一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种家畜疫病感染与免疫的鉴别检测器具，特别是涉及一种猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，检测膜上含有强毒检测线T1“│”，弱毒检测线T2“│”和质控线C“│”印迹。鉴别检测时，在检测膜显现三条红色条带“│││”为猪瘟强毒感染，两条红色条带“││”为猪瘟弱毒疫苗免疫，只显现一条红色条带“│”为猪瘟病毒阴性。本鉴别检测试纸特异性强，敏感性高，反应谱广，可检测现有弱毒疫苗株和和多数流行强毒株，且操作简便、快速，可广泛用于猪瘟病毒感染与免疫的鉴别检测，易于在生产实践中推广应用。
【专利说明】一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种家畜疫病感染与免疫的鉴别检测器具，特别是涉及一种猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸。
【背景技术】
[0002]猪痕(￠13881(^18^111603？)是由猪痕病毒(。1^881 8^1116 ？6乂61~
08^)引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的高度接触性传染病，世界动物卫生组织(012)将其列入012疫病名录，为须申报的动物传染病，我国列为一类动物疫病。我国采用免疫猪痕兔化弱毒(1108 0^10161-8 1^111126(1妨⑶1116，)疫苗预防和控制了08？的大规模流行，但近年来的流行和发病特点又发生新变化，多表现为非典型、慢性和隐性感染，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，仍是危害养猪业的主要传染病之一。031^属于黄病毒科(/?痕病毒属与同属的牛病毒性腹湾病毒1型(130^1116 (1181-1-1168 ^11~118 1，8707-1 )、牛病毒性腹湾病毒2型(8^1)7-2)5 绵羊边界病毒()301^61 (1186886807)和长颈鹿痕病毒(0681: 1 0？
具有很高的同源性，并存在血清学交叉反应。基因组为单股正链I？嫩，大小约 1.23 ,104 打七，由 5’端非编码区〔5’-11111:1^118181:6(1 1-0^1011, 5，-11丁10、一个开放阅读框(0^)611 1-68(1111? '肅6，0尺？)和3，-端非编码区〔3’ -17110构成，且5 ’端无甲基化“帽子”结构，3’端无多聚腺苷酸(即匕八)结构。该大的0即编码约3899个氨基酸残基的多聚蛋白前体，由病毒和宿主细胞蛋白酶加工形成12种成熟的病毒蛋白，即匕矿'21和￡2等4种结构蛋白和^。、？7、吧2、吧3、吧4六、吧48、吧5八和^858等8种非结构蛋白。依据5，-爾、￡2和吧58基因序列差异，分为3个基因群，10个基因亚群，即1.1,1.2,1.3,2.1,2.2、2.3,3.13.23.3^3.40流行病学调查显示，我国2000年后的流行毒株分为3个基因亚群，即1.1^2.1和2.2，其中2.1基因亚群在我国猪瘟流行中占主导地位。
[0003]目前，我国猪瘟的防控仍然采取以疫苗免疫为主的策略，疫苗是我国上世纪五十年代研制的世界公认的优良疫苗，安全性好、免疫原性好、遗传性状稳定，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，可对不同基因亚群(1.1-3.4亚群)产生免疫保护，但是由于缺乏血清学标志和配套的鉴别诊断方法，其在我国的大规模应用，使得通过抗体检测很难区分免疫弱毒和野毒感染，不利于的净化。随着不同来源、不同地区野毒株和疫苗毒株全基因序列的完成和分子生物学检测技术的发展，国内外学者在鉴别检测方面进行了大量研究，通过分析基因组的强、弱毒株特征性位点，以5’ 吧58或3’ 保守序列为检测靶点，分别设计强、弱毒株特异性引物或探针，建立了区分野毒和兔化弱毒疫苗的多重或套式奶士⑶、双重或复合荧光定量奶士⑶等分子鉴别检测方法，具有较高的敏感性和特异性，但这些检测方法需要依赖于仪或荧光定量仪，存在操作相对繁琐、耗时较长、检测成本高等不足，限制了其在流行病学调查和兽医临床中的应用。免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，是理想的即时检测1:681:, ？001)和现场检测技术，其具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1-5分钟内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸，已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一。河南省动物免疫学重点实验室从1995年开始系统开展免疫试纸快速检测技术研究，率先在国际上研制成功动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品一一鸡传染性法氏囊病快速诊断试纸和猪旋毛虫抗体检测纸，建立了动物疫病快速检测试纸研发技术平台，截至目前已成功开发出动物疫病抗原、抗体以及药物残留检测等系列快速检测试纸产品，大大推动了该技术的应用和发展。