癌细胞检测用高分子膜及其制造方法、以及使用该高分子膜的癌细胞检测装置与流程

本发明涉及能够特异性地检测作为检测对象的癌细胞的高分子膜及其制造方法。另外，本发明涉及使用该高分子膜的癌细胞检测装置。

背景技术：

现在，日本人的死亡原因据称最多的是由于癌症等恶性新生物引起的，癌细胞的早期发现对降低死亡率是非常重要的。“癌”通常是指恶性肿瘤，根据来自的组织、细胞的种类，分类为由上皮细胞产生的“肿瘤”、由结缔组织、肌肉细胞构成的“肉瘤”，来自造血细胞的“白血病”、来自神经系细胞的肿瘤等。

对于癌症诊断，以往有如下方法：(1)注射产生放射线的检查药品，使用特殊的照相机将在癌症存在的部位浓缩的检查药品所发出的放射线图像化，由此从外部检测癌细胞的正电子发射断层摄影(Positron Emission Tomography:PET)法；(2)使用X射线拍摄身体的截面，将身体内部进行图像化，由此检测癌细胞的计算机断层摄影(Computed Tomography:CT)法，(3)使用荧光染色剂、抗原标记这样的标记物来检测在血液中循环的肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell：CTC)的CTC检查法等。

然而，PET法和CT法被指出有放射线损伤的危险性、检查需要大量的时间·费用、需要大型的装置、需要特殊的技术员等大量问题。从该方面考虑，CTC检查法具有没有放射线损伤的危险性、也无需大型设备这样的优点，但由于使用标记物，因此，通过熟练技术人员进行检查是不可或缺的，从检查的简便性方面考虑，还有改善的余地。

但是，在国际公开第2012/121229号(专利文献1)中记载了使用具备具有与检测对象的微生物的立体结构互补的三维结构的铸型的聚合物层作为用于检测不是癌细胞这样的细胞而是以细菌为代表的微生物的传感器。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2012/121229号

技术实现要素：

鉴于上述以往的课题，本发明的目的在于提供一种能够以非标记迅速且简便地检测癌细胞的癌细胞检测用的高分子膜及其制造方法。另外，本发明的另一目的在于提供一种使用该高分子膜的癌细胞检测装置。

上述专利文献1公开了在将以细菌为代表的微生物作为检测对象时，具有该微生物的铸型的高分子膜的检测特异性优异。但是，在将与细菌相比尺寸极大(大一位左右)且作为物质的更柔软的癌细胞作为检测对象时，与细菌的情况同样地制作具有癌细胞的铸型的高分子膜，但该高分子膜对癌细胞是否显示良好的检测特异性(特异性地检测检测对象的癌细胞的性质)，本领域技术人员无法预见，当然，鉴于细菌与癌细胞的上述不同点，具有癌细胞的铸型的高分子膜的实现性和癌细胞的优异的检测特异性难以显现对本领域技术人员而言是通常的预测。

本发明是基于如下划时代的研究结果而完成的，所述研究成果颠覆了上述本领域技术人员的通常的预测，实际上能够实现具备具有与作为检测对象的癌细胞的立体结构的一部分互补的三维结构的铸型的高分子膜，且该高分子膜显示优异的检测特异性。即本发明提供以下的癌细胞检测用高分子膜、癌细胞检测装置以及癌细胞检测用高分子膜的制造方法。

[1]一种高分子膜，是癌细胞检测用的高分子膜，在其表面具备具有与作为检测对象的癌细胞的立体结构的一部分互补的三维结构的铸型。

[2]根据[1]所述的高分子膜，其中，膜厚为5μm以下。

[3]根据[1]或[2]所述的高分子膜，通过包括如下工序的制造方法而得到：

在作为检测对象的癌细胞的存在下，将单体聚合而形成摄入有所述癌细胞的含有癌细胞的高分子膜的工序；以及

除去所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的至少一部分的工序。

[4]根据[3]所述的高分子膜，其中，所述除去工序依次包括如下工序：

使所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的体积减小，或者将形成所述含有癌细胞的高分子膜的高分子膜与癌细胞之间的静电相互作用至少部分中和的工序；以及

对所述含有癌细胞的高分子膜进行过氧化处理而释放所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的至少一部分的工序。

[5]根据[4]所述的高分子膜，其中，使所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的体积减小，或者将形成所述含有癌细胞的高分子膜的高分子膜与癌细胞之间的静电相互作用至少部分中和的工序包括用肝素钠对所述含有癌细胞的高分子膜进行处理的工序。

[6]根据[3]～[5]中任一项所述的高分子膜，其中，所述单体选自吡咯、苯胺、噻吩以及它们的衍生物。

[7]一种癌细胞检测装置，包括：

具备[1]～[6]中任一项所述的高分子膜的检测部；

用于将试样液中所含的作为所述检测对象的癌细胞向所述高分子膜的所述表面的方向诱导的诱导部；以及

用于检知作为所述检测对象的癌细胞在所述铸型中的捕获状态的检知部。

[8]根据[7]所述的癌细胞检测装置，其中，所述诱导部通过在1对电极间施加交流电压，从而利用介电电泳将作为所述检测对象的癌细胞向所述高分子膜的所述表面的方向进行诱导。

[9]根据[7]或[8]所述的癌细胞检测装置，其中，所述检知部包括水晶振子，

根据所述水晶振子的共振频率的变化而测定所述高分子膜的质量变化，检知作为所述检测对象的癌细胞的捕获状态。

[10]一种癌细胞检测用的高分子膜的制造方法，所述高分子膜在其表面具备具有与作为检测对象的癌细胞的立体结构的一部分互补的三维结构的铸型，所述制造方法包括如下工序：

