一种测定婴幼儿配方奶粉中OPO结构酯Sn-2位脂肪酸的检测方法与流程

背景技术：

母乳是公认的婴儿生命初期最理想的食物，其中的脂肪不仅为婴儿提供50％以上的能量，而且是神经等机体组织组成成分的重要来源。母乳脂肪中的脂肪酸具有高度特异性的位置分布，不仅含有大量的棕榈酸(C16：0)，而且棕榈酸大约70％酯化在三酰甘油的sn-2位，同时，油酸和亚油酸优先酯化在sn-1，3位置。婴儿配方奶粉是目前母乳的最佳替代品。但常用于婴儿配方奶粉的油脂配料中，如牛乳脂肪和植物油，棕榈酸主要酯化在sn-1和sn-3位，在sn-2位上的则很少。母乳脂肪的脂肪酸在甘油骨架上位置分布非常特殊，该特殊构型会显著影响脂肪酸和其他营养素的吸收。植物脂肪不能够替代人乳汁脂肪。其原因不在于脂肪酸的类型，而是脂肪酸在甘油三酯中的精确位置。棕榈酸在成熟乳脂肪酸中约含有20-25％，其中约70％分布在三酰甘油的sn-2位点，母乳脂中的其他脂肪酸如硬脂酸、油酸(18∶1)、亚油酸等主要分布在sn-1，3位，其中油酸是主要的单不饱和脂肪酸(30-38％)。而牛乳的三酰甘油在肠道内被脂肪酶水解时，位于sn-1，3位置上的棕榈酸被分解为游离脂肪酸，易与肠道内的矿物质，容易导致能量和钙的双重流失，并容易使婴儿形成便秘。母乳三酰甘油类型主要为USU(S指饱和脂肪酸，U指不饱和脂肪酸)，如OPO(大于50％)和OPL等(O指油酸，P指棕榈酸，L指亚油酸)。OPO(1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯)结构脂是通过酯交换反应或酸解反应改变普通配方奶粉油脂原料中棕榈酸的位置，使之被酯化到甘油主链上的sn-2位置上，油酸主要酯化在sn-1，3位置上，生成OPO母乳模拟脂肪。

本发明采用Bligh-Dyer提取法提取脂肪，将提取后的脂肪样品划在硅胶板上，经薄层色谱分离，取纯化的甘油三酯样品进行Sn-2单甘油酯的分离，加入氢氧化钠-甲醇溶液进行皂化，再加入三氟化硼甲醇溶液进行甲酯化反应，加入正庚烷提取，经0.45μm有机滤膜过滤。待测物经SP-2560毛细管色谱柱分离，氢火焰离子化检测器(FID)检 测，外标法定量。本方法既能定性又能定量，精确度好、效率高，能够满足目前市场对婴幼儿配方奶粉中OPO结构酯Sn-2位脂肪酸评价要求，有较大的市场潜力。

技术实现要素：

本发明主要是用气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中OPO结构酯Sn-2位脂肪酸的检测，能很好地解决婴幼儿配方奶粉的评价要求。

本发明公开了一种气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中OPO结构酯Sn-2位脂肪酸的检测的方法，包括下列步骤：

(1)试样制备(脂肪提取)：采用Bligh-Dyer提取法，量取5g奶粉于50mL塑料离心管中，加入5mL水，涡旋溶解混匀，加入10mL甲醇、10mL三氯甲院，40℃充分振荡30min，取出后以5000r/min离心3min，分液，用一次性吸管吸取下层溶液，过滤(装有0.45μm有机滤膜头的针管中加入2g无水硫酸钠)，然后用氮气吹干；

(2)三酰甘油的分离：量取30-40mL展开剂(正已烷+乙醚+98％甲酸＝70+30+1)倒入玻璃层析缸中，盖上盖子放置0.5-1h，使层析缸中的展开液蒸气达到饱和。在硅胶G板上点样，先在离板底部2cm处用铅笔划一条直线，作为点样基线；用毛细管将提取后的脂肪样品划在硅胶板上(划在板上的目的是为了得到更多的分离产物)。点样完毕，将板置于通风处，放至溶剂完全挥发，再将薄层板放入展开缸中，点样端在下，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5-1.0cm，盖上玻璃盖；待展开液扩展至离上板边缘约1-1.5cm处时，取出层析板，用铅笔在展开液前沿画线，待板上的展开液挥发完全，用2％的2′，7′-二氯荧光素，喷雾显色，画出Rf＝0.69的三酰甘油谱带，用微型刮铲刮下置于10mL塑料管中；收集的硅胶中加入5mL无水乙醚，涡旋混匀，将上层乙醚转移至50mL离心管中，重复提取共三次，合并乙醚层，过0.45μm滤膜，氮吹吹干；

(3)Sn-2单甘油酯的分离：取0.1g纯化的甘油三酯样品置于10mL塑料管中(若室温下试样不是液体，将塑料管置于60℃-65℃的水浴锅内，使之液化后即取出)，向已液化的试样中加入预先称重的约20mg的胰脂肪酶和2mL Tris-HCl缓冲溶液(1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液，用6mol/L的盐酸调节至pH＝8)，小心摇动；然后加入0.5mL胆 酸钠溶液，0.2mL氯化钙溶液，盖上离心管盖，涡旋混匀后，立即将塑料管置于40℃水浴摇床振荡3min，期间拿出手摇再放入摇床，之后加入1mL盐酸溶液和2mL乙醚，盖上盖子，涡旋10s；两相分离：5000r/min离心3min，用一次性吸管将有机相吸出转移到试管里，过滤(在装有0.45μm有机滤膜的针管中加入2g无水硫酸钠)。氮吹将乙醚除去，约至200μL时停止；

(4)皂化、甲酯化：将提纯过的Sn-2单甘油酯置于40mL吹扫瓶中，加入10ml 0.5mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，80℃水浴加热10min，期间手摇两次，然后加入10mL三氟化硼甲醇溶液，继续煮沸10min后，冷水降温，加入1mL水和3mL正庚烷，涡旋提取，静置分层，取上层，过滤(在装有0.45μm有机滤膜的针管中加入2g无水硫酸钠)，滤液上机检测。

(5)采用GB 5413.27-2010婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定方法一，测定棕榈酸在奶粉中的含量(mg/100g)

(6)检测：采用气相色谱仪，配FID检测器。

(7)检测条件：

色谱柱：SP-2560，100m×0.25mm×0.20μm；

载气：氦气；

流速：1.0mL/min(恒流)；

进样体积：1.0μL；

进样口温度：250℃；

检测器温度：260℃；

柱温：130℃，以4℃/min升温至230℃(保持30min)；

(8)计算公式：

用面积归一法计算出Sn-2棕榈酸占总棕榈酸比例。计算公式如下：

式中：X：结构甘油三酯Sn-2位棕榈酸的量占总棕榈酸含量的比例，单位百分之(％)。

计算结果保留三位有效数字。

附图

图1提取的脂肪TLC色谱图

图237种脂肪酸标准色谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例 启赋奶粉、OPO结构酯商业化产品、母乳中Sn-2位脂肪酸含量的测定

1、分析步骤

分别取启赋奶粉、OPO结构酯商业化产品、母乳三种样品，根据权利要求1的条件进行前处理和仪器条件的设置。

2、测试结果

注：X-结构甘油三酯Sn-2位棕榈酸的量占总棕榈酸含量的比例，单位百分之(％)

“--”未测

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。