本发明针对野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的关键技术问题，筛选鉴定可区分强、弱毒株的高亲和力配对单克隆抗体，建立基于免疫层析试纸的蛋白芯片技术平台，研制猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸，建立适用于养殖基层和临床检测的快捷、简便的猪瘟野毒感染和疫苗免疫联检技术，实现对猪瘟病毒野毒感染的实时监测，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对猪瘟疫情监测和防控有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:研制适用于猪瘟感染与免疫鉴别检测的猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
[0005]本发明的技术方案是:一种猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，金标垫为吸附胶体金标记抗猪瘟病毒单克隆抗体111^1的玻璃纤维，检测膜为印迹强毒检测线I1、弱毒检测线12和质控线(:的硝酸纤维素膜，由样品端至手柄端的排列为强毒检测线11/弱毒检测线！'2/质控线| | |”，强毒检测线丁1为抗猪瘟病毒单克隆抗体111^2印迹“ | ”，弱毒检测线！'2为抗猪瘟病毒多克隆抗体1)仙1或抗猪瘟病毒单克隆抗体印迹“ | ”，质控线为抗小鼠I姊抗体？仙2或金黄色葡萄球菌3？八印迹“ | ”。鉴别检测时，猪瘟强毒感染在检测膜显现强毒检测线II，弱毒检测线丁2和质控线三条红色条带“ I | | ”，猪瘟弱毒疫苗免疫在检测膜显现弱毒检测线！'2和质控线〇两条红色条带“ | | ”，无猪瘟病毒则只显现质控线一条红色条带“丨”。
[0006]以猪瘟病毒标准强毒石门株为免疫抗原，通过杂交瘤细胞技术生产鉴定抗猪瘟病毒单克隆抗体，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(1？心0筛选区分猪瘟病毒强毒和弱毒的单克隆抗体，以叠加酶联免疫吸附试验筛选识别不同抗原表位的单克隆抗体。用于胶体金标记的单克隆抗体111^1和弱毒检测线12的单克隆抗体!11^3均特异识别猪瘟病毒强毒株和弱毒疫苗株，分别识别猪瘟病毒的不同抗原表位，用于强毒检测线12的单克隆抗体!11^2特异识别猪瘟病毒强毒株，但不与弱毒株反应。同时，以I？嫩筛选与猪瘟病毒反应谱广的单克隆抗体，胶体金标记单克隆抗体―化和弱毒检测线12单克隆抗体!11^3可识别猪瘟病毒弱毒疫苗以及多数流行强毒株，强毒检测线II单克隆抗体可识别多数猪瘟病毒流行强毒株。以猪瘟病毒弱毒疫苗株为免疫抗原制备抗猪瘟病毒多克隆抗体￠1八61，可用于弱毒检测线12印迹。以小鼠1亦为免疫抗原制备羊抗小鼠多克隆抗体^2, ^2和金黄色葡萄球菌3？八均可用于质控线印迹。
[0007]本发明有益的积极效果，猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸实现了猪瘟病毒强毒和弱毒的同步联检，可有效鉴别猪群猪瘟强毒感染与疫苗免疫，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。检测试纸条具有下列各项优点:
(1)强毒和弱毒联检。猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸在检测膜上含有识别猪瘟病毒强毒和弱毒的弱毒检测线和识别强毒但不识别弱毒的强毒检测线，可同步进行猪瘟病毒的强毒株和弱毒株联检，实现猪瘟的强毒和弱毒鉴别检测。
[0008](2)特异性强，敏感性高。猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸以可区分猪瘟病毒强毒和弱毒的高亲和力配对单克隆抗体为基础制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对标记抗体的反应性影响很小，且具有较高的标记率。因此，鉴别检测试纸具有较高的特异性和敏感性。
[0009](2)操作简便快速。使用鉴别检测试纸时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。
[0010](3)显示检测结果形象、直观准确。鉴别检测试纸以显示红棕色“ | ”、“ | | ”和“丨| | ”印迹作为检测的阴性、弱毒和强毒阳性标记，即在检测膜上显示一条棕红色条带“ | ”为猪瘟病毒阴性，表示被检测样品无弱毒疫苗或强毒感染，两条棕红色条带“ | | ”为猪瘟病毒弱毒阳性，表示被检样品为弱毒疫苗免疫，三条棕红色条带“ I | |”为猪瘟病毒强毒阳性，表示被检样品为强毒感染，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
[0011](4)成本低，投资少。使用鉴别检测试纸，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
