本发明涉及一种检测舒洛地特原料的方法，尤其涉及一种使用肝素酶联合降解后做sax-hplc法分析降解产物由此确认舒洛地特化学组成的方法。
背景技术：
舒洛地特sulodexide，商品名为伟素vesselduef，化学名称为葡糖醛酸基葡糖胺聚糖硫酸盐。由意大利alfawassermann公司原创生产，1974年在意大利首先上市，2003年进入中国市场。国内至今仍只有原研一家有销售。适应症为有血栓形成危险的血管疾病，是一种可口服吸收的抗凝血药。近年曾显示其对糖尿病肾病的治疗有效果。
舒洛地特由猪肠粘膜提取，是高度纯化的糖胺聚糖，由重复的二糖结构单元组成带有负电荷的长链大分子,二糖单元包含两个改构糖,即n-乙酰半乳糖胺或n-乙酰葡糖胺及糖醛酸,如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。琼脂凝胶电泳法测得含有80%的快速移动肝素(fastmovingheparin,fmh)(基于电泳迁移率)即低分子肝素(lowmolecularweightheparin,lmwh)和20%的硫酸皮肤素(dermatansulfate,ds)及少量慢速移动肝素(slowmovingheparin,smh)(不得大于2%)。其中的lmwh部分与未分级肝素一样含有二糖聚合结构,但硫酸化程度较低,多糖链的长度较短。未降解ds是由许多不同二糖组成的多糖,平均相对分子质量25000da。
舒洛地特中的快移动肝素是一些特定的肝素成分，其双糖组成与一般的肝素相比有所不同，测定双糖组成和含量，可判断制备品是否是舒洛地特。
本专利提供一种hplc法测定酶解产物由此判断舒洛地特是否质量合格的方法，可用于舒洛地特的中控检测或成品检测，简单快速地判断供试品舒洛地特是否合格，由此决定是否进行后续加工。
技术实现要素：
本发明公开了一种通过hplc法检测完全酶解的舒洛地特api和注射剂的二糖单元指纹图谱，并由此判断产品是否合格的方法。所述方法包括下述步骤：
a、舒洛地特的完全酶解：向浓度为10-200mg/ml的舒洛地特溶液中，加入酶ⅰ∶酶ⅱ∶酶ⅲ＝1∶1∶1的混合酶溶液，室温下酶解48小时；
b、hplc法分析：取降解产物做sax-hplc分析；
c、二糖单元种类和含量的计算：根据双糖的洗脱时间，确定舒洛地特中肝素二糖单元的种类和含量，计算8个双糖各自所占百分含量；
d、质量是否合格的判断：计算其中8个双糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合正常范围，并由此判断试品舒洛地特质量是否合格。
其中，步骤a中所述对应于1mg降解底物的混合酶溶液用量为酶ⅰ∶酶ⅱ∶酶ⅲ＝33miu∶33miu∶33miu。酶ⅰ，酶ⅱ，酶ⅲ分别代表肝素酶ⅰ、肝素酶ⅱ、肝素酶ⅲ，为现有技术产品，可以从市场上购买得到。
步骤a中所述的酶解，是将舒洛地特溶液，缓冲液b，肝素酶ⅰ溶液、肝素酶ⅱ溶液、肝素酶ⅲ溶液混合，放置48小时进行酶解。
步骤b中所述的hplc法，其色谱条件如下：
waters2695型hplc；色谱柱：watersspherisorbs5-sax，4.6mm×250mm×5μm预柱：watersspherisorbsax，4.6mm×10mm×5μm，室温；流动相为洗提液a和洗提液b梯度洗脱；流速1.10ml/min；进样量25μl；采集时间64min。
步骤d中所述8种双糖为：ⅳ-s、ⅱ-a、ⅲ-a、ⅱ-s、ⅲ-s、ⅰ-a、ⅰ-s、ⅳ-a。
以上8种糖均为已知技术，其结构可以从手册上查到。
步骤d中所述8种双糖符合标准的含量范围分别是ⅳ-a(19.66±4.16)、ⅳ-s(11.92±2.26)、ⅱ-a(7.64±0.78)、ⅲ-a(1.81±0.36)、ⅱ-s(9.99±0.55)、ⅲ-s(9.31±0.50)、ⅰ-a(1.07±0.20)、ⅰ-s(39.56±5.96)。以上标准的含量范围来源于表3。
