本发明涉及药物分析
技术领域：
，尤其涉及检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法。
背景技术：
：目前，对氨基酸的分析常使用的方法是为使用衍生化试剂进行衍生，再通过紫外检测器测定。该方法灵敏度较低、前处理过程复杂，不适合低含量的游离氨基酸的检测。醋酸格拉替雷，又叫做L-丙氨酸-L-谷氨酸-L-赖氨酸-L-酪氨酸多肽聚合物醋酸盐、醋酸格卡替雷，本品是一种合成的多肽类化合物，由以下4种氨基酸L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸组成，药品为白色至灰白色的灭菌，冻晶粉末，包装另附注射用水以调制成注射溶液之用，主要作为单次皮下注射以治疗多发性硬化症。其中：L-丙氨酸，英文名称：L-Alanine，分子式：C3H7NO2。分子量为89.9，CAS号：56-51-7，为无色至白色结晶性粉末，溶于水、乙醇，不溶于乙醚和丙酮。主要用于生化研究、组织培养、肝功能测定、增味剂、可增加调味品的调味效果、还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味。L-赖氨酸，英文名称：L-Lysine，分子式：C6H14N2O2。分子量为182.65.CAS号：657-27-2，为白色或近白色自由流动的结晶性粉末，易溶于水和甲酸，难溶于乙醇和乙醚。主要用于饲料添加剂、食品强化剂和制药。L-谷氨酸，英文名称：L-Glutamic，分子式：C5H9NO4.分子量为147.13.CAS号：56-86-0，为白色或无色鳞片状晶体，微溶于冷水，易溶于热水，几乎不溶于乙醚、乙醇和丙酮。主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。L-酪氨酸，英文名称：L-Tyrosine，分子式：C9H11NO3。分子量为181.19.CAS号：60-18-4，为细针状结晶或结晶性粉末，易溶于碱水，不溶于中心有机溶剂，如无水乙醇、乙醚、丙酮等。医药上用作治疗甲状腺功能亢进，也可作为食品添加剂。多肽醋酸格拉替雷完全由这四种L型氨基酸按一定的顺序及方式结合，对醋酸格拉替雷C端进行有序的酶解，得到的产物必然为这四种游离的氨基酸，通过测定四种游离氨基酸的含量，可以反映出醋酸格拉替雷C端的各个氨基酸含量及比例，对于药物的定性、定量研究及产品质量控制具有重要的实用价值。但是，目前尚无能够同时检测L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸的方法，且醋酸格拉替雷酶解后产生的游离氨基酸含量极低，衍生化后紫外检测器无法进行准确定量，所以不适合用一般的高效液相色谱方法进行测定。因此，建立一种能够同时测定样品中的丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸含量的液质联用方法，具有十分重要的实用价值。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法，本发明提供的方法准确度、灵敏性、重复性皆良好。本发明提供的检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法，将待测样品溶解后，以LC/MS分析，以外标法对丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸定量；LC/MS分析的流动相A相为甲酸铵溶液；流动相B相为乙腈在本发明的实施中，丙氨酸为L-丙氨酸；赖氨酸为L-赖氨酸；谷氨酸为L-谷氨酸；酪氨酸为L-酪氨酸。LC/MS方法将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，能够实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，且能够简化样品的前处理过程。采用LC/MS对物质进行检测，需要对该方法进行系统适用性分析，并检测该方法的灵敏度，具体为：系统适用性：混合对照品溶液进样检测后，丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的四个主峰皆能有效分离。对照品母液连续进样5针，5次检测丙氨酸峰面积的RSD为1.2％；5次检测赖氨酸峰面积的RSD为0.93％；5次检测谷氨酸峰面积的RSD为1.0％；5次检测酪氨酸峰面积的RSD为1.5％。证明系统适用性符合要求，本发明提供的方法重复性良好。灵敏性：各物质最低检测限为信噪比为3时成分的浓度。以本发明提供的方法进行检测，其中，丙氨酸的最低检测限为1.028μg/mL；赖氨酸的最低检测限为0.503μg/mL；谷氨酸的最低检测限为0.3036μg/mL；赖氨酸的最低检测限为0.2012μg/mL；说明本发明提供的方法的灵敏度良好。在本发明的实施例中，溶解的溶剂为乙腈水溶液。在本发明的实施例中，乙腈水溶液中乙腈的体积分数为40％～90％。在一些实施例中，乙腈水溶液中乙腈的体积分数为80％。在本发明的实施例中，待测样品溶解后的浓度为10mg/mL～20mg/mL。