一种检测美洛昔康片中杂质的HPLC方法与流程

本发明属于制剂分析方法，具体是涉及一种检测美洛昔康片中杂质的HPLC方法，该测定方法稳定、准确度高。
背景技术：
：美洛昔康是一种烯醇酰胺类的新型非甾体抗炎药，对环氧化酶-2有较强的选择性抑制作用，具有解热、镇痛、抗炎等药理作用，而对胃肠道及肾脏的毒性较小。可用于类风湿性关节炎和疼痛性骨关节炎的对症治疗，或控制与骨骼肌有关的炎症及疼痛。但在美洛昔康合成的过程中容易引入其他杂质，比如:4-羟基-2-甲基-2H-1,2-苯并噻嗪-3-羧酸乙酯-1,1-二氧化物、2-氨基-5-甲基噻唑等，其中2-氨基-5-甲基噻唑属于有害物质，对于生物体有较大毒性，长期接触，会严重损坏健康。此外，该物质分解会影响美洛昔康产品质量。考虑到宠物对药物具有排斥性，因此在宠物专用组方中添加宠物专用矫味剂，如：牛肉粉、鸡肉粉、鸡肝粉等。这些矫味剂的引入干扰了杂质的测定，故现有的检测方法很难将杂质与美洛昔康有效分离。目前针对美洛昔康片有关物质的检测的方法为：一、2015年版中国药典中美洛昔康片中美洛昔康有关物质检测方法：取本品，加碱性甲醇溶液(取40％甲醇溶液100ml，加0.4mol/L氢氧化钠溶液6ml，混匀)溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用上述碱性甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照高效液相色谱法(通则0512)试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－0.1mol/L醋酸铵溶液(1：1)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按美洛昔康峰计算不低于2000。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的6倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积(1.0％)。二、中国医药工业杂志(发表日期：2003年11月)中美洛昔有关物质的HPLC测定方法为：色谱条件：十八烷基键合硅胶(5um)为填充剂，检测波长为350nm和260nm，柱温45℃，流速1ml/min，进样量20ul。流动相A为0.1％磷酸氢二钾溶液(调剂pH6.0)，流动相B为甲醇。梯度洗脱：0～2.5min，A:B＝60：40,； 2.5～12min从A:B＝60:40等速线性变化至A:B＝30:70。测定方法：溶液1的制备：精密称取1约0.1g，置50ml容量瓶中，加0.4％NaOH溶液6ml，微温，超声使溶解，加40％甲醇定容，摇匀即得。溶液2的制备：精密吸取溶液1中1ml，置100ml容量瓶中，用40％甲醇定容，摇匀。精密吸取1ml用40％甲醇定容至10ml，摇匀，即得。测定：取溶液1、2分别于350nm和260nm波长处进行测定。溶液1在350nm波长处任一杂质峰的面积，不得大于溶液2在350nm波长处1峰面积的一半(0.05％)；溶液2在260nm任一杂质峰的面积，不得大于溶液2在260nm波长处1峰面积(0.1％)。计算各杂质在高响应波长处的百分含量，所有杂质的和不得大于0.3％。检测方法一中的方法采用等度洗脱法，和梯度洗脱法比较不能将杂质全部洗脱出来；检测方法二中的方法需要使用配有二极管阵列检测器的液相色谱仪，和普通紫外检测器相比价格比较高。技术实现要素：本发明的目的是提供一种仅用一个波长便可以达到检测目的的方法，且操作简单方便精确度较高，在仪器的使用上也降低了成本，使用配有紫外检测器的高效液相色谱仪即可。2-氨基-5-甲基噻唑在检测限和定量限方面三种检测方法有所有不同下表；项目方法一方法二本发明检测限10ng/ml12.5ng/ml7.5ng/ml定量限0.05μg/ml0.08μg/ml0.03μg/ml所述一种检测美洛昔康片中杂质的HPLC方法，是通过改变梯度洗脱的流动相比例和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行有关物质的测定。本发明涉及的梯度洗脱程序为：本发明涉及的流动相为：0.2％磷酸氢二铵溶液(pH7.0)为流动相A；甲醇为B；异丙醇为流动相C。