本发明涉及一种用于测定神经毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点；(b)将(a)的神经毒素敏感细胞与神经毒素一起温育并在允许所述神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述细胞；(c)将(b)的神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下透化；和(d)量化从所述细胞释放的所述报告蛋白的活性，从而确定所述神经毒素的生物活性。此外，本发明涉及一种融合蛋白，其包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白，和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点，用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性。本发明还涵盖一种包含本发明的融合蛋白的试剂盒。最后，本发明涉及本发明的融合蛋白用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性的用途。
肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)和破伤风梭菌(clostridiumtetani)分别产生高效的神经毒素，即肉毒杆菌毒素(bont)和破伤风毒素(tent)。这些梭菌神经毒素(cnt)特异性结合神经元细胞并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kda单链蛋白。翻译后加工涉及二硫键的形成，和由细菌蛋白酶进行的有限的蛋白水解(切口)。活性神经毒素由两条链组成，约50kda的n端轻链和约100kda的重链，其通过二硫键连接。cnt在结构上和功能上由三个结构域组成，即催化轻链、涵盖转位结构域的重链(n端半部)和受体结合域(c端半部)；参见例如krieglstein1990,《欧洲生物化学杂志(eur.j.biochem.)》,188,39；krieglstein1991,《欧洲生物化学杂志(eur.j.biochem.)》,202,41；krieglstein1994,《蛋白质化学杂志(j.proteinchem.)》,13,49。肉毒杆菌神经毒素被合成为包含150kda神经毒素蛋白和相关无毒蛋白的分子复合物。所述复合物大小根据梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围有300kda，超过500kda和900kda。这些复合物中的无毒蛋白稳定神经毒素并保护其免于降解；参见silberstein2004,《疼痛实践(painpractice)》,4,s19-s26。
肉毒梭菌分泌七种抗原性不同的血清型，称为肉毒杆菌神经毒素(bont)的a至g。所有血清型以及破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(tent)都是通过切割snare蛋白来阻断突触胞吐作用的zn2+内切蛋白酶；参见couesnon,2006,《微生物学(microbiology)》,152,759。cnt引起肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹；参见fischer2007,pnas104,10447。
尽管其毒性作用，肉毒杆菌毒素复合物已被用作大量疾病中的治疗剂。肉毒杆菌毒素血清型a于1989年在美国被批准供人类使用以治疗斜视、眼睑痉挛和其它病症。其可作为肉毒杆菌毒素a(bont/a)蛋白质制剂，例如以商品名botox(allergan,inc.)或以商品名dysport/reloxin(ipsen,ltd)商购获得。改进的无复合物的肉毒杆菌毒素a制剂可以商品名xeomin(merzpharmaceuticals,gmbh)商购获得。对于治疗应用，将制剂直接注射到待治疗的肌肉中。在生理ph下，毒素从蛋白质复合物中释放出来，并且发生所期望的药理作用。肉毒杆菌毒素的作用只是暂时的，这就是可能需要重复施用肉毒杆菌毒素来维持治疗效果的原因。
梭菌神经毒素削弱自发肌肉力量并且是斜视、局限性肌张力障碍(包括子宫颈肌张力障碍)和良性原发性眼睑痉挛的有效疗法。它们已进一步证实可缓解半面痉挛和局灶性痉挛，并且此外在广泛多种其它适应症如胃肠道病症、多汗症和美容除皱中是有效的；参见jost2007,《药物(drugs)》,67,669。
在梭菌神经毒素的制造过程中，所述神经毒素的定性和定量测定以及生物活性神经毒素多肽的质量控制是特别重要的。此外，政府机构只接受简单、可靠和经过验证的肉毒杆菌毒素活性测定法。目前，小鼠ld50生物测定法(致死率测试)仍然是制药厂商用来分析其制剂效力的“黄金标准”；参见arnon等,(2001),jama285,1059-1070。然而，近年来，已经作出了相当大的努力来寻求替代方法以减轻对动物试验的需求以及与基于动物的测定法相关的所有缺点、成本和伦理问题。此外，监管机构正在引导制药公司将三个“r”原则应用于肉毒杆菌神经毒素的效力测试：“减少(reduce)、优化(refine)、更换(replace)”；参见straughan,《实验动物替代杂志(altern.lab.anim.)》,(2006),34,305-313。因此，开发了基于细胞的测试系统，以便为使用活体动物的方法提供合理的替代方案。然而，迄今为止，只有三种细胞测试系统可用于测定神经毒素生物活性，其已被证实对神经毒素多肽具有足够的敏感性。这些基于细胞的测试系统包括使用从体外分化的啮齿动物胚胎分离的原代神经元(pellett等,(2011),《生物化学与生物物理研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)》,404,388-392)、神经元分化诱导的多能干细胞(whitemarsh等,(2012),《毒理学(toxicol.sci.)》,126,426-35)和sima细胞系的亚克隆(wo2010/105234a1)。
然而，原代神经元的分离需要杀死动物，并且费时费力。此外，使用不同原代神经元的测试系统显示出很大的偏差。类似地，神经元分化诱导的多能干细胞的产生是困难和耗时的。此外，这种细胞的储存很成问题。使用肿瘤细胞系的测定法通常对bont不够敏感。此外，所述肿瘤细胞系需要复杂的分化方案，其导致使用所述细胞系的测定法的偏差大和/或失败率高。
鉴于上述情况，政府机构可接受的测定神经毒素多肽活性的其它测试系统是非常希望的。此外，需要基于动物的测试系统的替代物。
因此，本发明背后的技术问题可能被视为提供符合上述需要的手段和方法。所述技术问题由权利要求和下文中表征的实施方案解决。
在第一方面，本发明涉及一种用于测定神经毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点；
(b)将(a)的神经毒素敏感细胞与神经毒素一起温育并在允许所述神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述神经毒素敏感细胞；
(c)将(b)的神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下透化；和
(d)量化从(c)的透化的神经毒素敏感细胞释放的所述报告蛋白的活性，从而确定所述神经毒素的生物活性。
