用于检测查加斯病的抗原组合物的制作方法

查加斯病是由鞭毛虫原生动物克氏锥虫(trypanosomacruzi)引起的热带寄生虫病。克氏锥虫通常通过昆虫载体(即锥猎蝽亚科(subfamilytriatominae)(猎蝽科(familyreduviidae)，德文：“raubwanzen”)的吸血“亲吻虫”)传播给人类和其他哺乳动物。该疾病也可通过输血和器官移植、摄入被寄生虫污染的食物传播以及从母亲传播到胎儿。克氏锥虫以不同形式和发育阶段出现。繁殖形式被称为短膜虫期(epimastigote)，其恰好在接吻虫已经在包括人类的被感染的动物上吸血后适应。短膜虫移动到该虫的直肠细胞壁上。该虫在随后的吸血（其中该虫排便）中经由其粪便将病原体转移至下一宿主。感染形式被称为锥鞭毛体，并通过咬伤进入人体。因此，可以在人血中发现锥鞭毛体。发现的另一种形式(例如在心肌细胞的细胞质中发现的另一种形式)称为无鞭毛体或微鞭毛体(micromastigote)。在克氏锥虫的生命周期期间，无鞭毛体变为锥鞭毛体，其可以在下一次吸血中被亲吻虫吸入。查加斯病的症状在感染过程中有所不同。通常存在急性期，随后是慢性期。感染后也可存在潜伏期。各期可以无症状或威胁生命。在早期、急性期，症状通常是轻度的，通常在感染部位仅仅产生局部肿胀。初始急性期对抗寄生虫治疗有反应，治愈率为60-90％。4-8周后，具有活动性感染的个体进入查加斯病的慢性期，其对于慢性感染个体的60-80％在其整个寿命中无症状。在慢性期期间，一些患者发生心脏并发症，导致心脏扩大、心力衰竭、心率改变和猝死。导致进食或通便困难的肠道并发症也是慢性期典型的。抗寄生虫治疗也似乎延缓或预防疾病慢性期期间的疾病症状的发展，但根据美国疾病控制与预防中心，发展这些并发症中的一种或多种的平均寿命风险为约30％，这意味着这些慢性感染的个体仍将最终发展威胁生命的心脏和消化系统病症。目前可用的查加斯病的抗寄生虫治疗是苄硝唑和硝呋莫司，其可以在许多患者中引起临时副作用，包括皮肤病症、脑毒性和消化系统刺激。查加斯病主要出现在墨西哥、中美洲和南美洲的贫困农村地区；非常罕见地，该疾病在美国南部被发现。然而，通过这些国家的体外诊断方法，筛选献血者被克氏锥虫的感染。如今几种血清学诊断方法可用来检测克氏锥虫的感染，例如，通过间接免疫荧光、间接血细胞凝集、补体固定、免疫印迹技术和elisa检测针对克氏锥虫的抗体。还应用分子生物学方法(例如pcr)和复杂的媒介生物诊断方法。在媒介生物诊断法中，使载体传播的感染物，实验室培育的、无病原体昆虫(此处为：接吻虫)从患者吸取血液。然后检查昆虫的肠内容物中病原体(此处为：克氏锥虫)的存在。这些方法中的每一种在灵敏度和特异性方面都显示出其自身的弱点和优势，因此目前还没有可用的金标准方法。在开始开发查加斯测定法用于检测抗体中，应用了且仍正在使用天然抗原裂解物。然而，使用裂解物，在该抗原组合物中仅代表克氏锥虫的三个发育阶段之一，使得存在错过其他两个阶段的感染的特定可能性。更现代的测定法应用代表克氏锥虫感染的所有阶段的重组抗原的混合物。当使用天然抗原裂解物时，诊断测定法经常面临在另一种寄生虫利什曼原虫感染的患者样品中观察到的特异性和交叉反应性中的问题。此外，由于克氏锥虫的复杂抗原组成，抗原裂解物的产生导致相当大的批次间变化。此外，非常经常地，基于天然裂解物的稀有试剂显示弱灵敏度，因为一些裂解物完全不含或不含足够的所有生命周期阶段的抗原。通过应用重组抗原，可以规避或避免上述挑战。然而，基于重组抗原组合物的用于检测查加斯病的商购测定试剂盒在灵敏度和特异性方面显示相当大的差异，使得客户(即商业或临床实验室或血液筛选单元)通常必须并行使用几个试剂盒以获得可靠的结果。因此，关于患者样品是否反应的决定基于通过几种基于不同抗原组合物的试剂盒对相同样品获得的阳性或阴性结果的大部分。显而易见的是，应用多种诊断测试的该耗时程序在经济上没有意义，因为其导致实验室设备和个人、时间、工作量和成本的增加。用于检测针对克氏锥虫抗原的抗体的血清学测定已经在现有技术文献中广泛描述，对于综述，参见例如silveira等人trendsinparasitology2001,vol.17no.6。已经由几个实验室分离了与血清诊断相关的克氏锥虫重组抗原。这些基因中的几个具有串联重复序列。由于克氏锥虫表达的抗原蛋白数量极大(公共数据库中近似23000个预测的蛋白编码序列和假基因)，所以用于免疫测定的抗原的可能组合的数量非常巨大。尽管重组生产的方法已经知道了几十年，但仍然存在找出建立诊断测定法需要何种抗原的挑战。选择用于免疫诊断测定的合适抗原，必须记住考虑病原体的所有生命周期阶段的抗原，并且还应用这样的抗原，针对其的抗体可以在所有感染阶段(急性、窗口和慢性期)发现。同时，因为技术考虑(例如缺乏溶解性和稳定性，导致信号淬灭的不必要的交叉反应，避免与例如利什曼原虫的交叉反应性)以及还有经济考虑(因为每种抗原此外需要大规模开发、评估和生产)，抗原的数量不应超过约5或10。据silveria等人(同上)，商购的测定法通常使用六种或七种不同的克氏锥虫抗原的组合，有时也与源自克氏锥虫全长抗原的较短合成肽组合。提供高度灵敏的诊断测试的另一种方法基于多组分测定法，其应用大量已单独包被在分开珠粒上的各种克氏锥虫抗原。wo2009/017736和美国专利号8,329,411公开了用于检测生物样品中克氏锥虫感染的装置和方法。该设置包括16种不同的蛋白(选自最初的59种候选蛋白，其充当抗原)，其必须单独包被在标记的珠粒上，提供阵列样诊断工具。抗体，如果存在于样品中，则与这些包被的蛋白结合。因此，通过标记的二抗与样品抗体的结合来检测结合的抗体。尽管该程序对于研究方法有意义，但导致大量生产成本的大量抗原太昂贵，不能用作商业或临床实验室中的常规测定法。总之，本领域中已知用于检测来自感染个体的样品中的克氏锥虫抗体的免疫测定法应用大量不同的抗原来实现高灵敏度和特异性。仍然没有真正的金标准和经济实惠的测定法可用。因此，在提供这样的诊断组合物和方法时可以看到问题，所述诊断组合物和方法克服了用于检测克氏锥虫感染的现有技术测定法的重现性、灵敏度和特异性方面的缺点。