本发明所使用的提取液的配制方法为：取40％甲醇溶液100ml，加0.4mol/L氢氧化钠溶液6ml，混匀。本发明其所述的美洛昔康片主要杂质成分为2-氨基-5-甲基噻唑。本发明是这样来实现的：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ThermoC18，4.6mm×150mm，5μm)，柱温40℃；流速为0.9mL/min；检测波长为270nm；取美洛昔康片适量，研细，加提取液稀释至每1ml含美洛昔康0.5mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液；美洛昔康对照溶液的制备精密量取供试品溶液1ml至100ml容量瓶中，用提取液定容至刻度，摇匀，得每1mL中含5ug的溶液，作为美洛昔康对照溶液；精密量取对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的6倍。供试品溶液的色谱图中如显杂峰，相对保留时间小于0.55的峰忽略不计，相对保留时间为0.59的色谱峰(2-氨基-5-甲基噻唑)，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.15倍，其他单个杂质峰面积不得过对照溶液主峰面积的1/2(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)。小于对照品溶液峰面积0.01倍的峰忽略不计。本发明的有益效果是：本发明仅用一个波长便可以达到检测目的的方法，且操作简单方便精确度较高，在仪器的使用上也降低了成本，使用配有紫外检测器的高效液相色谱仪即可。本发明耐用性的考察:本发明在有关物质测定方法上选择150mm长的C18色谱柱，耐用性重点考察了流动相不同pH和柱温对测定方法的影响。1流动相pH值对含量测定方法的影响为了考察流动相pH值对有关物质检测方法的影响，分别配制pH6.5、7.0、7.5三个流动相，其他条件相同，分别记录色谱图，比较理论塔板数、保留时间、含量，结果如下表1所示。表1流动相不同pH对2-氨基-5-甲基噻唑的影响由表1得出，随着流动相pH值的增大，2-氨基-5-甲基噻唑的保留时间略有提前，三个条件下的理论塔板数、分离度均符合要求，可以看出在流动相pH值在6.5-7.5范围内，塔板数、含量均符合规定，说明流动相pH在6.5-7.5范围内，2-氨基-5-甲基噻唑较稳定。2柱温对本发明的影响为了考察柱温变化对本发明的影响，试验中通过柱温箱控制柱子温度，设定了30℃、35℃、40℃、45℃四个条件，分别采集相应温度下样品的色谱信号，待检样品为1mg/片美洛昔康片制剂，比较不同温度下色谱图参数中分离度、理论塔板数、分离度、含量，结果如下表2所示。表2柱温对2-氨基-5-甲基噻唑的影响通过上表2数据可以看出，随柱温的升高，2-氨基-5-甲基噻唑的保留略有提前；不同温度下，2-氨基-5-甲基噻唑的塔板数、分离度均符合规定；由此可以看出柱温对2-氨基-5-甲基噻唑的影响较少。流动相不同pH和柱温的HLPC图谱分别见附图1-附图7。附图说明：附图1、使用本发明测得柱温在30℃的耐用性HPLC图谱附图2、使用本发明测得柱温在35℃的耐用性HPLC图谱附图3、使用本发明测得柱温在45℃的耐用性HPLC图谱附图4、使用本发明测得柱温在40℃和pH7.0的耐用性HPLC图谱附图5、使用本发明测得流动相pH6.0的耐用性HPLC图谱附图6、使用本发明测得流动相pH6.5的耐用性HPLC图谱附图7、使用本发明测得流动相pH7.5的耐用性HPLC图谱附图8：2-氨基-5-甲基噻唑检测限的HPLC图谱附图9：2-氨基-5-甲基噻唑定量限的HPLC图谱附图10：2-氨基-5-甲基噻唑浓度在0.25ug/mL的HPLC图谱附图11：2-氨基-5-甲基噻唑浓度在0.5ug/mL的HPLC图谱附图12：2-氨基-5-甲基噻唑浓度在1ug/mL的HPLC图谱附图13：2-氨基-5-甲基噻唑浓度在2ug/mL的HPLC图谱附图14：2-氨基-5-甲基噻唑浓度在4ug/mL的HPLC图谱附图15：2-氨基-5-甲基噻唑浓度和峰面积关系图附图16：根据实施例1中测定样品的HPLC图谱具体实施方式以下实施例是用以说明本发明的优选的实施方案，本领域技术人员应当理解，以下描述不应用于限制本发明的保护范围。