在作为检测对象的癌细胞的存在下，将单体聚合而形成摄入有所述癌细胞的含有癌细胞的高分子膜的工序；以及

除去所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的至少一部分的工序。

[11]根据[10]所述的制造方法，其中，所述除去工序依次包括如下工序：

使所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的体积减小，或者将形成所述含有癌细胞的高分子膜的高分子膜与癌细胞之间的静电相互作用至少部分中和的工序；以及

对所述含有癌细胞的高分子膜进行过氧化处理而释放所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的至少一部分的工序。

[12]根据[11]所述的制造方法，其中，使所述含有癌细胞的高分子膜所摄入的癌细胞的体积减小，或者将形成所述含有癌细胞的高分子膜的高分子膜与癌细胞之间的静电相互作用至少部分中和的工序包括用肝素钠对所述含有癌细胞的高分子膜进行处理的工序。

根据本发明，可以提供一种能够以非标记(即，不使用标记物而直接地)迅速且简便地检测特定的癌细胞的癌细胞检测用的高分子膜及使用该高分子膜的细胞检测装置。另外，根据本发明，可以提供一种能够特异性(优异的选择性)地检测检测对象的癌细胞的癌细胞检测用的高分子膜及使用该高分子膜的细胞检测装置。

附图说明

图1是示意地表示本发明的癌细胞检测用高分子膜的截面图。

图2是示意地表示图1所示的癌细胞检测用高分子膜的铸型捕获癌细胞的状态的截面图。

图3是示意地表示本发明的癌细胞检测用高分子膜的制造方法的一个例子的截面图，(a)为聚合工序前的截面图，(b)为聚合工序后的截面图，(c)为癌细胞除去工序后的截面图。

图4是表示本发明的癌细胞检测装置的优选的一个例子的简要结构的示意图。

图5是白血病细胞CCRF-CEM的电子显微镜照片。

图6是实施例1中的聚合工序后的聚吡咯膜(含有癌细胞的高分子膜)的表面的电子显微镜照片。

图7是表示实施例1的聚合工序中的时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图8是实施例1中的过氧化工序后的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜)的表面的电子显微镜照片。

图9是表示实施例1的过氧化工序中的时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图10是表示实施例1的使用癌细胞检测装置的癌细胞检测实验的结果的图，是表示癌细胞检测时的交流电压施加时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图11是表示实施例1的使用癌细胞检测装置的癌细胞检测实验的结果的图，是将癌细胞为靶癌细胞CCRF-CEM时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF与癌细胞为非靶癌细胞THP-1时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF进行比较的图。

图12是白血病细胞THP-1的电子显微镜照片。

图13是实施例2中的聚合工序后的聚吡咯膜(含有癌细胞的高分子膜)的表面的电子显微镜照片。

图14是表示实施例2的聚合工序中的时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图15是实施例2中的过氧化工序后的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜)的表面的电子显微镜照片。

图16是表示实施例2的过氧化工序中的时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图17是表示实施例2的使用癌细胞检测装置的癌细胞检测实验的结果的图，是表示癌细胞检测时的交流电压施加时间与水晶振子的共振频率的关系的图。

图18是表示实施例2的使用癌细胞检测装置的癌细胞检测实验的结果的图，是将癌细胞为靶癌细胞THP-1时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF与癌细胞为非靶癌细胞CCRF-CEM时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF进行比较的图。

具体实施方式

＜癌细胞检测用高分子膜及其制造方法＞

图1是示意地表示本发明的癌细胞检测用高分子膜的截面图。如图1所示，本发明的癌细胞检测用高分子膜1在其表面具备多个铸型1a，该铸型1a具有与作为检测对象的癌细胞(以下，也称为“靶癌细胞”)的立体结构的一部分互补的三维结构。癌细胞检测用高分子膜1通过在其铸型1a中摄入靶癌细胞并将其捕获，从而对该癌细胞进行检测。将癌细胞检测用高分子膜1的铸型1a捕获靶癌细胞2的状态以截面示意图示于图2。

如此，对于本发明的癌细胞检测用高分子膜1，由于其铸型1a具有与靶癌细胞2的立体结构的一部分互补的三维结构，因此，选择性良好的捕获靶癌细胞2，另一方面，完全或者几乎不捕获与该铸型1a的三维结构不互补的癌细胞、其它物质，捕获选择性优异。利用该性质，能够特异性性检测靶癌细胞2。

应予说明，在此所说的“互补的”在现阶段尚不明确，但可包括与靶癌细胞2的表面形状互补和/或与靶癌细胞2的表面的分子水平的结构互补。

癌细胞检测用高分子膜1的膜厚例如可以为0.1～10μm左右，即使为5μm以下、进而为4μm以下，也能够得到癌细胞的优异的检测特异性。由于癌细胞的尺寸(直径或最大直径)大致为10μm左右，因此，铸型1a可以具有与靶癌细胞2的立体结构的50％以下互补的三维结构，进而，可以具有与40％以下互补的三维结构。另外，从制造容易性的方面考虑，使膜厚为5μm以下也有利。

另一方面，从癌细胞检测用高分子膜1的制造容易性、操作性、机械强度以及检测特异性的观点考虑，癌细胞检测用高分子膜1的膜厚优选为1μm以上，另外，铸型1a优选具有与含有靶癌细胞2的表面分子结构的一部分立体结构互补的三维结构。