该问题通过如权利要求中所指定的本发明来解决。发明概述本发明涉及适用于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫(trypanosomacruzi,t.cruzi)的抗体的多肽的组合物，其包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。本发明的一个进一步方面是适用于检测克氏锥虫抗体的多肽的组合物，其中多肽1f8包含seqidno.1，多肽jl7包含seqidno.2，且至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽包含至少一种选自seqidno.3(cruzipain)、seqidno.4(kmp-11)和seqidno.5(par2)的序列。具体而言，本发明聚焦于多肽的组合物，其由三种重组或合成产生的对克氏锥虫特异性的多肽组成，其中所述多肽为1f8、jl7和cruzipain。所述组合物中的多肽是1f8(其包含seqidno.1)、多肽jl7(其包含seqidno.2)和cruzipain(其包含seqidno.3)。在另一个实施方案中，存在于所述多肽组合物中的三种克氏锥虫特异性多肽1f8、j17和cruzipain分别由seqidno.1、2和3组成。另一个实施方案涉及生产适用于检测分离的样品中针对克氏锥虫的抗体的上述多肽的可溶性和免疫反应性组合物的方法。所述多肽组合物在用于检测克氏锥虫特异性抗体的体外诊断测定中的用途也是本发明的一部分。此外，本发明涉及用于检测分离的样品中对克氏锥虫特异性的抗体的方法(其中使用所述克氏锥虫多肽的组合物)以及包含所述克氏锥虫多肽的组合物的试剂盒。公开的氨基酸序列的说明：seqidno.1显示了克氏锥虫蛋白1f8(uniprot条目q4d1q2)，也称为fcabp、tc24或tc28；完全描述性名称：鞭毛钙结合蛋白3。seqidno.1显示氨基酸位置1-211。根据本发明，半胱氨酸残基可被丙氨酸(a)或丝氨酸(s)替换，以避免由于分子内二硫键的形成而导致的错误折叠。因此，半胱氨酸(c)自然出现的所有位置(在这种情况下为四个位置)都通过x标记；x=c、a或s。seqidno.2显示了下述的部分序列：克氏锥虫蛋白jl7(uniprot条目q4cs87)，也称为fra、ag1、h49；完全描述性名称：钙蛋白酶半胱氨酸肽酶，推定。seqidno.2显示了上述uniprot数据库条目的氨基酸位置62-287，得到长度为226个氨基酸的多肽。全长蛋白包含氨基酸1至1275。seqidno.3显示了下述的部分序列：克氏锥虫蛋白cruzipain(uniprot条目q9tw51)，也称为cruzain、gp51/57、ag163b6；完全描述性名称：主要半胱氨酸蛋白酶。seqidno.3显示了uniprot数据库条目的氨基酸位置6-135，得到长度为130个氨基酸的多肽，也称为c-cruzipain。全长蛋白包含氨基酸1至135。seqidno.4显示了下述的部分序列：克氏锥虫蛋白kmp-11(uniprot条目q9u6z1)，完全描述性名称：动质体(kinetoplastid)膜蛋白11。该蛋白包含氨基酸位置1至92。seqidno.5显示了下述的部分序列：克氏锥虫蛋白par2(uniprot条目q01530)，也称为pfr2；完全描述性名称：主要副鞭毛杆蛋白。seqidno.5显示了par2的c-末端部分(c-par2)，即uniprot数据库条目的氨基酸位置277-600，得到长度为324个氨基酸的多肽。全长蛋白包含氨基酸1至600。seqidno.6代表了完整大肠杆菌slyd氨基酸序列(196个氨基酸残基)，其也可经由uniprot数据库中的idp0a9k9得到。当slyd用作根据本发明的克氏锥虫多肽的分子伴侣融合配偶体时，在一个实施方案中，使用跨越下列序列的氨基酸残基1-165的大肠杆菌slyd的c-末端截短形式。在另一个实施方案中(如实施例1中所应用)，向根据本发明的多肽的n端末端添加两个slyd单元的串联版本。为了便于表达所得融合多肽后的克隆和重折叠，这两个slyd单元可以通过如seqidno.7中所示的接头序列分隔。seqidno.7显示了可用作融合多肽部分之间的柔性、可溶性和蛋白酶抗性间隔物或接头的富含甘氨酸的间隔物(包含通过丝氨酸分隔的三重甘氨酸单元)的氨基酸序列。seqidno.8显示了可以添加至根据本发明的多肽的n-端末端或在另一个实施方案中根据本发明的多肽的c端末端的六组氨酸标签。该标签用于促进蛋白纯化和重折叠。附图说明：图1(包含图1a和1b)含有表2，其显示通过使用重组克氏锥虫抗原变体(相比于三种商购的查加斯测定法)检测人血清中的抗克氏锥虫抗体的实验结果(还参见实施例4)。对于architectchagas测定法，如果信号/截止值之比(s/co)≥1.0，则样品被视为阳性(即含有克氏锥虫抗体)；如果s/co值为<0.8，则样品被视为阴性(无克氏锥虫抗体)，而如果s/co值≥0.8且<1.0，则样品被视为“equ”。“equ”意指不明确(或中间)，即结果在灰色区域中。根据商业提供者的说明，这些“equ”样品需要通过一种或两种额外的测定法来证实，以接收可靠的最终结果(多数决定法)。对于biolisachagas和novalischagasiggelisa，显示相应的s/co值。对于根据本发明的多肽，对于每种抗原显示绝对测量计数(cobas®e601分析仪，rochediagnosticsgmbh，实施例4)和个体截止值。图2(表3)，其含有用三种商购的用于检测人血清中的抗克氏锥虫抗体的查加斯测定法测试的样本的结果，以及与之相比，使用根据本发明的个别重组克氏锥虫抗原变体的结果(还参见实施例4)。图3(表5)显示了关于重组克氏锥虫抗原混合物相比于商业抗查加斯测定法的灵敏度的实施例6的实验数据。图4(表6)显示了有和无分子伴侣融合的重组克氏锥虫抗原的免疫反应性的比较(还参见实施例7)。图5(表7)显示了1f8的钙依赖性反应性的实验数据(实施例8)。