入标记物标记的待检测物的抗原或抗体溶液，混匀，反应；
[0030]3)对上述2)得到的体系进行分离，洗涤，重悬；
[0031]4)以循环酶法检测方法为基础，对重悬后的溶液进行检测，利用循环酶法检测试剂盒检测标记物的含量，从而间接得出待检测物的含量。循环酶法生化检测试剂盒检测的是标记物，即可用循环酶法检测的底物，由于是用循环酶法检测的底物标记待检测物的抗体或抗原，所以循环酶法检测的底物与待检测物（即待检测抗原或抗体）之间有对应的关系，循环酶法检测试剂盒放大酶底物的信号，所以间接放大了待检测抗原或抗体的检测信号。可用于血清中低含量抗原或抗体的检测，包括：胰蛋白酶原2、附睾蛋白4、降钙素原、乙肝抗体和HIV抗体检测等各类血清中低含量抗原或抗体物质的检测。
[0032]利用本发明的标记方法检测血清中低含量抗原或抗体的检测试剂盒，包括待检测物的校准品、待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒溶液、浓缩洗涤液、可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液和可用循环酶法检测的底物的检测试剂盒。所述校准品的原料为标准级，纯度不低于90% ;所述待检测物的抗原为基因工程重组制备的抗原或天然抗原或化学偶联反应得到的抗原，所述待检测物的抗体为单克隆抗体，所述待检测物的抗原和所述待检测物的抗体的纯度不低于95% ;所述浓缩洗涤液为磷酸缓冲液。
[0033]可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液的制备方法如下：将待检测物的抗原或抗体于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，向待检测物的抗原或抗体溶液中加入可用循环酶法检测的底物溶液，二者质量比为1:10-50，室温下反应，之后转入透析袋内并于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，加入甘油后于_20°C避光保存备用。将待检测抗原或抗体溶液置于MES缓冲液中透析过夜，使后续的反应在MES缓冲液中进行，保证了反应体系的PH值的稳定；反应体系中过量的循环酶法检测的底物比例保证标记效率和后续产品质量。
[0034]下面详细论述本发明的一种基于循环酶法的标记方法及其用于血清中抗原或抗体的检测。
[0035]实施例一利用本发明的标记方法原理的高灵敏度定量检测血清中胰蛋白酶原2检测试剂盒及其制备和应用
[0036](一 )血清中胰蛋白酶原2检测试剂盒包括：胰蛋白酶原2单克隆抗体包被的磁颗粒溶液、同型半胱氨酸标记的抗体溶液、胰蛋白酶原2定标液、浓缩洗涤液和市售同型半胱氨酸检测试剂盒。
[0037]( 二 )试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0038]I)胰蛋白酶原2单克隆抗体包被磁颗粒溶液的制备：
[0039]磁颗粒洗涤缓冲液的配制：用双蒸水和2-(N_吗啉）乙磺酸（MES)配制pH值为4. 7-5. 0，浓度为 50mmol/ml 的 MES 缓冲液，加入 Tween-20 至终浓度为 O. 15 %，Proclin-300终浓度为O. 1%，然后用O. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后2-8°C保存备用，有效期为2个月。
[0040]工作缓冲液的配制：用双蒸水，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制pH为7. 0-7. 4，终浓度为50mM的磷酸缓冲液，并按照相应的浓度加入以下各种组分：1% PVP, I % BSA, O. 1%Tween-20，3%蔗糖，O. 2% Proclin-300，然后用O. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后于2_8°C保存备用，有效期一年。
[0041]胰蛋白酶原2单克隆抗体包被磁颗粒溶液的制备方法：使用磁颗粒洗涤缓冲液缓冲洗涤磁颗粒（磁颗粒为四氧化三铁为内核，表面包裹带有羧基聚合物，粒径为5nm-lym，购自JSR Corporation)，然后加入终浓度为50mmol/L的EDC和NHS，混匀，并于室温下反应30-60分钟，洗涤3次后加入胰蛋白酶原2单克隆抗体使单克隆抗体与磁颗粒的摩尔比为5:1，然后于室温下反应3小时，加入含有O. 5% BSA的50mM PBS室温封闭30分钟，洗涤5遍，使用工作缓冲液复溶磁颗粒（Img磁颗粒用20ml工作缓冲液复溶)，分装成5ml/支，2-8 °C保存备用。