[0012]【专利附图】
【附图说明】下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0013]图1是猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸侧视结构示意图。
[0014]图2是猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸俯视结构示意图。
[0015]图中，1.支撑板，2.样品垫，3.金标垫，4.检测膜，5.吸水垫，6.强毒检测线II印迹，7.弱毒检测线12印迹，8.质控线样品端保护膜，9-2.手柄端保护膜，10.标记线。
[0016]【具体实施方式】猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸可广泛应用于猪群猪瘟病毒强毒感染和疫苗免疫的鉴别检测。制备猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸，首先需制备猪瘟病毒免疫抗原，进而制备抗猪瘟病毒多克隆抗体和单克隆抗体，并筛选区分猪瘟强毒和弱毒的单克隆抗体，识别猪瘟强毒和弱毒的单克隆抗体111^1用于制备胶体金标记物，识别猪瘟强毒而不识别弱毒的单克隆抗体111^2用于印制强毒检测线印迹“ | ”，识别猪瘟强毒和弱毒的多克隆抗体？仙1或单克隆抗体!11^3用于印制弱毒检测线印迹“ | ”，其次需制备羊抗小鼠I姊抗体或金黄色葡萄球菌3？八，用于印制质控线印迹“ | ”。
[0017](1)猪瘟病毒免疫抗原的制备。
[0018]以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞$1(-15),48-60小时收取病毒培养液，41 3000 170111低速离心30 111111去除杂质，利用50 超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以4 ？881: 琼脂糖凝胶柱对猪痕病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量达10—7以上，荧光定量？⑶测定纯化病毒拷贝数达101°以上。
[0019](2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备。
[0020](2.1)杂交瘤细胞株的建立。
[0021]将猪瘟病毒免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50 ^-100 11^/只免疫8从8八系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5-100111，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000 1-/111111离心10 111111,收集脾细胞；将1 X 108的脾细胞与2-5 X 107的$2/0骨髓瘤细胞混合，1000 17111111 离心 10 111111，弃上清，在 37。〇的水浴中将0.7-1 1111 的 40%-50% ？26 4000(邱8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育1 -11后，缓慢加入无血清1640培养基15 ^1,以终止？％的作用，371水浴5-10 111111,1000离心10 -11,弃上清，将细胞重悬于拟I选择培养基中，并加入96孔培养板(100 1111-200 5% (?培养箱中培养。培养7-10天后，取杂交瘤细胞培养上清以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验(工?嫩)筛选阳性杂交瘤细胞。以猪瘟病毒标准强毒石门株感染猪肾细胞$1(-15),经甲醇固定后，5%脱脂奶371封闭1卜；加待检细胞培养上清5011117孔，设撤I培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加1:500辣根过氧化物酶(册?)标记羊抗小鼠1^^^(50此/孔),371作用30 111111 ；每步反应后均用含0.05% 1^6611-20的？83充分洗涤；以底物仙室温显色10-20 111111，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株8株。
[0022](2.2)单克隆抗体的制备:以体内诱生腹水制备单抗。取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产此化八小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞107个/只，7 (1?10 (1后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