发明详述如背景部分中所解释，现有技术中已知用于检测来自感染个体的样品中的克氏锥虫抗体的免疫测定法使用大量不同的抗原来实现高灵敏度和特异性。大多数情况下，患者是否被感染的决定基于不同免疫测定结果中的大部分。到目前为止，还没有金标准和经济实惠的测定法可用。令人惊讶的是，通过使用包含1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏锥虫特异性抗原的组合物或混合物，我们已经能够提供克服现有技术的缺点的诊断组合物和方法。就用于检测分离的患者样品中针对克氏锥虫的抗体的重现性、灵敏度和特异性而言，该新型组合物是相当的或甚至优异的。此外，仅三种克氏锥虫特异性抗原对于产生用于可靠地检测克氏锥虫特异性抗体的组合物或试剂盒是有必要的。所述组合物包含至少三种、四种或五种克氏锥虫多肽。在一个实施方案中，克氏锥虫特异性多肽的数目在3至5之间；在一个进一步实施方案中，三种多肽，即1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。在一个进一步实施方案中，所述组合物由三种克氏锥虫特异性抗原1f8、jl7和cruzipain组成。一个进一步实施方案是包含1f8、jl7、cruzipain和kmp-11的组合物。在另一个实施方案中，所述组合物由1f8、jl7、cruzipain和kmp-11组成。在又另一个实施方案中，所述组合物由seqidno.1(1f8)、seqidno.2(jl7)和seqidno.3(cruzipain)中公开的多肽组成。术语克氏锥虫(trypanosomacruzi(=t.cruzi))特异性抗原、克氏锥虫特异性多肽、克氏锥虫多肽和克氏锥虫抗原可以同义使用，并且各自指可以在任何天然存在的克氏锥虫品系中发现的多肽序列，其可通过国际蛋白数据库(诸如uniprot)获得。在本发明中，应用的抗原序列的氨基酸链显示约90个氨基酸(kmp-11)和至多约400个氨基酸(c-par2)之间的长度范围。在一个实施方案中，每个克氏锥虫抗原的长度在该范围内。如在实施例4、表2(图1a和1b)中可见，当使用每种多肽作为个别单一抗原时，包含1f8、jl7、cruzipain、kmp-11或par2肽序列的个别克氏锥虫多肽在免疫测定中都表现出显著的抗原性。然而，该实施例还显示，个别克氏锥虫抗原的反应性强烈地取决于个体患者血清。总是存在一些不能通过使用单一抗原来检测的样品。该发现很好地对应于与商购的查加斯测定的比较。看看表3(图2)，可以看到也不存在检测所有反应性样品的单一商购测定法(其各自使用至少四至十种不同的重组克氏锥虫特异性抗原)。为了可靠地检测克氏锥虫特异性抗体，每种样品必须通过所有三种商业测定法进行分析，以便在大多数方法(即三种商业测定法中的两种检测感染)来决定哪种样品是反应性的并且含有克氏锥虫特异性抗体。根据本发明，包含1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏锥虫特异性多肽的组合物显示约99.8％的特异性，其与商业测定法相当且一致(参见表4，实施例5)。我们测试了两种试剂盒变体，包含1f8、jl7和cruzipain的试剂盒1和包含1f8、jl7和cruzipain以及kmp-11的试剂盒2。此外，当与三种商业抗查加斯测定法相比时，两种试剂盒/组合物均显示优异的稀释灵敏度，如从实施例6和表5/图3可见。术语组合物意味着将分离的单独的克氏锥虫多肽组合成混合物。该术语不应包括这样的多肽：其已在一条单一氨基酸链上重组表达或合成(化学产生)、使得所有多肽作为多抗原-融合多肽位于仅一条多肽链上。换句话说，排除了天然不出现在单一多肽链上的几个表位的多表位融合抗原。相反，克氏锥虫多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽中的每一种在分开的多肽链上表达或作为分开的多肽链化学合成。在一个实施方案中，所述组合物由对克氏锥虫特异性的三种重组或合成产生的多肽组成，其中所述多肽是1f8、jl7和cruzipain。通过在一个容器或管中混合个别克氏锥虫多肽、导致产生组合物来产生组合物。所述组合物可以是液体，即将克氏锥虫多肽以水或缓冲液可溶形式添加至混合物。合适的缓冲液成分是本领域技术人员已知的。所述组合物也可以是固体，即其包含冻干或其它干燥形式的克氏锥虫抗原。在一个实施方案中，所述多肽的组合物包含根据seqidno.1的1f8氨基酸序列、根据seqidno.2的jl7序列，且至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽包含至少一种选自seqidno.3(cruzipain)、seqidno.4(kmp-11)和seqidno.5(par2)的序列。在另一个实施方案中，所述多肽的组合物包含多肽1f8、jl7和cruzipain。在又另一个实施方案中，所述组合物包含根据seqidno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)的多肽。在一个进一步实施方案中，所述组合物由包含seqidno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)的三种多肽组成。在一个进一步实施方案中，对于克氏锥虫特异性的部分由seqno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)组成。在另一个实施方案中，所述组合物由包含seqidno.1(1f8)、2(jl7)、3(cruzipain)和4(kmp-11)的多肽组成。表述“对于克氏锥虫特异性的部分由seqidno.1(或2或3等)组成”意味着例如seqidno.1是衍生自克氏锥虫中存在的抗原的唯一多肽部分，其存在于该多肽链上并与克氏锥虫特异性抗体反应。然而，添加非克氏锥虫特异性接头或肽性融合氨基酸序列是可能的，因为这些序列对于克氏锥虫不是特异性的，并且不被克氏锥虫特异性抗体所识别。