在用于测定本领域描述的神经毒素多肽的生物活性的基于细胞的测试系统中，细胞被分化为神经元细胞，以获得对神经毒素多肽的足够的敏感性。随后，将这些细胞与神经毒素多肽一起温育。此后，通常通过使用特异性抗体来确定切割的神经毒素底物的量。为了精确测定神经毒素多肽的生物活性，需要来自三种不同宿主物种的高质量的三种神经毒素底物特异性抗体。这包括捕获抗体，以将神经毒素多肽的底物如bont/a底物snap-25与其它细胞蛋白分离。所述捕获抗体通常针对神经毒素底物的n端区域，例如snap-25的n端区域。此外，新表位特异性抗体对于检测神经毒素切割的底物(例如bont/a切割的snap-25)是必需的。需要额外的检测抗体，其通常针对神经毒素底物的c端区域，例如snap-25的c端区域，以确定神经毒素底物的总量，或未切割的神经毒素底物的量，从而允许标准化。
本发明的用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法是基于被基因修饰以表达本发明的新型融合蛋白的神经毒素敏感细胞。所述神经毒素敏感细胞可以是来自或源自肿瘤细胞系、原代细胞、干细胞、诱导多能干细胞或本文别处定义的其它细胞的细胞。“源自”是指源于所指示的细胞的神经毒素敏感细胞，包括例如其克隆或亚克隆。与亲本细胞相比，这样的克隆或亚克隆可以是未修饰的或基因修饰的。在某些方面，神经毒素敏感细胞能够分化为神经元细胞。在这些情况下，在允许神经毒素敏感细胞分化为神经元分化细胞的条件和时间段内，神经毒素敏感细胞在培养基中分化。如本文别处更具体地定义，本发明的融合蛋白包含锚定蛋白、神经毒素多肽切割位点和报告蛋白。例如，所述融合蛋白涵盖跨膜蛋白或膜相关蛋白作为锚定蛋白、报告蛋白和神经毒素切割位点。神经毒素多肽的切割位点位于锚定蛋白与报告蛋白之间。在本发明方法的第一步中，将编码所述融合蛋白的多核苷酸序列引入神经毒素敏感细胞中，然后在允许表达(生物活性)融合蛋白的条件下培养。在本发明的方法的某些方面，本发明的融合蛋白的表达由本领域已知的诱导型表达系统诱导，例如四环素诱导型表达系统(zhou,x.,vink,m.,klave,b.,berkhout,b.和das,a.t.(2006)optimizationofthetet-onsystemforregulatedgeneexpressionthroughviralevolution.《基因治疗(genether.)》,13(19):1382-1390)、米非司酮诱导型表达系统(wang,y.,b.w.o'malley,j.,tsai,s.y.和o'malley,b.w.(1994).aregulatorysystemforuseingenetransfer.《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,91,8180-8184)、蜕皮激素诱导型表达系统(nod,yaotp,evansrm.ecdysone-induciblegeneexpressioninmammaliancellsandtransgenicmice.《美国科学院院刊(procnatlacadsciusa.)》,1996年4月16日；93(8):3346-51；meyer-ficcaml,meyerrg,kaiserh,brackar,kandolfr,küpperjh.comparativeanalysisofinducibleexpressionsystemsintransienttransfectionstudies.《分析生物化学(analbiochem.)》,2004年11月1日；334(1):9-19)等，其可商购获得(clontech；lifetechnologies；agilent)。随后，将神经毒素敏感细胞与在允许神经毒素发挥其生物活性的条件下培养一段时间(例如约24至72小时)的神经毒素多肽一起温育。在通过神经毒素多肽的蛋白水解活性在融合蛋白的神经毒素多肽切割位点处切割后，报告蛋白被释放到细胞中。中毒步骤可以任选地随后进行洗涤步骤。然后例如通过溶血素将神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放报告蛋白但不释放锚定蛋白的条件下透化一段时间。随后，回收包含报告蛋白的上清液，并且在适当时进一步处理(例如过滤或离心)，然后测定报告蛋白的活性。通过量化从细胞释放的报告蛋白的活性，可以确定神经毒素多肽的生物活性。
本发明的神经毒素多肽的生物活性的测试方法与本领域已知的方法相比，显示出提高的灵敏度。此外，由于操作简单，本发明的方法显示较高的精确性和稳定性。本发明方法的这些技术和定性益处在以下实施例中示出。
梭菌神经毒素的特征在于它们特异性抑制神经递质从突触前神经末梢分泌。外周神经元的选择性由两种不同受体sv2和gt1b的识别介导。神经毒素的生理作用是基于在受体结合和神经毒素轻链转位后所谓的snare复合物的蛋白质切割。bont的生物活性的测定是表征所述神经毒素蛋白的重要方面，并且特别是被由监管机构需要用于清除含bont产品。因此，用于测量bont的生物活性的可靠测试是含bont产品的研究、开发和销售的基础。此外，出于伦理原因，基于细胞的测试系统将取代迄今为止占主导的动物试验。为了建立这样的基于细胞的测试系统，神经元细胞或细胞系对肉毒杆菌神经毒素的足够高的敏感性是至关重要的。然而，为了获得这样高的敏感性，迄今为止需要费力的神经元细胞系的分化方法。因此，如上所述，仅有几种基于细胞的测试系统可用。为了确定肉毒杆菌毒素在医药产品中的生物活性，神经元细胞或细胞系应具有以下特性：首先，细胞应该是人类、神经元来源，以尽可能与目标类似，即人类患者。第二，细胞系统对于最终产品中的赋形剂应是稳定的，并且优选地对于在生产过程的中间阶段(过程控制)中的杂质也是稳定的。第三，基于细胞的测试系统应显示动态测量范围，其允许精确测定小瓶中bont的生物活性(例如50u、100u或200ubont/a)。考虑到诸如赋形剂的溶解性、细胞培养基的体积等技术因素，必须精确地测定小于1pm的bont浓度。根据本发明人的最佳知识，迄今为止只有三种基于细胞的测试系统是可用的，其对bont显示出足够高的灵敏度。如本文别处已经提到，这些包括来自啮齿动物的胚胎的原代神经元、神经元分化诱导的多能干细胞和sima细胞系的亚克隆。然而，据报道，所述细胞或细胞系只有经过复杂和费力的分化方案，才表现出足够高的敏感性，所述分化方案通常产生大的偏差。相比之下，本发明提供一种简单、可靠和稳定的用于测量肉毒杆菌神经毒素(bont)的生物活性的基于细胞的测试系统，其满足上述要求，并且相比于本领域中描述的细胞测试系统在灵敏度方面进一步改善。