[0023](2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验(斤嫩)测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的211“效价分别在1:640和1:105以上，I？嫩效价分别在1:16和1:1600以上。
[0024](2.3.2)单克隆抗体的特异性
用标准毒株石门株、流行毒株和弱毒疫苗株株感染猪肾细胞(91(-15),以免疫过氧化物酶单层细胞试验(斤嫩)测定单抗与流行毒株的反应性，筛选获得同时特异识别标准毒株、流行毒株和弱毒疫苗株的单克隆抗体6株，而特异识别标准毒株和流行毒株但不识别弱毒疫苗株的单克隆抗体2株。以免疫过氧化物酶单层细胞试验(^)检测上述8株单克隆抗体与疫苗株和流行毒株的反应谱，证明用于胶体金标记和弱毒检测线12的单克隆抗体可识别猪瘟病毒弱毒疫苗以及多数流行强毒株，用于强毒检测线的单克隆抗体可识别多数猪瘟病毒流行强毒株，均具有较广的反应谱。
[0025](2.3.3)单克隆抗体识别抗原表位分析
以阻断2口“或叠加2口“对单克隆抗体识别的抗原表位进行分析，筛选获得分别识别猪瘟病毒不同抗原表位的单克隆抗体111^1和111^3，其分别用于胶体金标记和弱毒检测线12印迹；获得特异识别猪瘟病毒标准毒株和流行毒株，而不与弱毒疫苗株反应的单克隆抗体111^2，用于强毒检测线II印迹。
[0026](2.3.3.1)阻断:以！II？？分别标记单克隆抗体，￡118^阻断试验鉴定单克隆抗体识别抗原表位的特异性，首先在￡0-22重组蛋白包被的酶标板中逐行加入未标记的单抗，设阳性血清和？83对照，371作用1卜；然后逐列加入！！！？？标记的单抗，371作用1
11；以底物118进行显色，读取各检测孔的0045。值。显著抑制酶标单抗结合的未标记单抗识别相同或相近的抗原表位，而对酶标单抗结合无明显影响的未标记单抗则识别不同的抗原表位。
[0027](2.3.3.2)叠加此:首先利用包被抗原的酶标板以间接此13八测定各单抗的工作浓度，绘制抗原饱和曲线。在叠加试验中，根据抗原饱和曲线适当稀释单抗，并配对加入酶标板各孔，371孵育1卜?2 1！；分别加入酶标二抗和118进行显色，读取各孔0045。值，按下列公式计算叠加系数(八1)41=0,00^/ (00^+01)2)-1] 400%，其中00^为配对单抗孔的0045。值，00^和002为两个独立单抗孔的0045。值。两个单抗的八I值小于40%判为识别相同或相近抗原表位；八1值大于40%判为识别不同抗原表位。
[0028](2.4)单克隆抗体的纯化:以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗1姊。取1此小鼠腹水，加入2 1111 0.06 11101/1乙酸钠缓冲液(邱5.0),以0.1 11101/1抝1调至邱4.5 ；于室温搅拌下，逐滴加入33 辛酸，41静置2卜，15000 1-/111111离心30 111111,弃沉淀；在离心上清中加入1/10体积0.01 11101/1 ？88 (邱7.4),以0.1 11101/1恥0！1调至邱7.4 ；于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45%，41静置2 11,10000 离心30 ―!!，弃上清；以适量？83重悬沉淀，对？83透析过夜，换液3次。以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法
法)测定纯化单克隆抗体1亦的蛋白含量在11118加1以上，以酶联免疫吸附试验(￡118^)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(斤嫩)测定小鼠腹水和纯化I姊的抗体效价在1:105和1:1000以上，分装，冻存。
[0029](3)抗猪瘟病毒多克隆抗体的制备。
[0030]以50 ^100体重的猪瘟弱毒疫苗经肌肉注射免疫健康仔猪3?4次，末次免疫10天后，静脉采血，以I？嫩测定其血清抗体效价在1:1000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清，以无水硫酸钠提取免疫猪血清I姊，取1份免疫血清加2份0.01 001/1 983(^7.2)混合，加入无水似2304 至终浓度 18%，37。〇水浴 300111，4000 1-/111111离心20111111，弃上清，以适量？83 (邱7.2)重悬沉淀，加终浓度16%的似2304，371沉淀30-11,40001-/111111离心20-11，弃上清，再以适量？83 (^7.2)重悬沉淀，以终浓度14%的似2304沉淀，400017^111离心200111，弃上清，以适量？83 (^7.2)重悬沉淀，对？83 (^7.2)过夜透析，换液2?3次，测定抗体效价和蛋白浓度(10-20呢/“),所制备抗猪瘟病毒多克隆抗体？仙1可用于检测试纸弱毒检测线12印迹的印制。
[0031](4)兔抗小鼠I姊多克隆抗体的制备