根据本发明，所述组合物中还包括根据seqidno.1、2、3、4或5的1f8、jl7、cruzipain、kmp-11和par2抗原的变体。这也适用于存在于由三种克氏锥虫特异性多肽组成的组合物中的多肽1f8、jl7和cruzipain。该上下文中的术语“变体”涉及蛋白或基本上与所述蛋白相似的蛋白片段(即多肽或肽)。具体而言，变体可以是与最普遍的蛋白同种型的氨基酸序列相比显示氨基酸置换、缺失或插入的同种型。在一个实施方案中，这种基本相似的蛋白与蛋白的最普遍的同种型具有至少80％的序列相似性，在另一个实施方案中具有至少85％或至少90％的序列相似性，在仍另一个实施方案中具有至少95％的序列相似性。术语“变体”还涉及翻译后修饰的蛋白，诸如糖基化或磷酸化蛋白。根据本发明，变体被分类为这样，只要维持体外诊断免疫测定中的免疫反应性，即变体仍然能够结合并检测样品中存在的抗克氏锥虫抗体。“变体”也是已经例如通过将接头氨基酸序列、标记物、标签氨基酸序列或载体部分共价连接至多肽或抗原而修饰的多肽或抗原。根据本发明的多肽组合物在如本领域技术人员已知的生理缓冲条件下是可溶的。术语“对于克氏锥虫特异性”意味着所述多肽能够与存在于分离的样品诸如人血清中的克氏锥虫特异性的抗体结合或被其识别和结合。根据本发明的所有克氏锥虫特异性多肽都可以表达为与非克氏锥虫特异性多肽序列诸如折叠辅助分子如分子伴侣的融合蛋白。这些融合配偶体的目标是促进分析物特异性多肽的克隆、表达和纯化。然而，根据本发明，克氏锥虫特异性多肽可以同样地作为无任何分子伴侣融合配偶体的独立的多肽产生。在一个实施方案中，形成根据本发明的克氏锥虫特异性抗原的组合物的个别多肽在没有分子伴侣融合配偶体的情况下产生。实施例7和表6(图4)显示用于检测克氏锥虫特异性抗体的免疫测定中的抗原性不依赖于每种抗原的分子伴侣融合配偶体的存在。本发明还涉及产生适用于检测针对克氏锥虫的抗体的多肽的可溶性和免疫反应性组合物的方法。所有个别克氏锥虫特异性抗原都根据实施例1或2中描述的方法产生。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含可操作连接的编码第一克氏锥虫多肽1f8的重组dna分子，b)表达所述克氏锥虫多肽，和c)纯化所述克氏锥虫多肽，d)用表达载体重复步骤a)至d)，所述表达载体包含可操作连接的编码第二克氏锥虫多肽jl7的重组dna分子e)用表达载体重复步骤a)至d)，所述表达载体包含可操作连接的编码选自cruzipain、kmp-11和par2的第三克氏锥虫多肽的重组dna分子f)形成步骤c)、d)和e)中获得的克氏锥虫多肽的混合物，从而产生适合于检测针对克氏锥虫的抗体的多肽的可溶性和免疫反应性组合物。在一个实施方案中，上述详述的用于产生多肽组合物的方法涉及由三种重组产生的多肽组成的组合物。在这种情况下，用表达载体重复步骤e)，所述表达载体包含可操作连接的编码第三克氏锥虫多肽cruzipain的重组dna分子。本发明的另一方面是用于检测分离的样品中对于克氏锥虫特异性的抗体的方法，其中包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏锥虫多肽的组合物用作所述克氏锥虫抗体的捕获试剂和/或结合配偶体。在一个实施方案中，用于检测分离的样品中对于克氏锥虫特异性的抗体的方法应用由如上进一步描述的三种克氏锥虫多肽(其为1f8、jl7和cruzipain)组成的组合物。在一个实施方案中，多肽1f8包含seqidno.1，jl7包含seqidno.2且cruzipain包含seqidno.3。在又另一个实施方案中，1f8由seqidno.1组成，jl7由seqidno.2组成，且cruzipain由seqidno.3组成。用于上述克氏锥虫特异性抗体的检测的所述克氏锥虫多肽的组合物也可以通过前述段落的产生多肽的方法获得。在一个进一步方面，所述方法适用于检测所有可溶性免疫球蛋白亚类的克氏锥虫抗体，包括作为查加斯诊断的最相关亚类的igg和igm。用于检测抗体的免疫测定法是本领域技术人员众所周知的，用于进行此类测定的方法和实际应用和程序也是如此。根据本发明的克氏锥虫特异性抗原的组合物可用于改进用于检测抗克氏锥虫特异性抗体的测定，而不依赖于所使用的标记物且不依赖于检测模式(例如，放射性同位素测定、酶免疫测定、电化学发光测定等)或测定原理(例如，测试条测定、夹心测定、间接测试概念或均质测定等)。技术人员已知的所有生物液体可用作检测抗克氏锥虫抗体的样品。通常使用的样品是体液，如全血、血清、血浆、尿液或唾液。本发明的一个进一步方面是用于检测分离的样品中对于克氏锥虫特异性的抗体的方法，所述方法包括a)通过将体液样品与如上所定义的克氏锥虫多肽的组合物或与通过上述方法获得的克氏锥虫多肽的组合物混合而形成免疫反应混合物b)将所述免疫反应混合物保持一定时间段，所述时间段足以使体液样品中存在的针对所述多肽样品的组合物的抗体与所述克氏锥虫多肽的组合物免疫反应以形成免疫反应产物；和c)检测所述免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。在一个实施方案中，所述用于检测分离的样品中对于克氏锥虫特异性的抗体的方法以双抗原夹心(dags)形式进行。在此测定中，需要和利用抗体结合至少两个具有其两个(igg、iga、ige)或十个(igm)互补位的给定抗原的不同分子的能力。在所述dags免疫测定中，“固相抗原”和“检测抗原”的基本结构基本上相同，使得样品抗体在两种特异性抗原之间形成桥。因此，两种抗原必须是相同的或免疫交叉反应性的，使得一种抗体能够结合两种抗原。进行此测定的基本要求是一种或多种相关表位存在于两种抗原上。两种抗原之一可以结合固相，而另一抗原携带可检测的标记物。