实施例一：一种能检查美洛昔康片中杂质的HPLC方法待检样品：1mg/片美洛昔康片制剂。(组方为淀粉、乳糖、吐温80、美洛昔康、鸡肝粉、十二烷基硫酸钠)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ThermoC18，4.6mm×150mm，5μm,)，柱温40℃；以0.2％磷酸氢二铵溶液(pH7.0)为流动相A；甲醇为B；异丙醇溶液为流动相C。流速为0.9mL/min；检测波长为270nm，按以下程序进行梯度洗脱：测定法美洛昔康对照品溶液的制备精密量取供试品溶液1ml至100ml容量瓶中，用提取液定容至刻度，摇匀，得每1mL中含5ug的溶液，作为美洛昔康对照品溶液。供试品溶液的制备取美洛昔康片适量，研细，加提取液稀释至每1ml含美洛昔康0.5mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液。精密量取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的6倍。供试品溶液的色谱图中如显杂峰，相对保留时间小于0.55的峰忽略不计，相对保留时间为0.59的色谱峰(2-氨基-5-甲基噻唑)，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.15倍，其他单个杂质峰面积不得过对照溶液主峰面积的1/2(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)。小于对照品溶液峰面积0.01倍的峰忽略不计。(根据方法测定的样品的HPLC图谱一数据见表3)表3美洛昔康片杂质检测结果实施例二：一种能检查美洛昔康片中杂质的HPLC方法的检测限和定量限将2-氨基-5-甲基噻唑用甲醇稀释，记录不同稀释度情况下2-氨基-5-甲基噻唑的信噪比，直至供试品中2-氨基-5-甲基噻唑的响应值约为噪音值的10倍，此时2-氨基-5-甲基噻唑的定量限为15ng/ml。将上述溶液用甲醇稀释，记录不同稀释度情况下2-氨基-5-甲基噻唑的信噪比，至供试品中2-氨基-5-甲基噻唑的响应值约为噪音值的3倍，此时2-氨基-5-甲基噻唑检测限为5ng/mL(检测限图谱见附图8-附图9)。实施例三：一种能检查美洛昔康片中杂质的HPLC方法的线性关系实验由于本检测方法中2-氨基-5-甲基噻唑考察浓度为2ug/mL，因此本实施例选择了将2-氨基-5-甲基噻唑用提取液制成浓度分别为4.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml的溶液，摇匀，分别精密量取20μL对照品溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标进行线性回归，得到的线性图谱分别见说明书附图10-附图14。表42-氨基-5-甲基噻唑浓度与峰面积根据上述表格中的数值，得出了2-氨基-5-甲基噻唑浓度和峰面积的回归方程y＝0.020x+0.016，相关系数R2＝0.999。浓度在0.25-4μg/ml范围内，2-氨基-5-甲基噻唑与峰面积呈良好的线性关系。实施例四：一种能检查美洛昔康片中杂质的HPLC方法的重复性考察用提取液将2-氨基-5-甲基噻唑配制成浓度为0.75ug/ml的储备液；精确吸取1ml至100ml容量瓶中，即得0.75μg/ml溶液，作为对照品溶液。精密称取1mg 规格量美洛昔康片5g到100ml容量瓶中，从杂质储备液中吸取1ml至产品容量瓶中，加入适量提取液后超声，溶解后用稀释液定容至刻度。将上述两种溶液各进20μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图；结果见下表5所示。表5重复性试验的考察实验结果表明，重复性中峰面积测量值的RSD小于1.0％说明该方法对本品具有适用性。实施例五：一种能检查美洛昔康片中杂质的HPLC方法的中间精密度试验分别精密称瑞普(天津)生物药业有限公司中试含2-氨基-5-甲基噻唑制剂。本发明的方法进行方法的中间精密度试验，由不同操作者，使用不同仪器、于不同时间，照有关物质测定项下方法操作，结果见表6。表6美洛昔康片中间精密度试验由上表得出，在不同人员，不同日期测定样品中杂质含量，六次测定的结果相对标准偏差小于2.0％，说明本实验方法中间精密度符合要求。当前第1页1 2 3