以纯化小鼠I姊免疫2.0 1?左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射50 1118/只，每次加强免疫间隔3 ^以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2 V后，以琼脂扩散试验(八⑶)测定免疫血清抗体效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠1姊，方法同(2.4)单抗纯化，辛酸用量为45 01/1111血清，测定抗体效价和蛋白浓度(10-20呢加1),所制备兔抗小鼠I姊多克隆抗体？仙2可用于检测试纸质控线印迹的印制。
[0032](5)单克隆抗体的胶体金标记 (5.1)胶体金的制备:取100 III[超纯水置于500此洁净的锥形瓶，加入1此1 % (界/V〉氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1此1% ^八)柠檬酸钠溶液，煮沸约3111111至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2 111111 ；待溶液凉至室温，补超纯水至100此，以0.2 11101/1 1(?调邱至9.0，41避光可保存数月。
[0033](5.2)最适标记蛋白浓度测定:取待标记抗单抗I姊对20 1^01/1硼酸钠溶液(邱8.0)41过夜透析。在微孔板中以25此超纯水1:2,1:4,1:8……倍比稀释待标记
单抗；各孔加入125此胶体金溶液，奶'静置5 0111 ；加入125此1 001/1 ^01溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20%。
[0034](5.3)单克隆抗体的胶体金标记:取2 1111最适蛋白浓度的待标记单抗1亦，加入10 III[胶体金溶液(邱9.0),迅速混匀，室温作用10 111111?15 111111 ；加入1/10体积含10%(界八)牛血清白蛋白(83八)的20臟017[硼酸钠溶液，迅速混勻，尺I'作用10 111111?15 111111 ；400 15000 8离心300111，小心移去上清；以含1% (^)88^的20硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心，弃上清；重复洗漆1次，以1此含1% (.^/^) 88^的2011111101/1硼酸钠溶液重悬胶体金，41保存备用。
[0035](6)检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5X30挪2的长条，置于02 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用？83 7.2)将特异识别猪瘟病毒强毒株但不与弱毒株反应的单抗、特异识别猪瘟病毒强毒株和弱毒疫苗株的单抗或多抗I姊和兔抗鼠I姊稀释至1 1118/1^，并分别放于贮存池；利用810』的011811^1 3000以1此/挪分别将抗单抗或多抗I姊溶液和兔抗鼠I姊溶液喷点于检测膜中央，形成强毒检测线I1、弱毒检测线12和质控线印迹，检测线与质控线相距0.5111111或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂41密闭保存备用。
[0036](7)结合垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 01112的长条，置于02 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取1
III[胶体金标记物加入2 III[含2% (界八)83八、3% (界八)鹿糖、0.6 11101/1 ^801^0.2% 1^661120 (乂八)和0.1% (界八)叠氮钠的20皿01凡硼酸钠溶液(邱如册七土3000以15此/挪将抗胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置501干燥箱30 111111干燥；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂41密闭保存备用。
[0037](8)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 01112的长条，以将含0.1 11101/1 ^01,0.2% I'概11 20 (乂八)和
0.1% (^)叠氮钠的？83 (邱7.2)溶液浸泡玻璃棉条；置50。〇干燥箱30 111111干燥；将样品垫置塑料袋，加干燥剂奶密闭保存备用。
[0038](9)吸水垫的制备
将玻璃棉切成2.5X30 01112的长条，将吸水垫置塑料袋，加干燥剂奶密闭保存备用。
[0039](10)支撑板的制备
将双面胶贴于支撑板，切成7.5 X 30 01112的长板，制备支撑板。
[0040](11)试纸的组装
利用115000试纸装配仪或手工将上述材料装配成试纸板。先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将胶金垫和样品垫依次粘贴于检测膜的样品端，各层间重叠1皿?2皿，再将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠1皿?2皿，在样品端以白色塑胶膜包裹样品垫和胶金垫，塑胶膜上印有检测方向及检测溶液上限标记，在手柄端以蓝色塑胶膜包裹吸水垫。