根据本发明，dags测定程序包括以下步骤：a)向分离的样品添加可以直接或间接地结合至固相的克氏锥虫多肽的第一组合物和克氏锥虫多肽的第二组合物，所述第一克氏锥虫多肽各自携带作为生物亲和(bioaffine)结合对的一部分的效应基团，且所述第二克氏锥虫多肽各自携带可检测的标记物，其中所述第一和第二克氏锥虫多肽特异性结合所述抗克氏锥虫抗体，b)形成包含第一克氏锥虫多肽、样品抗体和第二克氏锥虫多肽的免疫反应混合物，其中在形成免疫反应混合物之前、期间或之后添加携带所述生物亲和结合对的相应效应基团的固相，c)将所述免疫反应混合物保持一定时间段，所述时间段足以使体液样品中针对所述第一和第二克氏锥虫多肽的克氏锥虫抗体与所述第一和第二克氏锥虫多肽免疫反应以形成免疫反应产物，d)将液相与固相分离e)检测所述固相或液相或两者中所述免疫反应产物中的任一种的存在。在一个实施方案中，所述第一克氏锥虫多肽携带生物素部分作为生物亲和结合对生物素/链霉抗生物素蛋白的一部分，且所述第二克氏锥虫多肽用电化学发光钌络合物标记。本发明的另一个实施方案是包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏锥虫多肽的组合物在用于检测抗克氏锥虫抗体的体外诊断测试中的用途。在一个实施方案中，用于检测抗克氏锥虫抗体的体外诊断测试中的组合物由三种克氏锥虫多肽1f8、jl7和cruzipain组成。所述克氏锥虫多肽的组合物也可以通过如上进一步描述的产生多肽的方法获得。本发明的又另一方面是用于检测抗克氏锥虫抗体的试剂盒，其包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。在一个实施方案中，存在于所述试剂盒或抗克氏锥虫抗体的检测中的多肽由多肽1f8、jl7和cruzipain组成。所述试剂盒可用于检测抗克氏锥虫抗体的体外诊断测试，并且可以进一步含有分开小瓶中的对照和标准溶液以及一种或多种溶液中或冻干形式的另外的试剂与通常的添加剂、缓冲液、盐、洗涤剂等，以及本领域技术人员已知的使用说明书。同样对于试剂盒，所述克氏锥虫多肽的组合物也可以通过如上进一步描述的产生多肽的方法获得。在本发明的又另一个实施方案中，我们可以显示克氏锥虫抗原1f8的反应性取决于钙离子的存在。如实施例8/表7(图8)中所述，当1f8是克氏锥虫抗原组合物的一部分时，钙离子的添加导致免疫反应性的明显增加。此外，当克氏锥虫抗原组合物中使用1f8抗原(钙结合蛋白)时，向测定缓冲液中添加钙离子可以降低作为样品材料的血浆的回收效应(即血浆取样管中的抗凝血剂例如柠檬酸盐、edta或肝素的ca2+络合效应)。因此，本发明还涉及适合于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫的抗体的多肽的组合物，其包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽，其中所述组合物含有浓度为0.001至100毫摩尔/升，在一个实施方案中0.1至10毫摩尔/升，在另一个实施方案中0.5至5毫摩尔/升，在另一个实施方案中1至5毫摩尔/升，在又另一个实施方案中5毫摩尔/升的钙离子。钙可以以水溶性盐如例如氯化钙的形式添加。如上所详述的钙离子的添加也适用于适合于检测分离的生物样品中针对克氏锥虫的抗体的三种多肽的组合物，其中所述多肽为1f8、jl7和cruzipain。在一个实施方案中，多肽1f8包含seqidno.1，多肽jl7包含seqidno.2且多肽cruzipain包含seqidno.3。在又另一个实施方案中，所述多肽1f8、jl7和cruzipain分别由seqidno.1、2和3组成。钙离子的添加和限定的浓度范围也是上面进一步描述的包含多肽1f8、jl7和至少一种选自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的试剂盒以及具有由1f8、jl7和cruzipain组成的三种克氏锥虫特异性多肽的试剂盒的实施方案。所述试剂盒可以含有如以前定义的浓度范围内，在一个实施方案中，0.1至10毫摩尔/升的浓度的钙离子。本发明通过实施例部分进一步举例说明。具体而言，实施例举例说明，我们已经开发并生成了克氏锥虫特异性多肽的变体，其当作为至少三种不同抗原(在一个实施方案中，由三种抗原组成)的新型组合物应用时，在用于检测克氏锥虫特异性抗体的免疫测定中显示就特异性和灵敏度而言优异的结果。实施例1具有分子伴侣融合的克氏锥虫抗原的克隆和纯化编码表1中用前缀“ecss”表示的克氏锥虫抗原的合成基因购自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)。基于novagen(madison,wi,usa)的pet24a表达质粒，进行以下克隆步骤。用ndei和xhoi消化载体，并插入包含串联-slyd和各自克氏锥虫抗原的半合成盒。将所得质粒的插入物测序，并发现其编码所需融合蛋白。产生融合蛋白的克氏锥虫多肽(seqidno.1-5)和大肠杆菌slyd分子伴侣部分(seqidno.6)的氨基酸序列显示于本发明的序列方案中。将两个slyd单元(串联slyd)融合至各自克氏锥虫多肽的n端末端。所有重组克氏锥虫融合多肽变体含有c末端六组氨酸标签(seqidno.8)，以促进ni-nta辅助的纯化和重折叠。seqidno.概述于表1中。所有克氏锥虫分子伴侣融合抗原都根据相同的方案纯化和重折叠，而无论特定多肽链中是否存在半胱氨酸残基。使携带表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)细胞在加有卡那霉素(30µg/ml)的lb培养基中生长至od600为1，并通过添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最终浓度而诱导细胞溶质过表达，生长温度为37℃。诱导后4小时，通过离心(5000xg，20分钟)而收获细胞，冷冻并储存于-20℃。对于细胞裂解，将冷冻的沉淀物重悬浮于每50ml缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物)25mm磷酸钠ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase®、1片complete®和1片complete®edta-free中，并通过高压均质化来裂解所得悬浮液。