一种前列地尔冻干脂质乳剂的检测方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体地涉及一种前列地尔冻干脂质乳剂的测定方法，该方法可同时用于测定前列地尔脂质乳剂中的有效成分前列地尔的含量以及其中的有关物质前列腺素A1的含量。

背景技术：

前列地尔，即前列腺素E1，英文名称Prostaglandins E1，英文缩写PGE1，化学名称：11a，15（S）-双羟基-9-羰基-13-反前列烯酸，分子式：C20H34O5，分子量为：354.49，结构式为：

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前列地尔是一种活性极强的生理活性物质，具有抑制血小板聚集、防止血栓素A2形成、抑制动脉粥样硬化斑块的形成及保护血管内皮细胞等多种生理作用；还具有舒张血管，改善末梢循环以及扩张外周和冠状血管、保护缺血性心肌、缩小梗塞面积等作用；它能够特异性地作用于缺血局部，明显扩张病变后狭窄的血管，改善脑组织缺氧状况。能够舒张海绵体平滑肌，加速阴茎动脉血流等。在临床上广泛用于治疗肝炎、糖尿病、肾功能不全、支气管哮喘等疾病；可辅助诊断、治疗勃起功能障碍性疾病；尤其对急性心肌梗塞、血栓性疾病、冠心病、心绞痛等心血管疾病治疗效果显著。

前列地尔乳剂是将前列腺素E1溶解在大豆油中，在磷脂类乳化剂作用下，在高压均质机中乳化而成，市售产品有两种剂型，分别为注射液剂型和冻干脂质乳剂型，代表产品分别为北京泰德生产的凯时和重庆药友生产的优帝尔。冻干脂质乳剂则为加入冻干支持剂后冷冻干燥而制成，临用前加入一定量的水便可复乳成前列地尔乳剂，具体可参考公开号为CN1195990A和CN1562041A的中国专利申请。

前列地尔乳剂质量标准的重要组成部分即为控制前列地尔（PGE1）及其有关物质前列腺素A1（PGA1）的含量。目前，已有大量文献报道，证明可以准确检测上述物质，如中国药典2010版采用高效液相色谱法测定注射用前列地尔中PGE1的含量和PGA1的限度，尹翠娟等采用紫外分光光度法测定注射用前列腺素E1的含量（中国药品标准，2005，1（6）：11-12）。但对于前列地尔冻干脂质乳剂而言，除了在乳剂制备过程中加入的较多植物油和乳化剂之外，还加入了破乳困难、对测定干扰较大的冻干支持剂，并且其有效成分PGE1的含量较低，每单位仅为几微克。因此，在进行含量测定时必须找到一种合适稳定的方法对样品进行破乳的前处理，以便提高前列地尔冻干脂质乳剂的质量可控性。显而易见，解决破乳问题的同时能使样品溶液稳定性得到提高是前列地尔冻干脂质乳剂含量检测的关键问题。

在国家食品药品监督管理局公布的前列地尔注射液的国家药品标准WS1-(X-041)-2002Z-2008中，破乳的方法是采用四氢呋喃和磷酸溶液，再通过固相萃取来富集乳剂中的PGE1 。由于PGE1在酸性条件下不稳定，且固相萃取过程复杂、繁琐，易产生较大的测量误差，实验耗材昂贵，实验仪器使用不方便，在50℃减压蒸干溶剂也易破坏PGE1，使其转化成PGA1，造成样品的真实含量偏低而PGA1含量偏大。

中国专利CN1823786A采用冷冻干燥法破乳，过程复杂，耗时太长， 能耗较大，成本较高，用于样品的含量测定很困难，可操作性不强，也不能对生产过程进行控制。且冷冻干燥设备稀有，实用性不强。

在国家食品药品监督管理局公布的注射用前列地尔干乳剂的国家药品标准YBH01492010及CN101158665 B专利中，采用的破乳方法制备的样品溶液明显分层、质量分布不均导致测得的含量比真实含量显著增大、含量可控性差、测量误差很大、测定结果重复性差、溶液稳定性极差。

因此，目前急需研究开发一种操作简便易行、破乳完全、质量均一、样品溶液稳定、质量可控的前列地尔冻干脂质乳剂的测定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种操作简便、破乳完全、含量均匀、溶液稳定、能有效控制产品质量的前列地尔冻干脂质乳剂的测定方法。