[0042]2)同型半胱氨酸标记抗体的制备
[0043]同型半胱氨酸标记胰蛋白酶原2抗体的制备方法如下：将抗胰蛋白酶原2的抗体于O. 05mol/L MES缓冲液中于2-8°C透析过夜，后将抗体的浓度调整为2mg/mL，然后以10:1的比例向抗体溶液中加入所需量的同型半胱氨酸溶液，室温下反应30分钟，之后转入分子截留直径为4000-8000的透析袋内并于O. 05mol/L MES缓冲液中于2_8°C透析过夜，加入等体积甘油后于-20°C避光保存备用。
[0044]3)膜蛋白酶原2定标液的制备
[0045]取胰蛋白酶原2纯品（购自R&D Systems, Inc.),然后用牛血清（含0.1%Proclin-300)稀释成 10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml 和 160ng/ml,分装成 Iml/支，-20°C保存备用。
[0046]4)浓缩洗涤液的制备
[0047]用双蒸水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制pH为7. 0-7. 4，终浓度为lmol/L的磷酸缓冲液，加入终浓度为300mmol/L的氯化钠，加入Tween-20终浓度5%，分装成50ml/支2-8 °C保存备用。
[0048]5)试剂盒的组装
[0049]将胰蛋白酶原2单克隆抗体包被的磁颗粒溶液、同型半胱氨酸标记胰蛋白酶原2抗体、胰蛋白酶原2定标液、浓缩洗涤液和检测同型半胱氨酸的试剂盒（购自武汉生之源生物科技有限公司）统一装入一个大试剂盒中，封装，检验合格后入2-8°C冷库保存。
[0050](三）胰蛋白酶原2检测试剂盒检测样本中胰蛋白酶原2的操作流程如下：
[0051]I)在磁性分离器专用反应管（购自西安金磁纳米生物技术有限公司）中加入200ul胰蛋白酶原2单克隆抗体包被的磁颗粒溶液，然后再加入IOul血清样本混匀，室温下反应3分钟；包被磁颗粒的胰蛋白酶原2单克隆抗体与血清样本中的胰蛋白酶原2蛋白免疫反应更彻底，另外过量的胰蛋白酶原2单克隆抗体包被的磁颗粒溶液可以保证完全结合血清样本中的胰蛋白酶原2蛋白，即待检测物。
[0052]2)在上述反应体系中加入200ul同型半胱氨酸标记的胰蛋白酶原2抗体溶液，混匀，室温下反应3分钟；使同型半光氨酸标记的胰蛋白酶原2抗体与血清样本中已经与磁颗粒结合的胰蛋白酶原2蛋白结合，间接与磁颗粒相结合。
[0053]3)将磁性分离器专用反应管放入磁性分离器上对样本进行分离；使反应体系中间接结合磁颗粒的同型半胱氨酸标记抗体和未与磁颗粒间接结合的同型半胱氨酸标记抗体分离，便于后续的检测步骤。
[0054]4)将浓缩洗涤液按照10倍比例稀释，并用500ul稀释后的洗涤液洗涤上述反应管中待检测组分，洗涤完成后，用IOul的双蒸水重悬反应体系；清洗可以去掉附着在反应体系中未与磁颗粒间接结合的同型半胱氨酸标记抗体，用双蒸水重悬反应体系是为了后续反应的进行提供样本。
[0055]5)将步骤4)得出的双蒸水重悬反应体系进行检测，检测方法与市售同型半胱氨酸检测试剂盒的检测方法相同，采用全自动生化分析仪进行，其参数及操作设计参照市售同型半胱氨酸检测试剂盒说明书进行，得出反应体系中间接与磁颗粒结合的同型半胱氨酸标记抗体中同型半胱氨酸的含量，从而得出血清中胰蛋白酶原2的含量。
[0056]6)结果计算，所有的样本及校准品按照同样的操作进行相关的检测实验，根据胰蛋白酶原2定标液的浓度及对应的测试结果绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线以及样本测试的结果换算血清中胰蛋白酶原2的含量。
[0057](四）试剂盒性能测试结果
[0058]经检测，本试剂盒的关键性能指标为：
[0059]灵敏度：0.5ng/ml ；
[0060]批内精密性：<10%;
[0061]批间精密性：<15%;
[0062]准确性：国家标准品检测偏差在± 10 %以内。
[0063]检验结果符合性：使用1000份临床标本，与进口胰蛋白酶原2检测试剂盒进行测试比对,并进行相关性分析,相关系数> O. 975。
[0064]稳定性：不少于12个月，开封后稳定性不少于28天。
[0065]实施例二利用本发明的标记方法原理的高灵敏度定量检测血清中降钙素原检测试剂盒及其制备和应用
[0066](一 )血清中降钙素原检测试剂盒包括：降钙素原单克隆抗体包被的磁颗粒溶液、总胆汁酸标记的抗体溶液、降钙素原定标液、浓缩洗涤液和市售总胆汁酸检测试剂盒。
[0067]( 二 )试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0068]I)降钙素原单克隆抗体包被磁颗粒的制备：