如本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”涵盖基本上不含其它宿主细胞多肽的分离或纯化的多肽。上述术语包括融合蛋白。融合蛋白或嵌合蛋白(字面上由不同来源的部分构成)是通过连接两个或多个最初编码单独蛋白质的基因而产生的蛋白质。该融合基因的翻译产生具有衍生自每种原始蛋白质的功能性质的单一蛋白质。重组融合蛋白是通过本领域已知的重组dna技术人工产生的；参见例如sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory,第三版,2001。嵌合蛋白或嵌合体通常表示由具有不同的功能或物理化学模式的多肽构成的杂合蛋白。此外，术语“融合蛋白”在一个方面包括化学改性的融合蛋白。这样的修饰可以是人工修饰，例如突变，例如点突变、取代、缺失、插入等，或天然存在的修饰，例如翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化等。融合蛋白应具有本文提及的生物学特性。更具体地，如本文所用的术语“融合蛋白”或“融合多肽”包括锚定蛋白、报告蛋白和神经毒素切割位点。如本文所用的“锚定蛋白”是多肽，其稳定地附着于或整合到质膜中并与神经毒素敏感细胞的细胞溶质接触。因此，锚定蛋白可以是(跨)膜或整合膜蛋白或膜相关蛋白。融合蛋白的锚定蛋白位于质膜中(对于(跨)膜或整合膜蛋白)或质膜处(在膜相关蛋白的情况下)，都处于未切割和神经毒素切割状态。对于本领域技术人员显而易见的是，暂时附着于或仅与质膜部分相缔合的蛋白质不适合作为锚定蛋白。质膜包括细胞膜和囊泡膜。跨膜蛋白是例如胆碱转运蛋白(np_068587)、组胺h1受体(h1受体，np_001091683)或任何其它g蛋白偶联受体(gpcr；例如aai28124、np_000675、p08172)或sv2(np_055664)。膜相关蛋白可以是例如snap-25(p60880)、marcks蛋白(np_002347)或含c2结构域的蛋白质(例如np_002728；np_002730)。也涵盖具有所述生物学特性的这种锚定蛋白的片段。如本文所用的“神经毒素切割位点”是bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g或tent切割位点，优选地bont/a、bont/c1或bont/e切割位点。神经毒素切割位点被神经毒素多肽识别和切割。神经毒素切割位点的相应序列在本领域中是已知的，并且描述于例如binz等,(2010),《毒素(toxins)》,2(4),第665-682页；wo2010/124998或wo2010/105234a1，所述文献的公开内容通过引用并入本文。神经毒素切割位点位于锚定蛋白与报告蛋白之间，并且可从神经毒素敏感细胞的细胞溶质到达神经毒素多肽。通过神经毒素多肽的蛋白水解活性在融合蛋白的神经毒素多肽切割位点处切割后，报告蛋白被释放到神经毒素敏感细胞的细胞溶质中，而锚定蛋白留在质膜中或质膜处。如本文所用的“报告蛋白”或“检测蛋白”(两个术语是可互换的)是可检测的标志物，例如酶，如荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可选地，报告蛋白可以是荧光蛋白，例如gfp、bfp、yfp、rfp等。融合蛋白的报告蛋白位于未切割状态的质膜处，并在通过神经毒素多肽切割后释放到细胞溶质中。也涵盖具有所述生物学特性的这种报告蛋白的片段。融合蛋白的布置可以是锚定蛋白-神经毒素切割位点-报告蛋白或报告蛋白-神经毒素切割位点-锚定蛋白。融合蛋白还可以包含一个或多个连接子区域，例如聚甘氨酸连接子等。可以在融合蛋白中使用连接子，例如连接锚定蛋白和神经毒素切割位点，或者神经毒素切割位点和报告蛋白。还设想在融合蛋白中使用两个或更多个连接子，例如锚定蛋白与神经毒素切割位点之间的一个连接子，以及神经毒素切割位点与报告蛋白之间的另一个连接子。连接子可以相同或不同。也涵盖锚定蛋白与报告蛋白之间的连接子，其可以包含一个或多个(例如两个、三个或更多个)神经毒素切割位点。如本文所用的术语“连接子”或“连接子区域”表示作为氨基酸序列的短区段的多连接子。由相应的dna序列编码的合适的连接子序列描述于例如schiavog,matteolim,montecuccoc:neurotoxinsaffectingneuroexocytosis.《生理学评论(physiol.rev.)》,2000,80:717-66。除了将功能蛋白质连接在一起的基本作用(如在柔性或刚性连接子中)，连接子可以为生产融合蛋白提供许多其它优点，例如改善生物活性，增加表达产率，并达到所期望的药代动力学概况；参见例如chen等,《先进药物输送评论(adv.drugdeliv.rev.)》,2013,65(10),第1357-69页。此外，融合蛋白可以包括合适的标签，例如flag标签、myc标签、his标签、ha标签或gst标签，其允许例如有效分离和/或纯化被标记的融合蛋白或其组成部分如报告蛋白。如果适当的话，标签可以通过连接子连接到融合蛋白。本发明的范围也设想，融合蛋白包含标准化或归一化因子。如果适当的话，也可以通过连接子将标准化或归一化因子附接到融合蛋白。例如，gfp在本发明的胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶融合蛋白中用作标准化因子或归一化因子。引入用于归一化或校正每个测量结果或测量值的这种另外的组分可以用于减少单个测量结果的统计方差。在测定过程中，将随机或系统地发生不同的表达率、细胞数量、物质损失等，使得测量值具有统计误差。通过引入校正因子，可以更容易地将各个测量结果彼此进行比较。例如，如果在细胞培养期间发生不同的表达率，或者如果在洗涤步骤期间细胞材料的损失不同，则这可以通过校正因子的测量来预测。在一个方面，融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的化学合成或重组分子生物学技术来制造；参见例如sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory,第三版,2001。在一个方面，这种制造融合蛋白的方法包括(a)培养在本文别处更详细描述的宿主细胞，和(b)从所述宿主细胞获得融合蛋白。在所述方法的一个方面，融合蛋白可以通过常规纯化技术例如从宿主细胞裂解物获得，包括亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和/或制备型凝胶电泳。在另一个方面，术语“多肽”或“蛋白质”包括另外包含融合蛋白和其它蛋白质的多肽制剂。
如本文所用的术语“神经毒素敏感细胞”是指对显示神经毒素多肽的生物学特性(即本文别处提及的(a)受体结合，(b)内化，(c)转位穿过内体膜到细胞溶质中和/或(d)参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割)的神经毒素多肽敏感的细胞。因此，如本文所提及的“神经毒素敏感细胞”对神经毒素中毒敏感。对神经毒素中毒敏感的细胞优选对如本文所定义的生物活性或成熟的神经毒素多肽敏感。根据定义，“对神经毒素中毒敏感的细胞”必须表达或被设计为表达至少一种神经毒素受体和至少一种神经毒素底物。神经毒素的受体和底物在本领域中描述。如本文所用的术语“神经毒素敏感细胞”包括细胞或细胞系，例如分离的原代细胞或其细胞系或者已确定的细胞系的细胞或已确定的细胞系，例如如本文所定义的神经母细胞瘤细胞或神经母细胞瘤细胞系。如本文所示的神经毒素敏感细胞包括在适当的细胞培养条件下能够分化为神经元细胞的细胞，例如肿瘤细胞。这样的细胞涵盖例如来自肿瘤细胞系的细胞，例如neuro-2a细胞、pc12细胞、ng108-15细胞、p19细胞、sima细胞或sh-sy5y细胞，原代细胞，干细胞，诱导多能干细胞，由其衍生的细胞或本文别处定义并用于以下实施例中的其它细胞。如本文所示的术语“对于神经毒素中毒敏感”是指可以经历整个细胞机制由此使神经毒素多肽(例如，bont/a)切割神经毒素底物(例如，bont/a底物snap-25)的细胞，并涵盖神经毒素与其相应受体的结合(例如，bont/a与bont/a受体的结合)、神经毒素/受体复合物的内化、神经毒素轻链从细胞内囊泡转位进入细胞质中和/或神经毒素底物的蛋白水解切割，优选所有提及的机制。