一种前列地尔冻干脂质乳剂的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

1）将前列地尔冻干脂质乳剂加水复溶得到样品水溶液；

2）以破乳剂将步骤1）得到的样品水溶液破乳，得到破乳后的样品溶液；其中，所述破乳剂与样品水溶液的体积比（ml : ml）为5:1~5:6；

3）以高效液相色谱测定步骤2）得到的破乳后的样品溶液中的前列地尔和前列腺素A1的含量；

其中，所述破乳剂由有机溶剂A和有机溶剂B组成，所述有机溶剂A选自醇，优选为异丙醇；有机溶剂B选自烷烃、非氟卤代烷烃或四氢呋喃（卤素不包括氟）；优选地，所述烷烃为含有5~10个碳原子的烷烃；优选地，所述卤代烷烃为一氯代烷时，所述一氯代烷的碳原子数大于2；优选地，所述卤代烷烃为一溴代烷时，所述一溴代烷的碳原子数大于1；优选地，所述有机溶剂B选自正己烷或二氯甲烷中的一种或两种。

在根据本发明的一个实施方案中，所述有机溶剂A与有机溶剂B的体积比为0.5~5∶1。

在根据本发明的另一个实施方案中，当所述有机溶剂A为异丙醇，有机溶剂B为正己烷时，有机溶剂A与有机溶剂B的体积比为3.5~5∶1。

在根据本发明的进一步的实施方案中，步骤3）所述高效液相色谱包括以下条件：

采用十八烷基键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾水溶液-乙腈为流动相；柱后反应液为氢氧化钾溶液；柱后反应管为聚四氟乙烯管；反应管温度为60℃；检测波长为278nm。

优选地，所述流动相是由磷酸二氢钾水溶液与乙腈以体积比为60∶42混合形成；其中，磷酸二氢钾水溶液浓度为0.02mol/L，pH为4.9。

在根据本发明的再一个实施方案中，分别利用外标法以峰面积计算所述的前列地尔冻干脂质乳剂中的前列地尔和前列腺素A1的含量。

本发明采用常用的有机溶剂混合溶液进行破乳，再用高效液相色谱仪进行检测，方法简单，操作简便易行，破乳完全，含量均匀，溶液长时间内稳定，能实现自动进样，检测结果可控。经方法学验证，本测定方法专属性强，重复性好，耐用性好，回收率高，溶液更稳定。在测定过程中，PGE1不易因外界原因导致含量下降转化成PGA1，试验结果表明，采用本方法测定样品时，样品溶液不易分层，含量均匀，测定结果更准确合理，同时测得的PGA1的含量较低，说明本方法克服了现有技术的不足，能真实反映样品中PGE1和PGA1的含量，能有效控制产品的质量。

与现有技术相比，本方法更经济、简便、稳定、准确，易于操作，可用于准确测定前列地尔冻干脂质乳剂的含量，便于质量控制。

附图说明

图1为前列地尔对照品HPLC图谱（外标法）。

图2为前列腺素A1对照品HPLC图谱（外标法）。

图3为色谱条件及系统适用性试验HPLC图谱（外标法）。

图4为1406132批样品按本发明的方法测定的HPLC图谱（外标法）。

图5为对比例，即1406132批样品按CN101158665 B专利方法测定的HPLC图谱（外标法）。

图6为前列地尔对照品HPLC图谱（内标法）。

图7为前列腺素A1对照品HPLC图谱（内标法）。

图8为色谱条件及系统适用性试验HPLC图谱（内标法）。

图9为对比例，即1406132批样品按WS1-（X-041）2002Z方法测定的HPLC图谱（内标法）。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

1、仪器、药品及试剂：

日本岛津株式会社LC-20AT高效液相色谱仪；Pickering公司Pinnacle PCX柱后衍生仪。前列地尔冻干脂质乳剂：参照公告号为CN103301076B的中国专利制备；前列地尔对照品，中国食品药品检定研究院提供，含量为99.1%；前列腺素A1对照品为Sigma公司提供，含量为99.8%。乙腈、异丙醇、正己烷、二氯甲烷为国药集团化学试剂有限公司提供（色谱纯）；磷酸二氢钾、氢氧化钾、无水乙醇为国药集团化学试剂有限公司提供（分析纯）。

2、色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为汉邦科技C18（250×4.0mm，5μm）色谱柱，以0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（pH4.9）-乙腈（60∶42）为流动相；柱后反应液为1.0mol/L 氢氧化钾溶液，柱后反应管为聚四氟乙烯管（V=2.0ml）：反应管温度为60℃；检测波长为278nm。前列地尔与前列腺素A1分离度为5.2，与其他各杂质峰的分离度能符合要求，理论板数以前列地尔峰计算为4900。

3、溶液的制备

（1）供试品溶液的制备 取本品适量（约相当于前列地尔50μg），精密称定，置25ml容量瓶中，加5ml水溶解使复乳，加5ml破乳剂（异丙醇：正己烷=3.5∶1），振荡2分钟，超声处理2分钟，加70%异丙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，涡旋混合2分钟，即得；

（2）前列地尔对照品溶液的制备 取前列地尔对照品约5mg，精密称定，置25ml棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解，并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1ml，置100ml 容量瓶中，加70%异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（前列地尔浓度约为2.0μg/ml）；