[0069]磁颗粒洗涤缓冲液的配制：用双蒸水和2-(N_吗啉)乙磺酸（MES)配制pH值为4. 7-5. 0，浓度为 50mmol/ml 的 MES 缓冲液，加入 Tween-20 至终浓度为 O. 15 %，Proclin-300终浓度为O. I %，O. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后2-8°C保存备用，有效期为2个月。
[0070]工作缓冲液的配制：用双蒸水，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制pH为7. 0-7. 4，终浓度为50mM的磷酸缓冲液，并按照相应的浓度加入以下各种组分：1% PVP, I % BSA, O. 1%Tween-20，3%蔗糖，O. 2% Proclin-300，然后用O. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后于2_8°C保存备用，有效期一年。
[0071]降钙素原单克隆抗体包被磁颗粒的制备方法：使用磁颗粒（磁颗粒为四氧化三铁为内核，表面带有-NH2聚合物,粒径5nm-l μ m,购自JSRCorporation)洗漆缓冲液缓冲洗漆磁颗粒，然后加入终浓度为50mmol/L的EDC和NHS，混匀，并于室温下反应30-60分钟，洗涤3次后加入降钙素原单克隆抗体使单克隆抗体与磁颗粒的摩尔比为5:1，然后于室温下反应3小时，加入含有O. 5% BSA的50mM PBS室温封闭30分钟，洗涤5遍，使用工作缓冲液复溶磁颗粒（Img磁颗粒用20ml工作缓冲液复溶)，分装成5ml/支，2_8°C保存备用。
[0072]2)总胆汁酸标记抗体的制备
[0073]总胆汁酸标记降钙素原抗体的制备方法如下：将抗降钙素原的抗体于O. 05mol/L MES缓冲液中于2-8°C透析过夜，后将抗体的浓度调整为2mg/mL，然后以50:1的比例向抗体溶液中加入所需量的总胆汁酸溶液，室温下反应30分钟，之后转入分子截留直径为4000-8000的透析袋内并于O. 05mol/L MES缓冲液中于2_8°C透析过夜，加入等体积甘油后于-20°C避光保存备用。
[0074]3)降钙素原定标液的制备
[0075]取降钙素原纯品（购自R&D Systems, Inc.)，然后用牛血清（含0.1%Proclin-300)稀释成 O. 02ng/ml、0. 5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml 和 15ng/ml,分装成 lml/支，-20°C保存备用。
[0076]4)浓缩洗涤液的制备
[0077]用双蒸水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制pH为7. 0-7. 4，终浓度为lmol/L的磷酸缓冲液，加入终浓度为300mmol/L的氯化钠，加入Tween-20终浓度5%，分装成50ml/支2-8 °C保存备用。
[0078]5)试剂盒的组装
[0079]将上述抗体包被的磁微粒工作液、总胆汁酸标记的抗体、降钙素原定标液、浓缩洗涤液和检测总胆汁酸的试剂盒（购自武汉生之源生物科技有限公司）统一装入一个大试剂盒中，封装，检验合格后入2-8 °C冷库保存。
[0080](三）降钙素原检测试剂盒检测样本中降钙素原的操作流程如下：
[0081]I)在磁性分离器专用反应管（购自西安金磁纳米生物技术有限公司）中加入200ul降钙素原单克隆抗体包被的磁颗粒溶液，然后再加入IOul血清样本混匀，室温下反应3分钟；使包被磁颗粒的单克隆抗体与血清样本中的降钙素原蛋白免疫反应更彻底，另外过量的降钙素原单克隆抗体包被的磁颗粒溶液是为了保证完全结合血清样本中的降钙素原蛋白。
[0082]2)在上述反应体系中加入200ul总胆汁酸标记的抗体溶液，混匀，室温下反应3分钟；使总胆汁酸标记的抗体与血清样本中已经与磁颗粒结合的降钙素原蛋白结合，间接与磁颗粒相结合。
[0083]3)将磁性分离器专用反应管放入磁性分离器上对样本进行分离；使反应体系中间接结合磁颗粒的总胆汁酸标记抗体和未与磁颗粒间接结合的总胆汁酸标记抗体分离，便于后续的检测。
[0084]4)将浓缩洗涤液按照10倍比例稀释，并用500ul稀释后的洗涤液洗涤上述反应管中待检测组分，洗涤完成后，用IOul的双蒸水重悬反应体系；清洗的目的是为了去掉附着在反应体系中未与磁颗粒间接结合的总胆汁酸标记抗体，用双蒸水重悬反应体系为后续反应的进行提供样本。