癌细胞检测用高分子膜1的膜厚是指从具有铸型1a的表面且未形成有铸型1a的表面部分到与其对置的表面为止的距离(图1中，以A表示癌细胞检测用高分子膜1的膜厚)。膜厚A可以利用扫描式电子显微镜、激光显微镜或阶差测量仪进行测定。

从制造容易性、机械强度以及各个铸型1a的独立性(抑制2个以上的铸型1a结合而形成另一不同形状的铸型)的观点考虑，癌细胞检测用高分子膜1所具有的铸型1a的数量优选形成有铸型1a的表面每1cm²为9×10⁶个以下，更优选为5×10⁶个以下，进一步优选为3×10⁶个以下。另一方面，为了对靶癌细胞2得到充分的检测灵敏度，铸型1a的数量优选上述表面每1cm²为1×10³个以上，更优选为1×10⁴个以上。

形成有铸型1a的表面每1cm²的铸型1a的数量可以在该表面的任意位置取得400μm×300μm的SEM图像，由其图像中所含的铸型1a的数量求出。

构成癌细胞检测用高分子膜1的高分子没有特别限制，可以使用各种高分子，不论有无导电性。但是，通过优选采用的后述的方法来制造癌细胞检测用高分子膜1时，优选使用通过聚合反应形成导电性高分子的单体作为原料以能够有效地形成作为制造中间体的摄入靶癌细胞2的高分子膜。作为形成导电性高分子的单体，可举出吡咯、苯胺、噻吩以及它们的衍生物。

作为靶癌细胞2，例如可举出来自以下记载的癌的细胞。慢性白血病、急性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、原发性骨髓纤维化；神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质肿瘤、前庭神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤脑瘤；胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤、类癌或胰岛细胞瘤这样的胰腺癌；库欣病、催乳素分泌瘤、肢端肥大症、尿崩症这样的垂体癌；眼睛的黑色素瘤(例如，虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤)和成视网膜细胞瘤这样的眼癌；鳞状上皮细胞癌、腺癌和黑色素瘤这样的阴道症；腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺小管癌、乳腺乳头状癌、派杰氏病和炎性乳腺癌这样的乳腺癌；骨癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤这样的骨组织和结缔组织肉瘤；鳞状上皮细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和派杰氏病这样的外阴癌；鳞状上皮细胞癌和腺癌这样的子宫颈癌；宫内膜癌瘤和子宫肉瘤这样的子宫癌；腺癌、菌状(息肉状)、溃疡状、浅表性扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤这样的胃癌；结肠癌；直肠癌；肝细胞癌和肝胚细胞瘤这样的肝癌、胆囊癌；乳头状、结节性这样的胆管癌；非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌这样的肺癌；嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌这样的肾上腺癌；乳头状或滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌这样的甲状腺癌；卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤这样的卵巢癌；胚细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、精母细胞、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜瘤(卵黄囊瘤)、前列腺癌、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤这样的睾丸癌；阴茎癌；鳞状上皮细胞癌这样的口腔癌；肾细胞癌、肾癌、肾上腺瘤、纤维肉瘤、移行上皮细胞癌等肾癌；肾母细胞瘤；移行上皮细胞癌、鳞状上皮细胞癌、腺癌、腺肉瘤这样的膀胱癌；腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌这样的唾液腺癌；鳞状上皮细胞癌和疣这样的咽癌；基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、肢端雀斑样黑素瘤这样的皮肤癌；鳞状上皮细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞状上皮癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣癌和燕麦细胞(小细胞)癌这样的食道癌。

靶癌细胞2的优选的一个例子是在血液中循环的癌细胞(肿瘤细胞)。靶癌细胞2可以为2种以上，此时，癌细胞检测用高分子膜1可以形成与2种以上的靶癌细胞2对应的铸型1a。应予说明，含有癌细胞的细胞在其外表面具有来自唾液酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等的糖链的羧基、硫酸基，细胞表面在液体中由于该羧基、硫酸基的电离具有负电荷。

接着，一边参照图3一边对癌细胞检测用高分子膜1的制造方法进行说明。癌细胞检测用高分子膜1能够通过包括以下工序的方法适当地制造：

在靶癌细胞2的存在下，将单体聚合而形成摄入有靶癌细胞2的含有癌细胞的高分子膜5的聚合工序S101；以及

除去含有癌细胞的高分子膜5所摄入的靶癌细胞2的至少一部分的癌细胞除去工序S102。

该制造方法中，首先，如图3(a)所示，准备第1电极11、含有靶癌细胞2和单体(吡咯等)的液体12，使液体12与第1电极11上接触而配置。液体12的单体浓度可以为1mM～10M左右，靶癌细胞2的数量可以为1～10⁸个左右。

接着，聚合工序S101中，进行将第1电极11作为阳极、将对电极(未图示)作为阴极的电解，通过单体的氧化聚合反应(电解聚合反应)在第1电极11上形成摄入有靶癌细胞2的含有癌细胞的高分子膜5(参照图3(b))。单体为例如吡咯时，形成在第1电极11上的高分子膜为聚吡咯。该聚合工序S101中，由于单体在第1电极11释放电子，因此，所形成的高分子具有正电荷，为了补偿该正电荷，在表面具有负电荷的靶癌细胞2作为掺杂阴离子被高分子膜有效地摄入。

可以通过聚合工序S101中的聚合时间、液体12中的单体浓度的调整等来控制最终得到的癌细胞检测用高分子膜1的膜厚。癌细胞检测用高分子膜1所具有的铸型1a的数量可以通过液体12中的靶癌细胞2的浓度、单体与靶癌细胞2的浓度比等进行控制。另外，铸型1a的数量也可以通过调整后述的癌细胞除去工序S102中的靶癌细胞2的除去率(以下，也称为“脱掺杂率”)进行控制。