如本领域技术人员所理解的，神经毒素敏感细胞优选能够首先摄取神经毒素，然后经历上文列出的整个细胞机制。如本文所用的神经毒素敏感细胞可以摄取例如约100纳摩尔浓度(nm)、约10nm、约1nm、约500皮摩尔(pm)、约400pm、约300pm、约200pm、约100pm、约90pm、约80pm、约70pm、约60pm、约50pm、约40pm、约30pm、约20pm、约10pm、约9pm、约8pm、约7pm、约6pm、约5pm、约4pm、约3pm、约2pm、约1pm、约0.5pm或约0.1pm的神经毒素多肽或甚至小于指定值之一。文献中已报道了高于100pm的ec50值。优选地，如本文所用的“神经毒素敏感细胞”对于神经毒素中毒敏感，例如，约1nm以下、500pm以下、约400pm以下、约300pm以下、约200pm以下、约100pm以下、约90pm以下、约80pm以下、约70pm以下、约60pm以下、约50pm以下、约40pm以下、约30pm以下、约20pm以下、约10pm以下、约9pm以下、约8pm以下、约7pm以下、约6pm以下、约5pm以下、约4pm以下、约3pm以下、约2pm以下、约1pm以下、约0.9pm以下、约0.8pm以下、约0.7pm以下、约0.6pm以下、约0.5pm以下、约0.4pm以下、约0.3pm以下、约0.2pm以下或甚至约0.1pm以下。用于确定神经毒素多肽的生物活性的测定法是本领域众所周知的，并且在本文别处也有描述(参见例如pellett等,withemarsh等,《毒理学(toxicologicalsciences)》,126(2),426-435(2012)；wo2010/105234a1)。
如本领域已知，“半最大有效浓度(ec50)”是指在一些指定的暴露时间之后，在基线与最大值之间诱导半程反应的药物、抗体或毒物的浓度。它通常用作药物效力的量度。因此，量反应的量效曲线的ec50表示观察到其最大效果的50％的化合物浓度。质反应的量效曲线的ec50表示在特定暴露持续时间后50％的群体表现出反应的化合物浓度。
用于识别和/或分离对神经毒素中毒敏感和/或具有神经毒素摄取能力的细胞或细胞系(即如本文所定义的神经毒素敏感细胞)的方法是本领域已知的；参见例如us2012/0122128a1。在一个方面，神经毒素多肽的生物活性来自所有上述生物学特性。用于测定本领域已知的神经毒素的生物活性的基于细胞的系统已经在本文别处指出。用于评估神经毒素的生物活性的体内测定法包括例如已经提及的小鼠ld50测定法以及如pearce等和dressier等描述的离体小鼠偏侧膈测定法；参见pearce1994,《毒理学与应用药理学(toxicol.appl.pharmacol.)》,128:69-77和dressier2005,《运动障碍(mov.disord.)》,20:1617-1619。如本领域技术人员所知，神经毒素的生物活性通常以小鼠单位(mu)表示。一个mu是神经毒性成分在腹膜内注射后杀死指定小鼠群体的50％(即小鼠i.p.ld50)的量。本发明的方法与本领域所描述的需要复杂分化方案的细胞测试系统相比，提供了对神经毒素多肽具有增加的灵敏度的简单、可靠和稳定的基于细胞的测试系统。因此，本发明的方法提供了用于测定神经毒素的生物活性的本领域的细胞测试系统的改进的替代方案。此外，本发明的方法可以用作基于动物的测定法的替代方案。
如本文所用的术语“分化”或“分化的”表示非特化或相对较少特化的细胞变得相对更加特化的过程。在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的”是一个相对术语。因此，“分化细胞”是相比于进行比较的细胞沿某一发育途径进一步向下发展的细胞。分化细胞可以例如是终末分化细胞，即在生物体的各种组织和器官中起独特功能的完全特化细胞，并且其可以但不必须是有丝分裂后的细胞。在另一个实例中，分化细胞也可以是分化谱系中的祖细胞，其可以进一步增殖和/或分化。类似地，如果细胞相比于进行比较的细胞沿某一发育途径进一步向下发展，则所述细胞“相对更加特化”，其中后者因此被认为是“非特化的”或“相对较少特化的”。相对更特化的细胞可能与一种或多种可证实的表型特征的非特化或相对较少特化的细胞不同，例如特定细胞组分或产物(例如rna、蛋白质、特定细胞标志物或其它物质)的存在、不存在或表达水平，某些生物化学途径的活性，形态外观，增殖能力和/或动力学，分化潜能和/或对分化信号的响应等，其中这些特征意味着相对更加特化的细胞沿着所述发育途径进一步发展。
如本文所用的术语“神经元分化细胞”是指已达到最终神经元分化状态的细胞。例如，鼠类胚胎癌p19细胞首先分化为神经祖细胞，然后它们进一步分化为神经元。神经分化过程之后可以接着例如表型(通过相差显微镜)和/或神经元分化标志物的表达；参见例如babuska等,(2010),《布拉格医疗报告(praguemedicalreport)》,111,289-299；或migliore和shepherd,《自然评论：神经科学(naturereviewsneuroscience)》,6,810-818(2005)。可用于测定所述神经元分化标志物的表达的测定法包括例如本领域已知的pcr、rt-pcr、northern印迹法、western印迹法或斑点印迹法、免疫沉淀分析、酶联免疫吸附分析(elisa)或facs分析；参见例如sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory,第三版,2001。用于测试神经元分化细胞的其它特征的测定法也是本领域已知的。
如本文所用的术语“能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞”是指例如神经母细胞瘤细胞、胚胎癌细胞、畸胎癌细胞、神经杂交细胞(例如神经元x胶质母细胞瘤细胞)或纤维母细胞瘤细胞。能够分化为神经元细胞的这种肿瘤细胞的实例包括小鼠和人类肿瘤细胞，即p19(鼠类胚胎癌)细胞、sima(人类神经母细胞瘤)细胞或sh-sy5y(人类神经母细胞瘤)。
如本文所用的术语“神经母细胞瘤”是指从身体的几个区域发现的神经细胞发展的癌症。神经母细胞瘤最常出现于肾上腺中及其周围，肾上腺具有与神经细胞相似的起源并位于肾脏顶部。然而，神经母细胞瘤也可以在其中存在神经细胞群的腹部其它区域和胸部、颈部和骨盆中发展。如本文所用的术语“神经母细胞瘤细胞”包括一种或多种神经母细胞瘤细胞，其是神经毒素敏感的并且能够分化为神经元细胞。神经母细胞瘤细胞可以是原代神经母细胞瘤细胞或原代神经母细胞瘤细胞系。所述术语还涵盖已确定的神经母细胞瘤细胞或细胞系。神经母细胞瘤细胞可以是哺乳动物神经母细胞瘤细胞，例如，啮齿动物神经母细胞瘤细胞，如大鼠或小鼠神经母细胞瘤细胞，还可以是猴神经母细胞瘤细胞，如恒河猴、猕猴或食蟹猴神经母细胞瘤细胞，或原代神经母细胞瘤细胞如黑猩猩神经母细胞瘤细胞或优选地人类神经母细胞瘤细胞。已确定的神经母细胞瘤细胞系的实例包括例如neuro-2a(小鼠神经母细胞瘤)、kelly(人类神经母细胞瘤)、sh-sy5y(人类神经母细胞瘤)或sima(人类神经母细胞瘤)。人类神经母细胞瘤细胞优选用于本发明的方法中，以产生神经毒素敏感的神经元分化细胞。更优选地，如本文所定义的神经母细胞瘤细胞是sima细胞或sima细胞系。这是因为sima细胞以bont敏感的形式容易转移。此外，它们对bont具有高敏感度。此外，与其它神经母细胞瘤细胞或细胞系相比，sima细胞的分化方案简单且相当短。如本发明方法中使用的sima细胞可以是亲本sima细胞或由其衍生的(亚)克隆。