将粗裂解物补充直至7mguhcl(盐酸胍)、50mm磷酸钠、5mm咪唑，并搅拌1小时。离心后，将上清液施加至预先平衡于缓冲液a(50mm磷酸钠ph8.5、7.0mguhcl、5mm咪唑)中的ni-nta(镍-次氮基三乙酸)柱上。为了防止过早的二硫化物桥联和二硫化物改组，特别是对于ss-c-cruzipain，在洗涤缓冲液中包括5mmtcep作为与金属螯合物柱相容的还原剂。洗涤步骤后，将离液缓冲液a替换为每50ml缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物)50mm磷酸钠ph8.5、100mm氯化钠、10mm咪唑、5mmtcep、1片complete®edta-free，以诱导基质结合蛋白的构象重折叠。随后，通过用每50ml缓冲液50mm磷酸钠ph8.5、100mm氯化钠、10mm咪唑、1片complete®edta-free洗涤来诱导氧化折叠(即，半胱氨酸残基的氧化桥联)。由于二价ni2+离子的高有效浓度，基质结合融合蛋白内二硫化物桥的形成是非常快速的过程。洗脱前，将咪唑浓度提高至40mm，以除去污染蛋白。然后通过应用50mm磷酸钠ph8.5、100mm氯化钠中的250mm的咪唑浓度来洗脱天然融合蛋白。通过sds-page评价含蛋白级分的纯度并合并。最后，将蛋白进行大小排阻色谱，并将含蛋白级分合并并浓缩。实施例2无分子伴侣融合的克氏锥虫抗原的克隆和纯化编码如表1中所列的克氏锥虫抗原的合成基因购自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)。基于novagen(madison,wi,usa)的pet24a表达质粒，进行以下克隆步骤。对于克氏锥虫抗原1f8、jl7、kmp-11或c-cruzipain，用分别ndei或bamh1和xhoi消化载体，并插入包含各自克氏锥虫抗原(seqidno.1-4)的盒。将所得质粒的插入物测序，并发现其编码所需蛋白。所得蛋白的氨基酸序列显示于本发明的序列方案中。所有重组克氏锥虫多肽变体含有c末端六组氨酸标签，以促进ni-nta辅助的纯化和重折叠。seqidno.概述于表1中。所有无分子伴侣融合的克氏锥虫抗原都根据以下方案纯化。使携带表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)细胞在加有卡那霉素(30µg/ml)的lb培养基中生长至od600为1，并通过添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最终浓度而诱导细胞溶质过表达，生长温度为37℃。诱导后4小时，通过离心(5000xg，20分钟)而收获细胞，冷冻并储存于-20℃。对于细胞裂解，将冷冻的沉淀物重悬浮于每50ml缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物)25mm磷酸钠ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase®、1片complete®和1片complete®edta-free中，并通过高压均质化来裂解所得悬浮液。将粗裂解物补充直至50mm磷酸钠、10mm咪唑。离心后，将上清液施加至预先平衡于缓冲液a(50mm磷酸钠ph8.5、100mm氯化钠、10mm咪唑)中的ni-nta(镍-次氮基三乙酸酯)柱上。洗脱前，将咪唑浓度提高至40mm，以除去污染蛋白。然后通过应用250mm的咪唑浓度来洗脱蛋白。最后，将蛋白进行大小排阻色谱，并将含蛋白级分合并并浓缩。-在表1中，作为前缀的ecss或ss表示与克氏锥虫多肽n-末端融合的串联slyd部分。表1：根据实施例1和2获得的克氏锥虫抗原克氏锥虫抗原包含查加斯抗原seqidno.ecss-1f8(cys)1ecss-1f8(cys残基被替换为ala)1ecss-jl72ecss-c-cruzipain3ecss-kmp114ecss-c-par251f81jl72c-cruzipain3kmp-114实施例3生物素和钌部分与克氏锥虫抗原的偶联重组蛋白的赖氨酸ε-氨基分别用n-羟基-琥珀酰亚胺活化的生物素和钌标记物以∼10mg/ml的蛋白浓度进行修饰。根据各自的蛋白，标记物/蛋白摩尔比从3:1至30:1变化。反应缓冲液为50mm磷酸钾(ph8.5)、150mmkcl、0.5mmedta。反应在室温下进行30分钟，并通过添加缓冲的l-赖氨酸至10mm的最终浓度来终止。偶联反应后，通过将粗蛋白缀合物通过凝胶过滤柱(superdex200hiload)来除去未反应的游离标记物。实施例4在免疫诊断测试中评价重组克氏锥虫抗原的免疫反应性；检测人血清中的抗克氏锥虫抗体在自动化cobas®e601分析仪(rochediagnosticsgmbh)中评价不同蛋白的免疫反应性。以双抗原夹心形式进行测量。由此，将生物素-缀合物(即捕获抗原)固定在链霉抗生物素蛋白-包被的磁珠的表面上，而检测-抗原携带络合的钌阳离子作为信号传导部分。cobas®e601中的信号检测基于电化学发光。在特异性免疫球蛋白分析物存在的情况下，显色钌络合物桥接至固相，并在铂电极处激发后发射620nm的光。信号输出为任意光单位。用购自几个来源的抗克氏锥虫阳性和阴性人血清和血浆样品进行测量。根据各制造商的说明，使用三种商购的查加斯测定(来自abbottlaboratories的architectchagas，来自biokits.a.的bioelisachagas，来自novatec的novalisachagasiggelisa)测试所有样品。architectchagas测定使用几种多表位融合多肽，其各自包含几种含有抗原pep-2、tcd、tce、tclo1.2、tcr27、fcabp(=1f8)、tcr39、fra(=jl7)、sapa和map的重组克氏锥虫多肽，得到10种不同的抗原。bioelisachagas使用重组抗原pep-2、tcd、tce和tclo1.2。