接着，癌细胞除去工序S102中，如图3(c)所示，除去含有癌细胞的高分子膜5所摄入的靶癌细胞2的至少一部分，得到具备具有与靶癌细胞2的立体结构的一部分互补的三维结构的铸型1a的癌细胞检测用高分子膜1。癌细胞检测用高分子膜1可以部分具有没有除去靶癌细胞2而保持摄入靶癌细胞2的状态的铸型1a。

作为靶癌细胞2的除去方法，可举出以下的方法。

a)使用药剂，至少部分溶解或破坏含有癌细胞的高分子膜5所摄入的靶癌细胞2，使其体积减小而除去的方法；

b)利用渗透压，使含有癌细胞的高分子膜5所摄入的靶癌细胞2的体积减小而除去的方法；

c)使用药剂，将构成含有癌细胞的高分子膜5的高分子膜与靶癌细胞2之间的静电相互作用至少部分中和而除去的方法；

d)进行方法a)～c)中的任1种以上的处理后，对含有癌细胞的高分子膜5进行过氧化处理而除去的方法。

上述a)和b)的方法是减小所摄入的靶癌细胞2的尺寸而容易从铸型1a释放靶癌细胞2的方法。作为方法a)中使用的药剂，可举出表面活性剂(非离子性表面活性剂等)、螯合剂(EDTA、EGTA、NTA、DTPA、HEDTA等)等。

作为方法b)，可举出例如使氯化钠这样的盐的溶液与含有癌细胞的高分子膜5接触的方法。作为方法c)中使用的药剂，可举出将含有癌细胞的高分子膜5所摄入的靶癌细胞2所具有负电荷至少部分中和的阳离子性分子(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸)、将构成含有癌细胞的高分子膜5的高分子膜的正电荷至少部分中和的阴离子性分子(例如，肝素钠)。

通过方法d)中的过氧化处理，含有癌细胞的高分子膜5的高分子膜成为电中性，因此，能够使靶癌细胞2有效地从铸型1a释放(脱掺杂)。含有癌细胞的高分子膜5的高分子膜为例如聚吡咯时，高分子膜通过该过氧化处理而成为过氧化聚吡咯。过氧化处理在方法a)～c)中的任1种以上的处理无法有效地除去靶癌细胞2时有用，通过方法a)～c)中的任1种以上的处理能够有效地除去靶癌细胞2时，未必需要过氧化处理。与其相反，能够除去靶癌细胞2时，也可以不实施方法a)～c)而仅通过过氧化处理来除去靶癌细胞2。

由于过氧化处理产生癌细胞检测用高分子膜1的固化，因此，在将通过除去靶癌细胞2而形成的铸型1a的三维结构固定的方面也是有利的。过氧化处理例如可以通过在使从中性至碱性的范围内的液体(该液体可以为将聚合工序S101后的液体12调整到中性至碱性的范围内的液体)与高分子膜的表面接触的状态下，在第1电极11与对电极(未图示)之间施加电压来进行。

应予说明，可以与癌细胞除去工序S102中的上述方法a)～d)的处理一同组合进行加温处理、超声波处理等。

聚合工序S101中的电解聚合反应中使用的第1电极11没有特别限定，例如可以为金电极、金与铬的多层电极、金与钛的多层电极、银电极、银与铬的多层电极、银与钛的多层电极、铅电极、铂电极、碳电极等。第1电极11的形成有含有癌细胞的高分子膜5的面优选实施粗面化处理。通过粗面化处理，与含有癌细胞的高分子膜5的密合性提高，能够稳定地制造癌细胞检测用高分子膜1。另外，通过粗面化处理，具有扩大电极的表面积这样的效果。例如，使用金电极作为第1电极11时，对金电极表面实施等离子体蚀刻并在之后将金纳米粒子固定，由此能够进行粗面化处理。第1电极11的表面粗糙度以中心线平均粗糙度计，例如为0.4～50μm。

＜癌细胞检测装置＞

本发明的癌细胞检测装置利用上述的癌细胞检测用高分子膜1。因此，利用本发明的癌细胞检测装置，能够以非标记(即，不使用标记物而直接地)迅速并简便地检测靶癌细胞2，另外，靶癌细胞2的检测特异性优异。

本发明的癌细胞检测装置是基于靶癌细胞2在铸型1a中的捕获状态来检测靶癌细胞2的装置，优选除具备上述的癌细胞检测用高分子膜1的检知部以外还进一步具备用于检知靶癌细胞2在铸型1a中的捕获状态的检知部。用于检知靶癌细胞2在铸型1a中的捕获状态的检知部可以检知例如由于靶癌细胞2的捕获而产生的癌细胞检测用高分子膜1的质量变化、导电特性变化、电容量变化、光反射率变化或温度变化等。通过这样的捕获状态的检知方法，能够实现靶癌细胞2的迅速且简便的检测。作为质量变化的检知方法的具体例，可举出利用水晶振子的方法，更具体而言，可举出检知水晶振子的共振频率的变化的方法。