如根据本发明的方法使用的术语“接触”是指将上述神经毒素敏感细胞和神经毒素物理上接近以允许物理和/或化学和/或生物相互作用。神经毒素多肽可以是天然的、重组的、分离的、修饰的、基本上纯化的或纯化的神经毒素多肽或其变体。可选地，神经毒素可以由样品，优选生物样品如细胞、细胞裂解物、血液、血浆、血清或淋巴液包含。允许特定相互作用的合适条件是本领域技术人员熟知的。所述条件将取决于本发明方法中应用的细胞和神经毒素，并且可以由本领域技术人员无需再费周折地进行调整。此外，足以允许相互作用的时间也可以由技术人员通过常规实验来确定。例如，可以将特定量的如本文定义的分离或重组神经毒素多肽或其变体或者包含神经毒素多肽的样品加入到神经毒素敏感细胞中。此后，在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将细胞与神经毒素多肽一起温育至少24小时，优选48小时，更优选72小时。如本文所用的“允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件”是本领域已知的。
如本发明中使用的术语“神经毒素”、“神经毒素多肽”或“神经毒素蛋白”是指肉毒杆菌神经毒素的七种不同血清型，即bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g，并且是指如本文所定义的破伤风神经毒素(tent)及其变体。相应的核酸和氨基酸序列是本领域已知的；参见例如uniprot或trembl序列数据库或wo2010/124998，其公开内容通过引用并入本文。优选地，本发明的方法中使用bont/a、bont/c1或bont/e。所述神经毒素的相应的受体和底物在本领域中已有充分描述。神经毒素多肽可以是天然存在的神经毒素或非天然存在的神经毒素。天然存在的神经毒素多肽通过天然存在的过程产生，包括例如由翻译后修饰产生的同种型、交替剪接的转录物或自发突变和亚型。例如，bont/a亚型是bont/a1亚型、bont/a2亚型、bont/a3亚型、bont/a4亚型或bont/a5亚型。天然存在的神经毒素多肽包括其中添加、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个或更多个氨基酸残基的上述序列。引言部分中已经提及了包含天然存在的bont/a的市售药物组合物。非天然存在的神经毒素多肽是指其结构已借助于人类操作被修饰的任何神经毒素多肽，包括例如具有通过遗传工程使用随机诱变或合理设计产生的改变的氨基酸序列的神经毒素多肽，和由化学合成产生的神经毒素多肽。本领域已经描述了这种非天然存在的神经毒素多肽。
在本发明的另一个方面，神经毒素多肽具有与如本文定义的bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g或破伤风神经毒素的氨基酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。还设想编码所述神经毒素多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有与如本文定义的bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g或破伤风神经毒素的多核苷酸序列具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。如本发明中所用的同一性是指多核苷酸或氨基酸序列的序列同一性，其中对序列进行比对以获得最高级别匹配。这可以通过使用计算机程序中编码的公开技术或方法来实现，例如blastp、blastn、fasta，altschul1990,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,215,403。在一个方面，在整个氨基酸序列上计算同一性百分比值。技术人员可以使用基于各种算法的一系列程序来比较不同的序列。在这种情况下，needleman和wunsch或smith和waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了执行序列比对，使用程序pileup(1987,《分子演化期刊(j.mol.evolution)》,25,351；higgins1989cabios5,151)或程序gap和bestfit(needleman和wunsch,1970,《分子生物学杂志(jmolbiol)》,48；443；smith和waterman,1981,《高等应用数学(adv.appl.math.)》,2,482)，它们是gcg软件包(geneticscomputergroup1991,575sciencedrive,madison,wisconsin,usa53711)的一部分。在本发明的一个方面，在整个序列区域中使用具有以下设置的程序gap来确定上述以百分比(％)表示的序列同一性值：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均不匹配：0.000，除非另有规定，否则应始终用作序列比对的标准设置。应当理解，在本发明的一个方面，上述变体应保留神经毒素的至少一种生物学特性，并且在一个方面保留本文所述的神经毒素多肽的全部生物学特性。在另一个方面，变体可以是具有改善的或改变的生物学特性的神经毒素，例如，它们可以识别和切割底物中的切割位点，所述切割位点被改进用于酶识别和/或切割，或者可以被改进用于受体结合或上述任何其它特性。
本文所提及的神经毒素原则上包含n端轻链和c端重链。神经毒素被制成单链前体分子，称为“未加工的神经毒素多肽”。由于后续加工，获得“加工的神经毒素多肽”。所述加工的神经毒素多肽显示出神经毒素的生物学特性，即(a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜转位到细胞溶质中，和/或(d)涉及突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割。因此，加工的神经毒素多肽被称为生物活性或成熟的神经毒素多肽。在一个方面，神经毒素多肽的生物活性来自如本文别处所述的所有上述生物学特性。
如本文所用的术语“透化”是指使得神经毒素敏感细胞的血浆或细胞膜可透化的方法。细胞透化的一种方法涉及通过与例如溶血素一起温育而使神经毒素敏感细胞的血浆或细胞膜透化，例如，链球菌溶血素o(barry,e.等,《生物技术(biotechniques)》,15,1016(1993)；graves,j.d.等,《生物化学杂志(biochem.j.)》,265,407-413(1990)；sekiyak,satohr,danbarah,futaesakuy.aring-shapedstructurewithacrownformedbystreptolysinoontheerythrocytemembrane.《细菌学杂志(jbacteriol.)》,1993年9月；175(18):5953-61)、产气荚膜梭菌溶血素o(preporetoporetransitionofacholesterol-dependentcytolysinvisualizedbyelectronmicroscopy.dang,t.x.,hotze,e.m.,rouiller,i.,tweten,r.k.,wilson-kubalek,e.m.