在一些实施例中，待测样品溶解后的浓度为20mg/mL。液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相对样品具有一定的溶解能力且与样品不产生化学反应，其黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；且流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。本发明提供方法能够保证更好的检测效果，优于其他流动相的检测结果。在本发明的实施例中，LC/MS的流动相A相为甲酸铵溶液；流动相B相为乙腈，其中，甲酸铵溶液中甲酸铵的浓度为25mmol/L。在本发明的实施例中，LC/MS的洗脱梯度为：0min～10min，流动相A相的体积分数为50％；10min～18min，流动相A相的体积分数由50％～80％；18min～25min，流动相A相的体积分数为80％；25min～25.1min，流动相A相的体积分数由80％～50％；25.1min～35min，流动相A相的体积分数为50％。在本发明的实施例中，LC/MS的流动相的流速为0.5mL/min。对本发明提供的方法而言，根据丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸的极性选择C18色谱柱。色谱柱的尺寸会对分离结果产生影响，其内径会对流动相的流速产生影响，长度较短的色谱柱运行时间短，柱压较低；长度较长的色谱柱分辨率稿，但运行时间增长。在本发明的实施例中，LC/MS的色谱柱为WelchUltimateSIO2。在一些实施例中，色谱柱的尺寸为4.6×150mm，3μm。对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低，不利于物质的检出。在本发明的实施例中，LC/MS的柱温为35℃。在本发明的实施例中，LC/MS的进样量为10μL。在本发明的实施例中，LC/MS的检测器为LTQXL线型离子阱质谱仪。在本发明的实施例中，LC/MS的离子源为ESI；离子传输管温度为380℃；雾化器温度180℃；离子模式为正离子；扫描范围为50Da～500Da；扫描时间为35min。在本发明的实施例中，LC/MS的鞘气为15arb；辅气为9arb；反吹气为3arb；电晕针电压为4.0kV。在本发明的实施例中，以质谱定性；以外标法定量。在一些实施例中，获得丙氨酸含量的方法为，根据丙氨酸标准品浓度与LC/MS检测所得丙氨酸的峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得丙氨酸的含量。在一些实施例中，丙氨酸标准曲线的绘制方法为：以丙氨酸的浓度为横坐标，以LC/MS检测所得丙氨酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以本发明提供的方法获得的丙氨酸的线性方程为y＝1648x-6564；R2＝0.998。在一些实施例中，获得赖氨酸含量的方法为，根据赖氨酸标准品浓度与LC/MS检测所得赖氨酸的峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得赖氨酸的含量。在一些实施例中，赖氨酸标准曲线的绘制方法为：以赖氨酸的浓度为横坐标，以LC/MS检测所得赖氨酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以本发明提供的方法获得的赖氨酸的线性方程为y＝3418x-1543；R2＝0.999。在一些实施例中，获得谷氨酸含量的方法为，根据谷氨酸标准品浓度与LC/MS检测所得谷氨酸的峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得谷氨酸的含量。在一些实施例中，谷氨酸标准曲线的绘制方法为：以谷氨酸的浓度为横坐标，以LC/MS检测所得谷氨酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以本发明提供的方法获得的谷氨酸的线性方程为y＝5537x-1300；R2＝0.998。在一些实施例中，获得酪氨酸含量的方法为，根据酪氨酸标准品浓度与LC/MS检测所得酪氨酸的峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得酪氨酸的含量。在一些实施例中，酪氨酸标准曲线的绘制方法为：以酪氨酸的浓度为横坐标，以LC/MS检测所得酪氨酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以本发明提供的方法获得的酪氨酸的线性方程为y＝5303x-14004；R2＝0.998。醋酸格拉替雷由L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸组成，因此，本发明提供的方法可以应用于醋酸格拉替雷的检测。本发明所述醋酸格拉替雷为醋酸格拉替雷注射液，其中包括醋酸格拉替雷和甘露醇，醋酸格拉替雷的含量为20mg/ml；甘露醇的含量为40mg/mL。