位于检测部的癌细胞检测用高分子膜1的铸型1a中的靶癌细胞2的捕获(摄入)可以通过使含有靶癌细胞2的试样液与癌细胞检测用高分子膜1的具有铸型1a的表面接触来进行。此时，靶癌细胞2向上述表面的方向移动的驱动力可以为带负电的靶癌细胞2与带正电的癌细胞检测用高分子膜1的静电相互作用、靶癌细胞2在上述表面的沉淀、靶癌细胞2在试样液中的扩散等。但是，为了能够更有效且迅速、进而检测灵敏度良好地检测靶癌细胞2，本发明的癌细胞检测装置优选进一步具备将试样液中所含的靶癌细胞2向上述表面的方向诱导的诱导部。作为用于促进这样的靶癌细胞2向检测部移动的诱导部，可举出利用介电电泳的诱导部、利用电泳的诱导部、使试样液产生流动的诱导部等。

介电电泳(Dielectrophoresis；DEP)是位于不均匀电场内的粒子(微小物质)通过特定电场与由该特定电场诱导的偶极子力矩的相互作用进行移动的现象。可以通过在1对电极间施加交流电压而产生介电电泳。

通过诱导部的工作，试样液中所含的靶癌细胞2(但是，试样液可以有时也不含靶癌细胞2)被引诱到检测部的癌细胞检测用高分子膜1的方向。此时，不仅靶癌细胞2，非靶癌细胞这样的其它微小物质也被引诱到癌细胞检测用高分子膜1的方向，但具有与铸型1a的三维结构互补的立体结构的靶癌细胞2被选择性地捕获到铸型1a内，与铸型1a不互补的非靶癌细胞这样的其它微小物质没有被捕获到铸型1a内。

将本发明的癌细胞检测装置的优选的一个例子的简要结构示于图4。图4所示的癌细胞检测装置100除具备癌细胞检测用高分子膜1的检测部以外，还包括利用介电电泳的诱导部、利用水晶振子的检知部。

若更具体地进行说明，则癌细胞检测装置100包括：保持试样液40的室(收容槽)20；在室20的底部以与试样液40接触的方式配置的作为检测部的癌细胞检测用高分子膜1；由层叠于与癌细胞检测用高分子膜1的具有铸型1a侧相反的一侧的面的第1电极11、浸渍于试样液40内的第2电极(第1对电极)30以及与第1电极11和第2电极30连接的交流电源50构成的利用介电电泳的诱导部；由水晶振子60、振荡电路65以及具有频率计数器的控制器66构成的利用水晶振子的检知部，所述水晶振子60是作为第1电极11(兼用作诱导部的一个电极)、水晶片61与第3电极(第2对电极)62的层叠体。第1电极11可以直接使用上述癌细胞检测用高分子膜1的制造方法中使用的第1电极。

水晶振子60是应用于石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance；QCM)法的元件。QCM法是利用根据附着于水晶振子的电极上的物质的质量而振荡的共振频率定量减少的特性，将从皮克到纳克级的微量的质量变化作为共振频率变化进行监控，由此实时测定质量变化的方法。

使用癌细胞检测装置100的癌细胞检测方法例如如下。首先，在室20内添加试样液40。然后，利用交流电源50在1对电极之间，即在第1电极11与第2电极3之间施加交流电压，由此通过介电电泳将试样液40内所含的靶癌细胞2向作为检测部的癌细胞检测用高分子膜1的具有铸型1a的表面的方向进行诱导。应予说明，适当调整第2电极30的构成和形状、施加电压和频率值、试样液40的组成等以有效地产生介电电泳。

另一方面，与介电电泳开始相匹配地通过振荡电路65在第1电极11与第3电极62之间施加交流电压，使水晶片61振动来进行共振频率变化的监控。若癌细胞检测用高分子膜1的铸型1a捕获有靶癌细胞2，则置于水晶振子60上的物质的质量增加，伴随于此，水晶振子60的共振频率减少。水晶剪切应力＝2.95×10¹¹g/cm·sec²、基准频率＝9.00MHz、谐波次数＝3，因此，在水晶振子60的表面积＝0.196cm²、水晶振子60的密度＝2.65g/cm³时，质量变化Δm(pg)与共振频率变化ΔF(Hz)的关系由下式表示。

Δm＝-357ΔF。

控制器66内的频率计数器收到来自振荡电路65的信号来测定共振频率值。可以根据共振频率值的变化来检测质量变化以及靶癌细胞2的捕获状态。

应予说明，可以使用与图4所示的装置类似的装置实施第1电极11表面的粗面化处理、含有癌细胞的高分子膜5的形成以及含有癌细胞的高分子膜5的过氧化处理等。例如，含有癌细胞的高分子膜5可以通过在室20内添加含有靶癌细胞2和单体的液体12代替试样液40，连接直流电源代替交流电源50进行电解聚合反应而形成。此时，除第1电极11以外，还可以另外在液体12中浸渍参比电极来进行电位调整。通过使用具备水晶振子60的装置来实施含有癌细胞的高分子膜5的形成，能够根据共振频率值的变化对所形成的含有癌细胞的高分子膜5的膜厚进行监控，因此容易控制最终得到的癌细胞检测用高分子膜1的膜厚。

同样地，对于含有癌细胞的高分子膜5的过氧化处理，也只要在室20内添加中性至碱性的范围内的液体(或者将含有癌细胞的高分子膜5形成后的液体12调整至中性至碱性的范围内的液体)代替试样液40，连接直流电源代替交流电源50来施加直流电压即可。此时，除第1电极11以外，也可以另外在液体12中浸渍参比电极来进行电位调整。通过使用具备水晶振子60的装置实施过氧化处理，能够对脱掺杂率(癌细胞除去工序S102中的靶癌细胞2的除去率)进行监控，并且能够容易地对其进行控制。

利用本发明的癌细胞检测装置，也能够在数分钟～数十分钟左右检测靶癌细胞，能够远比CTC检查法迅速且简便地检测靶癌细胞。与CTC检查法对比而言，本发明的癌细胞检测装置和检测法在不使用标记物这样的方面也是有利的，未必需要通过熟练技术人员进行检测操作。