《结构生物学杂志(j.struct.biol.)》,(2005))、肺炎球菌溶血素(tilleysj,orlovaev,gilbertrj,andrewpw,saibilhr(2005年4月)."structuralbasisofporeformationbythebacterialtoxinpneumolysin".《细胞(cell)》,121(2):247–56)、李斯特菌溶血素o(vázquez-bolandja,kuhnm,berchep,chakrabortyt,domínguez-bernalg,goebelw,gonzález-zornb,wehlandj,kreftj.listeriapathogenesisandmolecularvirulencedeterminants.《临床微生物学评论(clinmicrobiolrev.)》,2001年7月；14(3):584-640)、细菌溶血素或来自蛇或蜘蛛的成孔毒素。许多溶血素是成孔毒素，即它们能够在细胞的细胞质膜上产生孔，从而使细胞透化。使用溶血素透化细胞的方法和方案是本领域已知的，并且描述在例如上述出版物中。神经毒素敏感细胞在允许从透化细胞释放报告蛋白但不释放锚定蛋白的条件下透化。如本领域技术人员所理解的，血浆或细胞膜通过使用溶血素透化而保持完整。膜相关蛋白或膜蛋白保留在原位，只有可溶性蛋白才能通过细胞膜并可以离开细胞内部。未切割的融合蛋白与细胞膜相缔合并在透化后留在那里。含有可测量的信号(即报告蛋白)的部分可以从切割的融合蛋白离开细胞的内部，从而与细胞物理分离。
如本文所用的术语“量”涵盖例如报告蛋白或神经毒素多肽的绝对量、所述蛋白质或多肽的相对量或浓度以及与其相关或者可以从其得到的任何值或参数。
术语“确定例如报告蛋白或神经毒素多肽的量”是指以定量或半定量的方式测量例如报告蛋白或神经毒素多肽的绝对量、相对量或浓度。适用于检测的措施是本领域技术人员熟知的。应当理解，在一个方面，报告蛋白或神经毒素多肽的量的测定还需要通过应用具有预定量的报告蛋白或神经毒素多肽的标准溶液来校准方法。本领域技术人员众所周知的是如何进行这种校准；还参见以下实施例。
如本文所提及的“报告蛋白”或“检测蛋白”(两个术语是可互换的)在一个方面是酶如荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。例如，荧光素酶属于能够催化发光反应的一类酶。荧光素酶以萤火虫或细菌荧光素酶天然存在。荧光素酶及其亚基的结构以及编码它们的核酸序列是本领域熟知的，并且描述于例如chon1985,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》,260(10):6139-46；和johnston1986,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》,261(11):4805-11。荧光素酶活性可通过测量荧光素酶底物的酶促转化来确定。后者可以通过检测在转化反应期间发射的光的强度来测量。适于测量由荧光素酶催化的转化反应期间发生的发光的系统和试剂盒是本领域熟知的并且可商购获得(提供者为例如takaraclontech、thermoscientific和promega；也参见例如以下出版物：gailey,p.c.,miller,e.j.和griffin,g.d.(1997)low-costsystemforreal-timemonitoringofluciferasegeneexpression.《生物技术(biotechniques)》,22:528-534；gould,s.j.和subramani,s.(1988)fireflyluciferaseasatoolinmolecularandcellbiology.《分析生物化学(analyt.biochem.)》,175:5-13；fulton,r.和vanness,b.(1993)luminescentreportergeneassaysforluciferaseandbeta-galactosidaseusingaliquidscintillationcounter.《生物技术(biotechniques)》,14:762-763；lemasters,j.j.和hackenbrock,c.r.(1977)kineticsofproductinhibitionduringfireflyluciferaseluminescence.《生物化学(biochemistry)》,16(3):445-447；nguyen,v.t.,morange,m.和bensaude,o.(1988)fireflyluciferaseluminescenceassaysusingscintillationcountersforquantitationintransfectedmammaliancells.《分析生物化学(analyt.biochem.)》,171:404-408；seliger,h.h.和mcelroy,w.d.(1960)spectralemissionandquantumyieldoffireflybioluminescence.《生物化学和生物物理档案(arch.biochem.biophys.)),88:136-141；vieites,j.m.,navarro-garcía,f.,pérez-diaz,r.,pla,j.和nombela,c.(1994)expressionandinvivodeterminationoffireflyluciferaseasgenereporterinsaccharomycescerevisiae.《酵母(yeast)》,10:1321-1327)。在氧化还原反应中由荧光素酶介导的发光相当于样品中神经毒素多肽的量。因此，通过量化从细胞释放的荧光素酶的活性，可以确定神经毒素的生物活性。具有已知神经毒素多肽浓度的标准曲线可以并行地用作参考。作为进一步的参考，可以进行蛋白质测量，以便将荧光素酶的信号与样品中的细胞数相匹配，这可能因情况而异。该方法是本领域的常规方法，并且可以与上述本发明的活性测定法并行进行。可以用作报告蛋白的另一种合适的酶是β-半乳糖苷酶。使用该酶的测定法也可商购获得并在本领域描述(thermoscientifc、lifetechnologies、promega；nielsen,d.a.,chou,j.,mackrell,a.j.,casadaban,m.j.和steiner,d.f.(1983)《美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)》,80(17):5198-202)。可选地，荧光蛋白如gfp、yfp、bfp或rfp可以用作报告蛋白。使用所述报告蛋白的测定法是本领域已知的。如本文所用的术语“量化蛋白质的活性”是指测量在神经毒素敏感细胞透化后残留在可溶性上清液中的本发明的切割融合蛋白的报告蛋白活性，或者残留在神经毒素敏感细胞中或神经毒素敏感细胞处的本发明的未切割融合蛋白的残余报告蛋白活性，或者本发明的融合蛋白的总报告蛋白活性。为了确定报告蛋白的总活性，可以测定报告蛋白在透化细胞中的活性，或者可以测量除去上清液后剩余的总报告蛋白的活性。可选地，可以测量本发明的融合蛋白胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶中的标准化或归一化因子如gfp，其代表本发明的融合蛋白的总初始量。通过量化从细胞释放的报告蛋白的活性，可以确定神经毒素多肽的生物活性。