表3为八批意大利alfawassermann公司舒洛地特注射液酶解产物肝素双糖种类含量统计分析表。
附图说明
图1为三批合格舒洛地特产品酶解产物的sax-hplc图谱。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
a、舒洛地特的完全酶解步骤中溶液的配制：
缓冲液a的配制：称取68mg的磷酸二氢钾，用约30ml的超纯水溶解后，用1mol/l的氢氧化钠溶液中和至ph为7，加入10mg的牛白蛋白，移到50ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。
缓冲液b的配制：移取0.58ml的冰醋酸于烧杯中，加入约80ml的超纯水，加入32mg的醋酸钙，并使之溶解。用1mol/l的氢氧化钠溶液中和至ph为7，加入10mg的牛白蛋白。移到100ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。得到100mm的醋酸钠溶液。
肝素酶溶液的配制：根据肝素酶ⅰ、肝素酶ⅱ、肝素酶ⅲ的装量，用缓冲液a将肝素酶稀释到0.4iu/ml。保存在≤-20℃的冰箱中。
肝素双糖标准溶液的配制：用超纯水将每个肝素双糖的冻干粉稀释到约0.25mg/ml的浓度。将双糖标准溶液各取20μl于200μl的内插管中，混匀。此内插管保存在≤-20℃的冰箱中。
舒洛地特钠样品溶液的配制：精密称取20mg的舒洛地特样品于洁净试管中，加入1.0ml的超纯水溶解，混匀。
8.5％的磷酸溶液的配制：移取8.5ml的磷酸，加入91.5ml的水，混匀，即得。
洗提液a的配制：称取780mg的磷酸二氢钠溶于约1800ml的注射用水中，用8.5％的磷酸调节ph到3.0，加水至2000ml。用0.22μm的滤膜过滤，即得2.5mmph为3.0的磷酸二氢钠溶液。
洗提液b的配制：称取140.7g的一水合高氯酸钠溶于约800ml的注射用水中，加入390mg的磷酸二氢钠，用8.5％的磷酸调节ph到3.0，加水至1000ml。用0.22μm的滤膜过滤，即得1.0mol/lph为3.0的高氯酸钠溶液。
b、舒洛地特的完全酶解
于离心管中依次加入20μl的舒洛地特钠样品溶液，70μl的缓冲液b和33.3μl肝素酶ⅰ溶液、33.3μl肝素酶ⅱ溶液、33.3μl肝素酶ⅲ溶液，并搅拌彻底。室温酶解48小时。酶解后移取62μl的酶解液于内插管中，
c、取降解产物做sax-hplc分析；采用以下色谱条件：
waters2695型hplc；色谱柱：watersspherisorbs5-sax，4.6mm×250mm×5μm；预柱：watersspherisorbsax，4.6mm×10mm×5μm；室温；流动相为洗提液a和洗提液b进行梯度洗脱，流速1.1ml/min，进样量25μl，采集时间64min。洗脱梯度表见表1。
表1：sax-hplc洗脱梯度表
系统平衡好后，先分析标准双糖溶液，判断各双糖峰之间的分离度是否≥1.5。若分离度≥1.5，才可进样分析。进样顺序为：标准双糖溶液、样品的酶解液。图1为三批合格舒洛地特产品酶解产物的sax-hplc图谱，按照上述方法三批次完全重合。
数据处理：双糖的洗脱顺序如表2。
表2：8种肝素双糖的洗脱顺序和保留时间表
含量计算：双糖组分的摩尔百分含量＝峰面积/∑面积
d、计算得到的8个双糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合标准范围，并由此判断试品舒洛地特质量是否合格。标准范围的确定，由八批市售品样品按本专利方法分析双糖百分含量而得到。
表3为酶解后多批次舒洛地特的肝素双糖百分含量分析表。其中11775、12415、12497、12885、13478、13766、13495、13982均为意大利alfawassermann公司生产的舒洛地特注射液的产品批号。
表3：八批舒洛地特酶解后肝素双糖的百分含量分析表