具备具有与靶癌细胞的立体结构的一部分互补的三维结构的铸型的本发明的高分子膜作为癌细胞的检测用自不必言，也可以用于癌细胞的回收、除去、浓缩、定量、癌细胞种的确定等。另外，本发明的高分子膜也可以用于监控从正常细胞向癌细胞的转化。进而，本发明的高分子膜也可以用于红血球、白血球的形状异常的检测。

实施例

以下，示出实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些例子。

以下的实施例中，

·含有癌细胞的高分子膜5和癌细胞检测用高分子膜1的制作使用电化学测定系统(ALS公司制的“Model842B”)作为恒电位仪。

·参比电极使用Ag/AgCl(饱和KCl)，第2电极(第1对电极)30使用Pt棒(直径1mm、长度4cm，Nilaco株式会社制)。以下的实施例中，电位记载相对于该参比电极的电位的值。

·水晶振子60使用第1电极11、水晶片61与第3电极(第2对电极)62的层叠体(电极面积0.196cm²、密度＝2.65g/cm³、基本振动频率9MHz、水晶剪切应力＝2.95×10¹¹g/cm·sec²、谐波次数＝3、AT切割、方形，Seiko EG&G株式会社制)。第1电极11和第3电极62均从水晶片61侧依次层叠Ti层(100nm厚)、Au层(300nm厚)。

·在制作含有癌细胞的高分子膜5和癌细胞检测用高分子膜1时的共振频率变化(质量变化)使用石英晶体微天平(Seiko EG&G株式会社制的“QCM934”)进行测定。

·交流电压的产生使用波形发生装置(7075、Hioki、Japan)和放大器(HAS 4101、NF、Japan)。

·使用的水全部是在过滤后进行了pH调节、反渗透膜、离子交换、紫外杀菌处理的超纯水。

＜实施例1＞

(1)第1电极的粗面化处理

为了提高与过氧化聚吡咯膜的密合性，在水晶振子60的第1电极11的表面(Au层表面)，依照以下的步骤进行水晶振子60的第1电极11表面的粗面化处理。

1.利用等离子体蚀刻装置(SEDE/meiwa fosis)对Au层表面进行30秒钟蚀刻处理。

2.将水晶振子60设置在与图4同样的装置的室20(井型室，SeikoEG&G株式会社制的“QA-CL4”)的底部。然后，将含有粒径30nm的柠檬酸保护金纳米粒子(0.0574wt％)的溶液500μL添加到室20中，在室温下放置24小时，使其附着于金纳米粒子的第1电极11的表面。

3.用水清洗第1电极11的表面后，将混合十六烷基三甲基溴化铵水溶液(0.1M)9mL、四氯金(III)酸(塩化金(III)酸四塩化物)水溶液(0.01M)250μL、NaOH水溶液(0.1M)50μL、抗坏血酸水溶液(0.1M)50μL而得到的溶液500μL添加到室20中，在30℃下静置24小时，进行金纳米粒子的固定化。

4.除去室20内的溶液，用水清洗第1电极11。

(2)癌细胞的复原和培养

作为癌细胞，从独立行政法人理化学研究所生物资源中心细胞材料开发室(RIKEN BRC CELL BANK)购入CCRF-CEM(来自人类T淋巴细胞白血病的细胞株；RBRC-RCB1980)的冷冻标本，依照以下的步骤进行复原和培养。以下的操作全部在洁净工作台内进行。

1.将通过在56℃下孵育30分钟而灭活的胎牛血清FBS(Gibco公司)100mL加入细胞培养液(RPMI1640，Gibco公司)900mL中，在室温下静置约1天，制备加入有血清的细胞培养液(RPMI(+))。2.使上述冷冻标本的溶解物1mL分散在RPMI(+)9mL中，离心分离后(1500rpm，3分钟)，通过倾析除去上清液。在沉淀物(细胞)中加入RPMI(+)10mL，通过移液进行悬浮。将加入有该细胞的盘在CO₂培养箱(CO₂浓度5％)内培养约1～2天(作为培养基的RPMI(+)的初始pH7.4、温度37℃)。

使用血球计数盘(Sunlead有限公司制)测定培养后的细胞数，结果为2.0×10⁶个/mL(培养前：2.0×10⁵个/mL)。通过碘化丙锭(Propidium iodide)染色，利用共聚焦激光显微镜观察确认了培养后的细胞的生存率约为95％。共聚焦激光显微镜观察使用FV1200(OLYMPUS，Japan)进行。

使用扫描式电子显微镜(SEM，S-4700，Hitachi，Japan)进行培养后的CCRF-CEM的形状观察。将结果示于图5。确认了CCRF-CEM为球状细胞，直径约为8μm。

(3)含有靶癌细胞和单体的液体的制备

将上述(2)中得到的培养后的细胞液1.0mL进行离心分离后(3000rpm，1分钟)，通过倾析除去上清液。将倾析后的沉淀物(细胞)和含有磷酸缓冲液(0.2M，pH2.56)的0.1M吡咯水溶液0.5mL混合而得到含有靶癌细胞(CCRF-CEM)和吡咯的液体12。

(4)癌细胞检测用高分子膜的制作

依照以下的步骤，在水晶振子60的第1电极11上形成作为癌细胞检测用高分子膜1的过氧化聚吡咯膜。

1.在将上述(1)中实施了粗面化处理的水晶振子60配置在室20的底部的与图4相同的装置(其中，使用直流电源代替交流电源50，具备参比电极。)的室20内添加上述(3)中制备的500μL的液体12，在液体12内插入第2电极30和参比电极。