如本文所用的术语“测定神经毒素多肽的生物活性”是指测量神经毒素蛋白的生物活性，即(a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜转位进入细胞溶质中和/或(d)参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白切割。更具体地说，使神经毒素(例如，bont/a)切割神经毒素底物(例如，snap-25)的整体细胞机制涵盖神经毒素与其相应受体的结合(例如，bont/a与bont/a受体的结合)、神经毒素/受体复合物的内化、神经毒素轻链从细胞内囊泡转位进入细胞质和神经毒素底物的蛋白水解切割。用于测定神经毒素多肽的生物活性的体外和体内测定法是本领域众所周知的，并已在本文别处提及(参见例如pellett等,withemarsh等,《毒理学(toxicol.sciences)》,126(2),426-435(2012)；wo2010/105234a1)。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所使用的单数形式“一”和“所述”包括单数和复数个所指物。举例来说，“细胞”是指一个或多于一个细胞。
如本文所用的术语“约”在对所述项目、数量、百分比或条款的值进行限定时，指的是所述项目、数量、百分比或条款的值的±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的范围。优选的是±10％的范围。
如本文所用的术语“基本上纯化”是指神经毒素多肽基本上不含其它宿主细胞多肽，即它可能含有10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％宿主细胞多肽的杂质。
如本文所用的术语“包含”与“包括”、“涵盖”或“含有”同义，是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、不被引用的成员、要素或方法步骤。显然，术语“包含”涵盖术语“由……组成”。更具体地，如本文所用的术语“包含”意指权利要求涵盖所有列出的要素或方法步骤，但也可以包括额外的未命名的要素或方法步骤。例如，包括步骤a)、b)和c)的方法在其最狭义上包括由步骤a)、b)和c)组成的方法。短语“由……组成”是指组合物(或设备或方法)具有所述的要素(或步骤)，而不是更多。相比之下，除了步骤a)、b)和c)之外，术语“包含”还可以涵盖包括其它步骤例如步骤d)和e)的方法。
在本文中使用的数值范围如“化合物x的浓度在0.1与0.5微摩尔浓度之间”时，该范围不仅包括0.1和0.5微摩尔浓度，而且还包括在0.1与0.5微摩尔浓度之间的任何数值，例如0.2、0.3和0.4微摩尔浓度。
如本文所用的术语“体外”表示在动物或人类身体的外面或外部。如本文所用的术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人类身体移除并在身体外面(例如在培养容器中)保持或增殖的组织或细胞。如本文所用的术语“体内”表示动物或人类身体的里面或内部。
在一个具体方面，本发明的方法包括以下步骤：
(a)在神经毒素敏感细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点，所述神经毒素敏感细胞能够分成为神经元细胞；
(b)使步骤(a)的神经毒素敏感细胞在将所述神经毒素敏感细胞分化为神经元分化细胞的条件和时间下在培养基中分化；
(c)将步骤(b)的神经元分化细胞与神经毒素一起温育并在允许神经毒素发挥其生物活性的条件下培养所述细胞；
(d)在允许从透化的神经元分化细胞释放所述报告蛋白但不释放所述锚定蛋白的条件下使步骤(c)的神经元分化细胞透化；和
(e)量化从步骤(d)的细胞释放的报告蛋白的活性，从而确定所述神经毒素的生物活性。
在这个具体方面，神经毒素敏感细胞能够分化为神经元细胞。优选地，能够分化为神经元细胞的所述神经毒素敏感细胞是肿瘤细胞。在本发明方法的一些方面，能够分化为神经元细胞的所述肿瘤细胞是例如可从dsmz(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)以acc寄存编号164获得的sima细胞。sima细胞系dsmzacc164也称为亲本sima细胞系。如本发明方法中使用的sima细胞可以是亲本sima细胞或其(亚)克隆。这种亚克隆也是本领域已知的；参见例如wo2010/105234；us8,476,068b2；或esterfernández-salas,joannewang,yaniramolina,jeremyb.nelson,birgittep.s.jacky,k.rogeraoki-plosone；20127(11)e49516。在其它方面，能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞是p19细胞(jones-villeneuveem,mcburneymw,rogerska,kalninsvi.retinoicacidinducesembryonalcarcinomacellstodifferentiateintoneuronsandglialcells.《细胞生物学杂志(jcellbiol.)》,1982年8月；94(2):253-62；staineswa,craigj,reuhlk,mcburneymw.retinoicacidtreatedp19embryonalcarcinomacellsdifferentiateintooligodendrocytescapableofmyelination.《神经科学(neuroscience.)》,1996年4月；71(3):845-53)或sh-sy5y细胞(encinas,mario等,"sequentialtreatmentofsh-sy5ycellswithretinoicacidandbrain-derivedneurotrophicfactorgivesrisetofullydifferentiated,neurotrophicfactor-dependent,humanneuron-likecells."《神经化学杂志(journalofneurochemistry)》,75.3(2000):991-1003)。其它神经毒素敏感细胞在本文别处被提及。所述细胞可以根据dmsz的方案进行培养。在这种方法的其它具体方面，能够分化为神经元细胞的神经毒素敏感细胞是如下细胞或源自如下细胞：原代细胞、干细胞或诱导多能干细胞。用于将所述细胞分化为神经元细胞的方案在本领域中描述；参见例如所引用的出版物。
在本发明方法的一个具体方面，锚定蛋白是跨膜蛋白。优选地，跨膜蛋白选自胆碱转运蛋白、h1受体(组胺h1受体)、g蛋白偶联受体(gpcr)和sv2。
在本发明方法的一个具体方面，神经毒素切割位点选自bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g和tent切割位点。据了解，本发明融合蛋白中包含的神经毒素切割位点应由融合蛋白提供给神经毒素多肽，使得神经毒素蛋白酶能够在合适的条件下在神经毒素敏感细胞中识别、结合并切割本发明的融合蛋白。本领域技术人员非常了解如何设计融合蛋白内的合适布置。此外，可以对融合蛋白测试在神经毒素敏感细胞中通过蛋白水解活性的神经毒素多肽进行切割，如所附实施例中所述。