[0041](12)切割与包装
利用014000切割仪将装配好的试纸板切成0.3挪的试纸条，将试纸条分装入塑料袋，加干燥剂41密闭保存。
[0042]( 13)猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸的实施结构
参见图1，图2，图中，1为支撑板用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2，3，4，5，组合而成，从样品端2开始，到手柄端5依次粘贴在支撑层1上面；其中2为样品端样品垫，实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附胶体金标记识别猪瘟病毒强毒和弱毒株单克隆抗体!11^31的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉，简称为金标垫，4为检测膜，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水垫，采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8挪，宽度0.4 为用特异识别猪瘟病毒强毒株但不与弱毒株反应的单克隆抗体111^2在硝酸纤维素膜上印制的强毒检测线印迹“ I ”，7为特异识别猪瘟病毒强毒株和弱毒疫苗株的单克隆抗体!11^3或抗猪痕病毒多克隆抗体？仙1在硝酸纤维素膜上印制的弱毒检测线印迹“ I ”，8为兔抗小鼠I亦多克隆抗体？仙2或金黄色葡萄球菌3？八在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“ | ”，在检测膜上的强毒检测线印迹、弱毒检测线印迹和质控线印迹组合排列为“ I I I”。9为保护膜，覆盖在玻璃棉及金标玻璃棉的保护膜为9-1，覆盖在吸水层滤纸上的保护膜为9-2。在玻璃棉和金标玻璃棉交界处对应位置的白色保护膜上偏向玻璃棉一方0.5挪处的保护膜上印有一条标记线10，在标记线10右边印有箭头和字样，手柄端保护膜可用黄色或其它颜色，2，3，4，5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。
[0043]( 14)猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸实施检测反应原理
当猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检抗原及金标抗体―化一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中金标抗体111^1与待检强毒株或弱毒株抗原相结合，形成金标抗体-抗原复合物，08^强毒株的金标复合物可同时与检测膜上的强毒检测印迹111^2和弱毒检测印迹!11^3结合，生成红棕色“ | | ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的？仙2或3？八，生成红棕色标记“ | ”，两种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“ I I I ”，表示样品中含有猪瘟强毒；而疫苗毒株的金标复合物不能与检测膜上的强毒检测印迹111^2结合，只能与弱毒检测印迹111^3结合，生成红棕色“ I ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的？仙2或？“，生成红棕色标记“ | ”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“ I I ”，表示样品中只含有猪瘟疫苗毒；当样品中不含猪瘟病毒抗原时，没有金标抗体-抗原复合物形成，不能与强毒检测印迹和弱毒检测印迹结合，则生成阴性标记“ I ”。如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
[0044](15)猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸检测实例操作方法
(15.1)检测样品溶液的制备:采集待检猪拭子(咽拭和肛拭?、病(死)猪组织、粪便和疫苗等不同检测样本，加适量？83或水进行简单混悬或研磨
(15.2)试纸检测:将猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸样品端浸入待检溶液108?20 8 ；取出试纸水平放置5 111111?10 111111观察结果。