2.将第1电极11作为工作电极，通过进行恒定电位电解(+0.975V)在第1电极11上形成摄入有靶癌细胞的含有癌细胞的高分子膜5(聚吡咯膜)(聚合工序)。在聚合工序期间，使用石英晶体微天平对水晶振子60的共振频率变化ΔF进行监控，进行恒定电位电解直至共振频率变化ΔF为-145kHz为止。

3.在制作的含有癌细胞的高分子膜5中滴加非离子性表面活性剂(Triton-X，10wt％)500μL，在室温下放置约1天后，进一步滴加5mg/mL肝素钠水溶液500μL，在室温下静置3小时，进行高分子膜的正电荷缓和处理。然后，将室20内的溶液全部除去，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗聚吡咯膜。

4.在室20内添加0.1M的NaOH水溶液，在该水溶液内插入第2电极30和参比电极。将第1电极11作为工作电极，通过施加20分钟恒定电位+0.975V来实施过氧化处理，得到由过氧化聚吡咯膜构成的癌细胞检测用高分子膜1。在过氧化处理期间，使用石英晶体微天平对水晶振子60的共振频率变化ΔF进行监控。利用激光显微镜测得的癌细胞检测用高分子膜1的膜厚为2μm。

(5)与癌细胞检测用高分子膜的制作有关的结果

图6中示出聚合工序后的聚吡咯膜(含有癌细胞的高分子膜5)的表面的电子显微镜照片。电子显微镜使用上述的扫描式电子显微镜。观察了在聚吡咯膜的表面摄入有CCRF-CEM的状况。根据电子显微镜照片，求出摄入的细胞数，结果为1.6×10⁶个/cm²。

图7是表示聚合工序中的时间与水晶振子60的共振频率的关系的图。将恒定电位电解开始时刻的时间设为0秒。图7中纵轴为共振频率。聚合工序中的共振频率变化ΔF为-145kHz。由此，基于上述的质量变化Δm与共振频率变化ΔF的关系式，算出含有癌细胞的高分子膜5的质量为51.8μg。

图8中示出过氧化工序后的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜1)的表面的电子显微镜照片。基本上未观察到铸型内所摄入的细胞，在膜表面形成细胞的铸型。根据电子显微镜照片(尺寸：400μm×300μm)，求出铸型的数量，结果为1.5×10⁶个/cm²，这相当于摄入的细胞数的93％(脱掺杂率＝93％)。

图9是表示过氧化工序中的时间与水晶振子60的共振频率的关系的图。将过氧化工序中的恒定电位施加时刻的时间设为0秒。图9中纵轴为共振频率。若摄入CCRF-CEM的聚吡咯膜进行过氧化，则水晶振子60的共振频率随着时间而增加。共振频率的增加量为100kHz，因此，基于上述的质量变化Δm与共振频率变化ΔF的关系式，算出高分子膜的质量减少量为35.7μg。可以理解为这是由于CCRF-CEM从铸型中释放而引起的。

(6)靶癌细胞的检测实验

使用具备上述(4)中得到的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜1)的图4所示的构成的癌细胞检测装置，通过以下的步骤进行作为靶癌细胞的CCRF-CEM的检测实验。将上述(2)中得到的培养后的细胞液500μL(细胞浓度：2.0×10⁶个/mL)添加到室20内。然后，在第1电极11与第2电极30之间施加300秒钟交流电压，通过介电电泳将CCRF-CEM向癌细胞检测用高分子膜1的具有铸型的表面诱导，并且在交流电压施加期间，使用石英晶体微天平对水晶振子60的共振频率变化ΔF进行监控。共振频率变化ΔF如下求得：将添加PBS代替细胞液时的空白作为基线，由基线减去测定开始后(交流电压施加后)300秒后的值而求得。对于交流电压，利用波形发生装置(7075，Hioki，Japan)产生交流电压(波形：正弦波，电压：0.2Vpp，频率：10MHz)，将其用放大器(HAS 4101，NF，Japan)将电压放大至10倍，作为2Vpp进行施加。

另外，添加后述的实施例2的(2)中得到的培养后的细胞液(含有作为非靶癌细胞的THP-1作为癌细胞的细胞液)代替添加上述(2)中得到的培养后的细胞液，除此以外，与上述同样地进行检测实验。

(7)靶癌细胞的检测实验的结果

将上述检测实验的结果示于图10～图11。图10是表示各癌细胞(CCRF-CEM或THP-1)检测时的交流电压施加时间与水晶振子的共振频率的关系的图，将添加PBS代替细胞液时的空白的结果一并示出。图10中纵轴为共振频率。图11是将癌细胞为靶癌细胞CCRF-CEM时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF与癌细胞为非靶癌细胞THP-1时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF进行比较的图。

如图10～图11所示，对以CCRF-CEM为靶癌细胞的高分子膜添加CCRF-CEM时，共振频率大幅减少，另一方面，添加作为非靶癌细胞的THP-1时，与空白样同样，共振频率几乎没有看到变化。共振频率的减少意味着水晶振子表面的质量增加，添加CCRF-CEM时的质量增加意味着与铸型适合的CCRF-CEM的摄入。另一方面，添加与铸型不适合的THP-1时，几乎不会产生癌细胞在铸型中的摄入。如此，可以判断本实施例的癌细胞检测用高分子膜1高精度地识别癌细胞的种类(特异性地检测靶癌细胞)。