[0085]5)将步骤4)得出的双蒸水重悬反应体系进行检测，检测方法与市售总胆汁酸检测试剂盒的检测方法相同，采用全自动生化分析仪进行，其参数及操作设计参照试剂盒说明书进行，检测反应体系中间接与磁颗粒结合的总胆汁酸标记抗体中总胆汁酸的含量，进而得出血清中降钙素原的含量。
[0086]6)结果计算，所有的样本及校准品按照同样的操作进行相关的检测实验，根据降钙素原标准品的浓度及对应的测试结果绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线以及样本测试的结果换算血清中降钙素原的含量。
[0087](四）试剂盒性能测试结果
[0088]经检测，本试剂盒的关键性能指标为：
[0089]灵敏度：0.5ng/ml ；
[0090]批内精密性：<10%;
[0091]批间精密性：<15%;
[0092]准确性：国家标准品检测偏差在± 10 %以内。
[0093]检验结果符合性：使用1000份临床标本，与进口降钙素原检测试剂盒进行测试比对，并进行相关性分析，相关系数> O. 975。
[0094]稳定性：不少于12个月，开封后稳定性不少于28天。
[0095]最后所应说明的是，以上【具体实施方式】仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种基于循环酶法的标记方法，其特征在于:以可用循环酶法进行检测的物质作为标记物，标记待检测物的抗原或抗体。
2.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于:所述标记物为总胆汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脱氨酶、糖化血红蛋白或单胺氧化酶，优选为同型半胱氨酸或总胆汁酸。
3.权利要求1或2所述的标记方法在血清中低含量抗原或抗体的免疫学检测中的应用，其特征在于方法如下: 1)以待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒作为固相载体，与待检测物的样本溶液混匀，反应； 2)向上述I)溶液中加入标记物标记的待检测物的抗原或抗体溶液,混匀，反应； 3)对上述2)得到的体系进行分离，洗涤，重悬； 4)以循环酶法检测方法为基础，对重悬后的溶液进行检测，利用循环酶法检测试剂盒检测标记物的含量，从而间接得出待检测物的含量。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述磁颗粒是指以四氧化三铁为内核、表面包裹带有氨基、羧基、巯基或其他易于偶联的活性基团的聚合物。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述磁颗粒直径为5nm_lμ m。
6.权利要求3所述的应用，其特征在于:用于血清中低含量抗原或抗体的检测，包括:胰蛋白酶原2、附睾蛋白4、降钙素原、乙肝抗体和HIV抗体。
7.利用权利要求1或2所述的标记方法检测血清中低含量抗原或抗体的检测试剂盒，其特征在于:包括待检测物的校准品、待检测物的抗原或抗体包被的磁颗粒溶液、浓缩洗涤液、可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液和可用循环酶法检测的底物的检测试剂盒。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于:所述校准品的原料为标准级，纯度不低于90% ;所述待检测物的抗原为基因工程重组制备的抗原或天然抗原或化学偶联反应得到的抗原，所述待检测物的抗体为单克隆抗体，所述待检测物的抗原和所述待检测物的抗体的纯度不低于95% ;所述浓缩洗涤液为磷酸缓冲液。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于:所述的可用循环酶法检测的底物标记的待检测物的抗原或抗体溶液的制备方法如下:将待检测物的抗原或抗体于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，向待检测物的抗原或抗体溶液中加入可用循环酶法检测的底物溶液，室温下反应，之后转入透析袋内并于MES缓冲液中2-8°C透析过夜，加入甘油后于-20°C避光保存备用。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于:所述待检测物的抗原或抗体与所述可用循环酶法检测的底物的质量比为1:10-50。
【文档编号】G01N33/577GK104297492SQ201410571282
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】沈鹤霄, 华权高 申请人:沈鹤霄