[0045](15.3)检测结果判定:试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、弱毒检测线和质控线)“I | I ”为⑶^强毒阳性，表示待检样品中含有强毒抗原；两条红棕色条带(弱毒检测线和质控线)“ I I ”为弱毒阳性，表示待检样品中含有疫苗毒抗原；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为阴性，表示待检样品未检出抗原；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0046]实施例一，猪瘟强毒感染快速诊断，采集病(死)猪的病变组织，包括肺、肝、脾、肾、气管、小肠、大肠和淋巴结等，以1:5或1:10加适量？83或水进行简单研磨，制备待检溶液，以猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，鉴别诊断病(死)猪强毒感染或疫苗免疫。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、弱毒检测线和质控线)“ I | I ”为强毒阳性，表示待检猪为强毒感染；两条红棕色条带(弱毒检测线和质控线)“ I I ”为弱毒阳性，表示待检猪为疫苗免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线I ”为阴性，表示待检猪无强毒感染或疫苗免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0047]实施例二，生猪的猪瘟病毒检验检疫，采集生猪拭子(咽拭和肛拭)或粪便，以1:5或1:10加适量？83或水进行简单混悬，制备待检溶液，以猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，鉴别检测生猪的强毒污染或疫苗免疫情况。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、弱毒检测线和质控线)“ I I I ”为强毒阳性，表示待检生猪或环境为强毒污染；两条红棕色条带(弱毒检测线和质控线)“| | ”为08^弱毒阳性，表示待检生猪或环境无强毒污染，为疫苗免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线I ”为阴性，表示待检生猪无强毒感染或疫苗免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0048]实施例三，猪瘟弱毒疫苗的质量检测，以1:5或1: 10加适量？83或水溶解猪瘟弱毒活疫苗，包括乳兔苗、细胞苗和淋脾苗等，制备待检疫苗溶液，以猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，检测猪瘟弱毒疫苗的病毒含量和鉴别检测疫苗的强毒污染情况。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、弱毒检测线和质控线)“ I I I ”为强毒阳性，表示待检疫苗为强毒污染；两条红棕色条带(弱毒检测线和质控线)“ I I ”为弱毒阳性，表示待检疫苗无强毒污染，弱毒检测线的显色强度与疫苗含量成正比；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为阴性，表示待检疫苗无强毒污染，同时也不含疫苗毒；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
【权利要求】
1.一种猪瘟病毒强毒和弱毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，其特征是:金标垫吸附胶体金标记抗猪瘟病毒单克隆抗体mAbl，检测膜的强毒检测线Tl为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2印迹“ I ”，弱毒检测线T2为抗猪瘟病毒多克隆抗体pAbl或单克隆抗体mAb3印迹“ I ”，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA 印迹“ I ”。
2.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸，其特征是:猪瘟强毒感染时在检测膜显现强毒检测线Tl，弱毒检测线T2和质控线C三条红色条带“ I I I ”，猪瘟弱毒疫苗免疫时在检测膜显现弱毒检测线T2和质控线C两条红色条带“ I I ”，无猪瘟病毒则只显现质控线C 一条红色条带“ I ”。
3.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸，其特征是:单克隆抗体mAbl和mAb3均特异识别猪瘟病毒强毒株和弱毒疫苗株，分别识别猪瘟病毒的不同抗原表位，单克隆抗体mAb2特异识别猪瘟病毒强毒株，但不与弱毒株反应。
4.根据要求I或3所述的鉴别检测试纸，其特征是:鉴别检测试纸的猪瘟病毒反应谱广，弱毒检测线T2可检测猪瘟兔化弱毒(HCLV)以及多数流行强毒株，强毒检测线Tl可检测多数猪瘟病毒流行强毒株，可实现对猪瘟病毒主要流行毒株与疫苗株的鉴别检测。
【文档编号】G01N33/569GK104407137SQ201410763168
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】郭军庆, 邢广旭, 王丽, 孙亚宁, 杨继飞, 杨艳艳, 郅玉宝, 柴书军, 李青梅, 王瑞宁, 邓瑞广, 张改平 申请人:河南省农业科学院