＜实施例2＞

(1)第1电极的粗面化处理

与实施例1同样地进行水晶振子60的第1电极11表面的粗面化处理。

(2)癌细胞的复原和培养

作为癌细胞，从独立行政法人理化学研究所生物资源中心细胞材料开发室(RIKEN BRC CELL BANK)购入THP-1(人急性单核细胞白血病；RBRC-RCB1189)的冷冻标本，通过与实施例1同样的步骤进行复原和培养。

使用血球计数盘(Sunlead有限公司制)测定培养后的细胞数，结果为1.0×10⁶个/mL。通过碘化丙锭染色，利用共聚焦激光显微镜观察确认了培养后的细胞的生存率约为95％。另外，使用上述扫描式电子显微镜进行培养后的THP-1的形状观察。将结果示于图12。确认了THP-1为球状细胞，直径约为10μm。

(3)含有靶癌细胞和单体的液体的制备

使用上述(2)中得到的培养后的细胞液1.0mL，除此以外，与实施例1同样地得到含有靶癌细胞(THP-1)和吡咯的液体12。

(4)癌细胞检测用高分子膜的制作

使用上述(3)中制备的液体12，除此以外，与实施例1同样地制作摄入有靶癌细胞的含有癌细胞的高分子膜5(聚吡咯膜)，接着，制作由过氧化聚吡咯膜构成的癌细胞检测用高分子膜1。本实施例中，在聚合工序期间，使用石英晶体微天平对水晶振子60的共振频率变化ΔF进行监控，进行恒定电位电解直至共振频率变化ΔF为-140kHz为止。利用激光显微镜测得的癌细胞检测用高分子膜1的膜厚为2μm。

(5)与癌细胞检测用高分子膜的制作有关的结果

图13中示出聚合工序后的聚吡咯膜(含有癌细胞的高分子膜5)的表面的电子显微镜照片。电子显微镜使用上述扫描式电子显微镜。观察在聚吡咯膜的表面摄入有THP-1的状况。根据电子显微镜照片，求出摄入的细胞数，结果为6.7×10⁵个/cm²。

图14是表示聚合工序中的时间与水晶振子60的共振频率的关系的图。将恒定电位电解开始时刻的时间设为0秒。图14中纵轴为共振频率。聚合工序中的共振频率变化ΔF为-140kHz。由此，基于上述的质量变化Δm与共振频率变化ΔF的关系式，算出含有癌细胞的高分子膜5的质量为50.0μg。

图15中示出过氧化工序后的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜1)的表面的电子显微镜照片。基本上未观察到铸型内所摄入的细胞，在膜表面形成细胞的铸型。根据电子显微镜照片(尺寸：400μm×300μm)，求出铸型的数量，结果为6.0×10⁵个/cm²，这相当于摄入的细胞数的90％(脱掺杂率＝90％)。

图16是表示过氧化工序中的时间与水晶振子60的共振频率的关系的图。将过氧化工序中的定电位施加时刻的时间设为0秒。图16中纵轴为共振频率。若摄入THP-1的聚吡咯膜进行过氧化，则水晶振子60的共振频率随着时间而增加。共振频率的增加量为20kHz，因此，基于上述的质量变化Δm与共振频率变化ΔF的关系式，算出高分子膜的质量减少量为7.14μg。可以理解为这是由于THP-1从铸型中释放而引起的。

(6)靶癌细胞的检测实验

使用THP-1作为靶癌细胞，除此以外，与实施例1同样地使用具备上述(4)中得到的过氧化聚吡咯膜(癌细胞检测用高分子膜1)的图4所示的构成的癌细胞检测装置进行靶癌细胞的检测实验。作为室20内添加的细胞液，使用上述(2)中得到的培养后的细胞液(细胞浓度：1.0×10⁶个/mL)。

另外，添加实施例1的(2)中得到的培养后的细胞液(含有作为非靶癌细胞的CCRF-CEM作为癌细胞的细胞液)代替添加上述(2)中得到的培养后的细胞液，除此以外，与上述同样地进行检测实验。

(7)靶癌细胞的检测实验的结果

将上述检测实验的结果示于图17～图18。图17是表示各癌细胞(THP-1或CCRF-CEM)检测时的交流电压施加时间与水晶振子的共振频率的关系的图，将添加PBS代替细胞液时的空白的结果一并示出。图17中纵轴为共振频率。图18是将癌细胞为靶癌细胞THP-1时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF与、癌细胞为非靶癌细胞CCRF-CEM时的交流电压施加时间300秒时的共振频率变化ΔF进行比较的图。

如图17～图18所示，对以THP-1为靶癌细胞的高分子膜添加THP-1时，共振频率大幅减少，另一方面，添加作为非靶癌细胞的CCRF-CEM时，与空白同样，共振频率几乎没有看到变化。共振频率的减少意味着水晶振子表面的质量增加，添加THP-1时的质量增加意味着与铸型适合的THP-1的摄入。另一方面，添加与铸型不适合的CCRF-CEM时，几乎不会产生癌细胞在铸型中的摄入。如此，可以判断本实施例的癌细胞检测用高分子膜1能够高精度地识别癌细胞的种类(特异性地检测靶癌细胞)。

符号说明

1癌细胞检测用高分子膜、1a铸型、2靶癌细胞、5含有癌细胞的高分子膜、11第1电极、12含有靶癌细胞和单体的溶液、20室、30第2电极(第1对电极)、40试样液、50交流电源、60水晶振子、61水晶片、62第3电极(第2对电极)、65振荡电路、66控制器、100癌细胞检测装置、A癌细胞检测用高分子膜的膜厚。