novalisachagasiggelisa使用包含抗原pep-2、tcd、tce和tclo1.2的多表位融合多肽tcf。注意，在克氏锥虫抗原命名法中，相同或非常相似的抗原通常携带几个同义词，诸如例如fcabp=1f8或pep-2与b13和ag2以及tcr39同义，对于综述，参见例如silveira等人,trendsinparasitol.2001,vol.17no.6或marcipar等人,currenttopicsintrop.med16march2012,p.273-398。根据本发明的重组克氏锥虫抗原变体以双抗原夹心(dags)免疫测定形式成对评价。例如，ss-1f8-生物素缀合物与含有50mmmes(ph6.5)、150mmnacl、0.1%聚多卡醇、0.2％牛白蛋白、0.01％n-甲基异噻唑酮、0.1%oxy-pyrion的测定缓冲液中各浓度为800ng/ml的ss-1f8-钌络合物缀合物一起进行评价。在所有测量中，化学聚合和未标记的ecslyd-ecslyd(ss)在反应缓冲液中作为抗干扰物质以大量过量(20μg/ml)进行，以避免经由分子伴侣融合单元的免疫交叉反应。抗克氏锥虫阴性人血清用作对照。使用的样品体积为49µl。在表2(图1a和1b)中，显示了克氏锥虫抗原分子伴侣融合变体(参见序列表和序列概述，同上)的免疫活性。前五种样品是正常人血清，以下样品是证明的克氏锥虫抗体阳性样品。评价所述查加斯抗原的工作截止值被任意选择为五种正常人血清的六倍平均值，以充分区分查加斯阳性和阴性样本。所有判断为阳性的结果都用粗体字母书写。显然，克氏锥虫抗原变体的反应性强烈取决于个体患者血清。根据本发明的所有抗原变体都表现出显著的抗原性。表3(图2)显示用三种商购的查加斯测定(architectchagas、bioelisachagas和novalisachagasiggelisa；成分抗原参见上文)测试的样本的结果。根据大多数方法，所有样品都被确定为查加斯阳性。这意味着如果三种测定中的两种提供阳性结果且第三种测定为阴性，则将样品判断为阳性，因为大多数测定结果(2:1)为阳性。所有判断为阳性的个别结果都以粗体字母印刷。从表3可见，只有少数样本与本发明中所述的所有重组抗原反应。尽管ecss-c-cruzipain是能够与表3中研究的所有查加斯阳性样品反应的唯一抗原(图2)，但人血清中查加斯抗体的可靠检测需要包含多于一种特异性抗原的组合物。实施例5重组克氏锥虫抗原混合物的特异性为了评价上述重组查加斯抗原的特异性(即，真实阴性率)，产生具有不同抗原混合物的两种原型试剂盒。试剂盒变体1由ecss-1f8、ecss-jl7和ecss-c-cruzipain构建。试剂盒变体2另外包括ecss-kmp-11。以各100ng/ml的浓度应用克氏锥虫抗原的多肽变体的生物素和钌缀合物。在所有测量中，化学聚合和未标记的抗干扰剂ecslyd-ecslyd(ss)在反应缓冲液中大量过量(20µg/ml)进行。使用的样品体积为30µl。表4：重组克氏锥虫抗原混合物相比于商购抗查加斯测定的特异性。用两种试剂盒变体测试来自巴伐利亚红十字会的494名献血者(正常样品)，且结果概述于上文表4中。494个样品中只有一个与本发明的两个试剂盒变体反应。通过来自novatec的novalisachagasiggelisa进一步研究了该样品，未发现反应。所得99.80％的特异性与其他商业抗查加斯测定法一致。实施例6重组克氏锥虫抗原混合物的灵敏度通过测量人血清基质中查加斯抗体的两种不同who标准品(tci和tcii，tci=克氏锥虫基因型i；tcii=克氏锥虫基因型ii)的线性稀释度行来将实施例5中描述的两种试剂盒变体的灵敏度(即真阳性率)与两种商购的查加斯测定法(来自biokits.a.的bioelisachagas，来自ortho-clinicaldiagnostics的ortho克氏锥虫elisa测试系统)进行比较(表5，图3)。所有判断为阳性的结果都以粗体字母印刷。本发明的试剂盒变体1和2在稀释灵敏度实验中没有显著差异。然而，两种试剂盒变体比竞争测定法bioelisachagas、ortho克氏锥虫elisa或architectchagas更灵敏4至6个线性稀释步骤。实施例4中描述了bioelisachagas和architectchagas的成分克氏锥虫抗原。ortho克氏锥虫elisa基于克氏锥虫细胞裂解物，且不含重组抗原。通过本发明实现的增加的稀释灵敏度意味着在非常低的抗体浓度下，可以可靠地检测抗体的存在。实施例7有和无分子伴侣融合的重组克氏锥虫抗原的免疫反应性的比较在以前的实施例中显示了具有分子伴侣融合的重组克氏锥虫抗原的免疫反应性。为了显示根据本发明的克氏锥虫抗原的免疫反应性独立于融合配偶体的存在，还关于其免疫反应性评价了如实施例2中所述的无分子伴侣融合的重组克氏锥虫抗原。表6(图4)概述了测量结果。以各100ng/ml的浓度应用克氏锥虫抗原的多肽变体的生物素和钌缀合物。在所有测量中，化学聚合和未标记的抗干扰剂ecslyd-ecslyd(ss)在反应缓冲液中大量过量(20µg/ml)进行。使用的样品体积为30µl。从表6(图4)的测量数据可以得出结论，无分子伴侣融合配偶体的克氏锥虫抗原变体也表现出显著的抗原性。观察到的信号的差异可以通过作为不同数量的可及赖氨酸残基(有或无slyd融合)的结果的不同的标记率来解释。另一方面可能是不同的标记位点，这可导致表位的不同损伤。另外，无分子伴侣融合的抗原的摩尔浓度高于其含有所述融合配偶体的对应物。综上，克氏锥虫多肽用于检测克氏锥虫抗体的适用性不依赖于分子伴侣融合配偶体。纯粹的克氏锥虫特异性多肽抗原序列是检测克氏锥虫特异性抗体所必需的。实施例8钙离子对重组克氏锥虫抗原1f8的免疫反应性的影响为了研究钙离子对重组克氏锥虫抗原1f8(也称为tc24、tc28或fcabp(鞭毛钙结合蛋白)，克氏锥虫的已知钙结合蛋白)的免疫反应性的影响，如实施例4中所述的测定缓冲液用1mm的浓度的氯化钙补充。以各200ng/ml的浓度应用ecss-1f8的生物素和钌缀合物。在所有测量中，化学聚合和未标记的抗干扰剂ecslyd-ecslyd(ss)在反应缓冲液中大量过量(20µg/ml)进行。