本发明还提供了一种醋酸格拉替雷的质量检测方法，包括：将醋酸格拉替雷以羧肽酶Y酶解后作为待测样品，采用本发明提供的方法对丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸定量。本发明提供的醋酸格拉替雷的质量检测方法以醋酸格拉替雷标准品为对照品，以自制或市场购得的醋酸格拉替雷为检测品，在同等酶解条件下，标准品与检测品中测得的L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸含量和/或质量比一致则检测品的质量合格。醋酸格拉替雷标准品为醋酸格拉替雷注射液，购自TEVA。本发明所述的含量一致是指检测品中L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸的含量与标准品中L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸的含量相差不超过±2％；本发明所述的质量比一致是指检测品中L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸的质量比与标准品中L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸的比例相差不超过±2％。羧肽酶Y是一种消化酶。可专一性地从肽链的C端开始逐个降解，释放出游离氨基酸的一类肽链外切酶。在本发明的实施例中，羧肽酶Y的浓度为1mg/ml。在本发明的实施例中，羧肽酶Y酶解的温度为25℃，时间为5min。在本法民的实施例中，羧肽酶Y与醋酸格拉替雷的质量比为200:1。本发明提供的方法用于醋酸格拉替雷注射液的质量检测具有良好的准确性，加标回收结果表明，在样品中加入不同浓度回收率储备液后，丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸的回收率为98.1％～101.7％。符合准确性的要求。本发明提供了检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法，该方法采用LC/MS对待测品进行检测，通过外标法定量，能够具有良好的准确性和灵敏性，并能适用于醋酸格拉替雷的质量检测。实验表明，本发明提供的方法能够准确对丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸进行准确的定量，加标回收率为98.1％～101.7％；重复性良好，连续进样5针RSD皆小于2％；并且，最低检测限不足1.1μg/mL，灵敏度良好。附图说明图1示对照标准品的质谱图；丙氨酸的质谱图如图1-a；赖氨酸的质谱图如图1-b；谷氨酸的质谱图如图1-c；酪氨酸的质谱图如图1-d；图2示定量限溶液的质谱图；丙氨酸的质谱图如图2-a；赖氨酸的质谱图如图2-b；谷氨酸的质谱图如图2-c；酪氨酸的质谱图如图2-d；图3示待测品的质谱图；丙氨酸的质谱图如图3-a；赖氨酸的质谱图如图3-b；谷氨酸的质谱图如图3-c；酪氨酸的质谱图如图3-d。具体实施方式本发明提供了检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。对照品L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸购自Sigma；醋酸格拉替雷标准品购自TEVA。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、配制对照母液：精密量取L-丙氨酸10.28mg，置100ml容量瓶中，用水溶解至刻度，得到L-丙氨酸对照母液；精密量取L-赖氨酸10.60mg，置100ml容量瓶中，用水溶解至刻度，得到L-赖氨酸对照母液；精密量取L-谷氨酸10.12mg，置100ml容量瓶中，用水溶解至刻度，得到L-谷氨酸对照母液；精密量取L-酪氨酸10.06mg，置100ml容量瓶中，用水溶解至刻度，得到L-酪氨酸对照母液。2、4份对照母液各取50μL混合，加800μl乙腈稀释，进样检测，LC/MS条件为：色谱柱：WelchUltimateSIO2，4.6×150mm，3μm；流速：0.5ml/min；柱温：35℃；进样量：10μL；流动相A：25mmol/L甲酸铵溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱条件如表1：表1洗脱条件时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0505010505018802025802025.15050355050离子源：ESI；鞘气15arb，辅气9arb；反吹气：3arb；电晕针电压：4.0KV；离子传输管温度：380℃；雾化器温度：180℃；离子模式：正离子；扫描范围：50～500Da；扫描时间：35min。经检测，丙氨酸的质谱图如图1-a；赖氨酸的质谱图如图1-b；谷氨酸的质谱图如图1-c；酪氨酸的质谱图如图1-d。由图可见，四个主峰皆可有效分离，本发明提供的方法可用于同时检测L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸。实施例2取实施例1中4份对照母液，各50μL，混匀。加入800μl乙腈稀释得到混合对照液。连续进样5针，LC/MS条件与实施例1相同。记录每次检测的峰面积，结果如表2：表25次进样峰面积如表2所示，各峰面积RSD分别为1.2％、0.93％、1.0％、1.5％，可见系统精密度良好。实施例3各物质最低检测限为信噪比为3时成分的浓度。信噪比计算公式为s/n＝2h/hn，其中：h＝与组分对应的峰高hn＝在等于半高处峰宽的五倍因此，丙氨酸浓度为1.028μg/mL、赖氨酸浓度为0.503μg/mL、谷氨酸浓度为0.3036μg/mL、酪氨酸浓度为0.2012μg/mL，配制各氨基酸的定量限溶液(即以80％乙腈水溶液配制丙氨酸浓度为1.028μg/mL、赖氨酸浓度为0.503μg/mL、谷氨酸浓度为0.3036μg/mL、酪氨酸浓度为0.2012μg/mL的溶液，上样检测。经检测，丙氨酸的质谱图如图2-a；赖氨酸的质谱图如图2-b；谷氨酸的质谱图如图2-c；酪氨酸的质谱图如图2-d。可见，在最低检测限浓度时，各氨基酸也能得到良好的检测。实施例4取四种氨基酸，使用体积分数为80％的乙腈水溶液溶解，稀释至表3所示的浓度作为线性溶液。分别进样，LC/MS条件与实施例1相同。表3线性溶液浓度μg/ml50％线性溶液80％线性溶液100％线性溶液120％线性溶液150％线性溶液丙氨酸25.741.1251.461.6877.1赖氨酸5.38.4810.612.7215.9谷氨酸2.534.0485.066.0727.59酪氨酸25.1540.2450.360.3675.45以各氨基酸的浓度为横坐标，以LC/MS检测对应浓度氨基酸所得峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果为：丙氨酸的线性方程为y＝1648x-6564；R2＝0.998。赖氨酸的线性方程为y＝3418x-1543；R2＝0.999。谷氨酸的线性方程为y＝5537x-1300；R2＝0.998。酪氨酸的线性方程为y＝5303x-14004；R2＝0.998。可见，本发明提供的方法线性良好。实施例5称取1mg羧肽酶Y，加纯化水1ml溶解，配制成酶解液。将醋酸格拉替雷注射液标准品50μL；加入5μL酶解液混匀，置于预热过的25℃干式恒温箱孵育5min。时间到后，加入220μL乙腈稀释后进样，LC/MS条件与实施例1相同。所得质谱图如图3。其中，丙氨酸的质谱图如图2-a；赖氨酸的质谱图如图2-b；谷氨酸的质谱图如图2-c；酪氨酸的质谱图如图2-d。可见，采用本发明提供的方法，能够将酶解后醋酸格拉替雷中丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸很好的分离并定量。实施例6准确度储备液配制：取实施例1制备的丙氨酸母液1ml、赖氨酸母液0.2ml、谷氨酸母液0.1ml、酪氨酸母液1ml，置5ml容量瓶中，以水稀释至刻度。将醋酸格拉替雷注射液标准品50μL，其中，醋酸格拉替雷的浓度为20mg/mL，平行置于9个酶切管酶，分别精密加入回收率储备液0.5ml、1ml、1.5ml各3份，混匀，分别记为50％准确度溶液、100％准确度溶液、150％准确度溶液。将混匀后的样品放置于预热过的25℃干式恒温箱孵育5min。时间到后，加入体积分数为80％的乙腈水溶液稀释至4ml。进样检测，LC/MS条件同实施例1，通过计算得到9份样品的四种氨基酸回收率。结果见下表4：表4加标回收率可见，回收率为98.1％～101.7％，说明准确度良好。实施例7取1mg的羧肽酶Y加纯化水1ml溶解，配制成酶解液。使用移液枪精密量取50μL的醋酸格拉替雷溶液，置于酶切管内，加入5μL酶解液混匀。将混匀后的样品放置于预热过的25℃干式恒温箱孵育5min。时间到后，加入再加入220μL乙腈稀释,混匀。同步操作6份，平行得到6个酶切后的样品溶液，进入液质联用系统，LC/MS条件同实施例1，进行分析。以实施例4制得的标准曲线定量。计算四种游离氨基酸的含量。得到四种氨基酸各自所占比例，表56份样品酶切后四种氨基酸各自所占百分比如表5所示，各峰面积RSD分别为1.5％、1.4％、0.9％、0.76％。，可见系统准确性良好。实施例8取1mg的羧肽酶Y加纯化水1ml溶解，配制成酶解液。取醋酸格拉替雷标准品与自制的醋酸格拉替雷待检测品各一批，按以下步骤平行处理：使用移液枪分别精密量取50μL的醋酸格拉替雷溶液，置于酶切管内，加入5μL酶解液混匀。将混匀后的样品放置于预热过的25℃干式恒温箱孵育5min。时间到后，加入220μL的乙腈稀释。进样检测，LC/MS条件同实施例1，进行分析。以实施例4制得的标准曲线定量。通过数据处理，得到氨基酸的质量分数。结果如表6：表6各氨基酸的质量分数丙氨酸赖氨酸谷氨酸酪氨酸原研26.89％7.26％4.82％61.05％自制25.54％7.89％4.39％62.18％可知，醋酸格拉替雷经过羧肽酶Y酶切后得到的各个游离氨基酸所占比例，且原研样品与自制样品基本没有区别，产品合格。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3