（3）前列腺素A1对照品溶液的制备 取前列腺素A1对照品（以五氧化二磷为干燥器，室温减压干燥1小时）约2.0mg，精密称定，置棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解，并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液200μl，置100ml 容量瓶中，加70%异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（前列腺素A1浓度约为0.4 μg/ml）。

4、溶液稳定性考察

上述供试品溶液制备完成后于冰箱4℃放置，分别在第0h、12h、24h和36h取出测定含量和观察溶液状态，进行样品溶液的稳定性考察。

5、前列地尔和前列腺素A1的含量测定

精密量取前列地尔对照品溶液、前列腺素A1对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，均按外标法以峰面积计算，即得。

6、结果

表1 前列地尔冻干脂质乳剂中PGE1和PGA1含量测定和溶液稳定性考察结果

以上结果表明，采用本发明的方法测定，样品溶液不易分层，质量均一，样品溶液稳定性极强，能长达24小时保持样品溶液不分层、含量稳定不变化，测得的前列地尔含量更接近真实值。

实施例2 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

供试品溶液的制备 取本品适量（约相当于前列地尔50μg），精密称定，置25ml容量瓶中，加5ml水溶解使复乳，加5ml破乳剂（异丙醇∶正己烷=4∶1），振荡2分钟，超声处理2分钟，加70%异丙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，涡旋混合2分钟，即得。

其余步骤同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为100.3%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例3 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶正己烷=5∶1，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为99.6%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例4 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶二氯甲烷=4∶1，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为102.7%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例5 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶四氢呋喃=0.5∶1，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为102.5%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例6 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶四氢呋喃=1∶1，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为101.9%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例7 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶四氢呋喃=7∶3，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为102.2%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例8 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

破乳剂为异丙醇∶四氢呋喃=3∶1，其余同实施例1。

测定结果：PGE1的含量为102.9%，PGA1的含量为0；样品溶液放置24小时不分层。

实施例9本发明方法空白回收率实验。

精密称定前列地尔对照品5.02mg，置25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为前列地尔对照品贮备液。精密量取前列地尔对照品贮备液适量，加入到5瓶（10μg/瓶）已用5ml水复溶的空白干乳剂中，制成5ml的空白乳约含前列地尔50μg的80%、100%、120%的供试品溶液，每个浓度制备3份，按供试品溶液的制备方法制备供试品，精密量取前列地尔对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，计算回收率。测定结果如表2所示。

表2 本发明方法PGE1回收率实验结果

PGE1空白回收率实验结果表明，采用本发明方法测定前列地尔冻干脂质乳剂的含量，总平均回收率为99.6%，相对标准差RSD为0.7%，回收率高，测定结果准确。

本申请进一步提供以下对比例以利于进一步理解本发明。

对比例1 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

本发明破乳剂为异丙醇∶正己烷=5∶1，

专利号CN101158665 B的专利描述破乳剂为异丙醇∶正己烷=1∶0.5，

其余同实施例1。

国家标准WS1-(X-041)-2002Z-2008，破乳的方法是采用四氢呋喃和磷酸溶液，再通过固相萃取来富集乳剂中的PGE1，具体操作参照国家标准。

测定结果如表3所示。

3种方法在0h时对样品含量的测定的对比结果如图1-图9所示。

表3 对比前列地尔冻干脂质乳剂中PGE1和PGA1含量测定结果

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对比例2 前列地尔冻干脂质乳剂PGE1和PGA1含量测定。

本发明破乳剂为异丙醇∶正己烷=5∶1，

专利号CN101158665 B的专利描述破乳剂为异丙醇∶三氯甲烷=1∶1，

其余同实施例1。

国家标准WS1-(X-041)-2002Z-2008，破乳的方法是采用四氢呋喃和磷酸溶液，再通过固相萃取来富集乳剂中的PGE1，具体操作参照国家标准。

测定结果如表4所示。

表4 对比前列地尔冻干脂质乳剂中PGE1和PGA1含量测定结果

通过对比本发明和CN101158665 B专利所用的不同破乳剂制备的样品溶液，同时对比本发明方法和国家标准WS1-(X-041)-2002Z-2008方法的测定结果，结果表明，同一产品，采用本发明的方法测定，样品溶液不易分层，质量均一，样品溶液稳定性极强，能长达24小时保持含量稳定不变化，测得的前列地尔含量更接近真实值，而按照公开号为CN101158665 B的专利申请公开的方法进行测定得到的结果显示前列地尔含量显著偏高，溶液分层明显，稳定性差，含量测定不准确，按WS1-(X-041)-2002Z-2008测定的PGA1含量结果偏高，同时PGE1的含量偏低。说明本发明的测定方法既不会在破乳过程中使样品溶液分层导致测定结果偏大，也不能使PGE1在制备样品溶液的过程中降解成PGA1，真实地反应了样品中PGE1 和PGA1的含量。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。