使用的样品体积为30µl。表7(图5)中查加斯感染患者的大多数血清显示，由于向测定缓冲液中添加钙离子，克氏锥虫1f8抗原的免疫反应性明显增加。对于一些查加斯阳性血清，信号可翻倍。观察到的信号差异可以通过个体患者的免疫应答的异质模式来解释，也如表2(图1a和1b)中所示。当应用由三种多肽1f8、jl7和cruzipain组成的根据本发明的多肽组合物时，也可以观察到由于添加钙离子而导致的克氏锥虫1f8抗原的免疫反应性的增加(数据未显示)。序列表<110>rochediagnosticsgmbh<120>用于检测查加斯病的抗原组合物<130>p32403wo-ir<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>211<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自具有变化的uniprotq4d1q2克氏锥虫1f8x=cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(66)..(66)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(74)..(74)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(124)..(124)<223>xaa可以是cys,ala或ser<400>1metglyalaxaaglyserlysglyserthrserasplysglyleuala151015serasplysaspglylysasnalalysasparglysglualatrpglu202530argileargglnalaileproargglulysthralaglualalysgln354045argargilegluleuphelyslyspheasplysasngluthrglylys505560leuxaatyraspgluvalhisserglyxaaleugluvalleulysleu65707580aspgluphethrproargvalargaspilethrlysargalapheasp859095lysalaargalaleuglyserlysleugluasnlysglysergluasp100105110phevalglupheleuglupheargleumetleuxaatyriletyrasp115120125phephegluleuthrvalmetpheaspgluileaspalaserglyasn130135140metleuvalaspgluglugluleulysargalavalprolysleuglu145150155160alatrpglyalalysvalgluaspproalaalaleuphelysgluleu165170175asplysasnglythrglyservalthrpheaspgluphealaalatrp180185190alaseralavallysleuaspalaaspglyaspproaspasnvalpro195200205gluserala210<210>2<211>226<212>prt<213>克氏锥虫<400>2metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alaarggluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalalametgluglngluargargglnleuleuglulysasp65707580proargargasnalalysgluilealaalaleugluglusermetasn859095alaargalaglngluleualaargglulyslysleualaaspargala100105110pheleuaspglnlysprogluglyvalproleuarggluleuproleu115120125aspaspaspseraspphevalsermetgluglngluargargglnleu130135140leuglulysaspproargargasnvalglnlysilealaaspleuglu145150155160glusermetasnalaargalaglngluleualaargglulyslysleu165170175alaaspargalapheleuaspglnlysprogluglyvalserleuarg180185190gluleuproleuaspaspaspseraspphevalsermetgluglnglu195200205argargglnleuleuglulysaspproarglysasnvalglnileval210215220alaasp225<210>3<211>130<212>prt<213>克氏锥虫<400>3glyproglyprothrprogluprothrthrthrthrthrthrserala151015proglyproserprosertyrphevalglnmetsercysthraspala202530alacysilevalglycysgluasnvalthrleuprothrglyglncys354045leuleuthrthrserglyvalseralailevalthrcysglyalaglu505560thrleuthrglugluvalpheleuthrserthrhiscysserglypro65707580servalargserservalproleuasnlyscysasnargleuleuarg859095glyservalgluphephecysglyserserserserg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