在本发明方法的另一个具体方面，报告蛋白是选自荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶的酶或选自gfp、yfp、bfp和rfp的荧光蛋白。
在本发明方法的另一个具体方面，将溶血素用于细胞的透化。神经毒素敏感细胞在允许从透化的神经毒素敏感细胞释放报告蛋白但不释放锚定蛋白的条件下透化。
溶血素优选选自链球菌溶血素o、产气荚膜梭菌溶血素o、肺炎球菌溶血素、细菌溶血素和来自蛇或蜘蛛的成孔毒素。本领域中充分描述了溶血素在透化细胞中的用途和这方面的方案。
在本发明方法的一个具体方面，融合蛋白包含选自以下的融合蛋白或由选自以下的融合蛋白组成：胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶、h1受体-snap-25-hrp和h1受体-snap-25-荧光素酶。此外，在一个方面涵盖包含如seqidno:2或4所示的氨基酸序列或与seqidno:2或seqidno:4具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。用于测定两个序列之间的序列同一性的手段和方法在本文别处提及。在一个方面，同一性％值是在参考序列(即seqidno:2或4)的整个氨基酸序列上计算的。以seqidno:2示出的氨基酸序列(胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶；cht-gfp-snap-luc)由seqidno:1和5所述的核酸序列编码，以seqidno:4示出的氨基酸序列(h1受体-snap-25-荧光素酶；h1r-snap-luc)由seqidno:3所述的核酸序列编码。相应序列示于序列表中。
在本发明方法的另一个方面，报告蛋白的活性的定量包括报告蛋白的活性的标准化。
在本发明方法的一个具体方面，通过测定留在神经毒素敏感细胞中或神经毒素敏感细胞处的非切割融合蛋白的残余报告蛋白活性或者融合蛋白的总报告蛋白活性来进行报告蛋白的活性的标准化。
此外，本发明涉及一种融合蛋白，其包含(i)锚定蛋白，(ii)报告蛋白，和(iii)插入所述锚定蛋白与所述报告蛋白之间的神经毒素切割位点，其用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性。优选地，神经毒素敏感细胞能够分化为神经元细胞。
关于本发明方法的定义和实施方案加以必要的变更就适用于本发明的融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞和试剂盒。
在本发明的融合蛋白的一个具体方面，锚定蛋白选自胆碱转运蛋白(cht)、h1受体、gpcr和sv2；报告蛋白是选自荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶(hrp)的酶或选自gfp、yfp、bfp和rfp的荧光蛋白；并且神经毒素切割位点选自bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g和tent切割位点。在本发明的融合蛋白中进一步涵盖所述锚定蛋白、报告蛋白和神经毒素切割位点的任何组合。优选地，本发明的融合蛋白的布置从n端到c端是锚定蛋白-神经毒素切割位点-报告蛋白。如果使用标准化因子，则本发明的融合蛋白的布置从n端到c端优选是锚定蛋白-标准化因子-神经毒素切割位点-报告蛋白。
在本发明的融合蛋白的另一个具体方面，融合蛋白包含选自以下的融合蛋白或由选自以下的融合蛋白组成：胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶(具有gfp作为标准化或归一化因子)、h1受体-snap-25-荧光素酶和h1受体-snap-25-hrp。此外，在一个方面涵盖包含如seqidno:2或4所示的氨基酸序列或与seqidno:2或seqidno:4具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。本文别处示出用于确定两个序列之间的序列同一性的手段和方法。在一个方面，同一性％值是在参考序列(即seqidno:2或4)的整个氨基酸序列上计算的。以seqidno:2示出的氨基酸序列(胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶；cht-gfp-snap-luc)由seqidno:1和5所述的核酸序列编码，以seqidno:4示出的氨基酸序列(h1受体-snap-25-荧光素酶；h1r-snap-luc)由seqidno:3所述的核酸序列编码。相应序列示于序列表中。
本发明还涉及一种编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸(分子)”是指单链或双链dna分子以及rna分子。所述术语涵盖基因组dna、cdna、hnrna、mrna以及所有这些分子物质的天然存在或人工改性的衍生物。在一个方面，多核苷酸可以是线性或环状分子。多核苷酸序列编码本发明的融合蛋白。此外，除了编码本发明的融合蛋白的核酸序列之外，如本文所用的多核苷酸可以包括适当转录和/或翻译所需的其它序列，例如5'或3'utr序列。编码本发明融合蛋白的核酸序列可以由本领域技术人员无需再费周折地从氨基酸序列得到。鉴于遗传密码的简并性，优化的密码子可用于编码本发明的融合蛋白的核酸序列中。从而可以实现在例如神经毒素敏感细胞中的最佳表达。
本发明还涉及一种包含本发明的多核苷酸的载体。在一个方面，所述载体是表达载体。
术语“载体”优选涵盖噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及允许靶向构建体随机或定点整合到基因组dna中的靶向构建体。这样的靶构建体优选包含足够长度的dna以用于同源或异源重组。涵盖本发明的多核苷酸的载体在一个方面还包含用于在宿主或宿主细胞中繁殖和/或选择的选择性标记。载体可以通过本领域熟知的各种技术并入宿主细胞中。例如，可以将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物中，或具有带电荷的脂质的复合物中或碳基簇如富勒烯中。可选地，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则可以在施用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系将其在体外包装。逆转录病毒载体可能是有复制能力或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒传播通常将仅在补体宿主/细胞中发生。此外，在本发明的一个方面，多核苷酸可操作地连接至表达控制序列，从而允许在原核或真核宿主细胞或其在所述载体中的分离部分中表达。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mrna。确保在宿主细胞中表达的调节元件是本领域熟知的。在一个方面，它们包括确保启动转录的调节序列和/或确保终止转录和稳定转录物的多聚a信号。另外的调节元件可以包括转录以及翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的lac-、trp-或tac-启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是aox1-或gal1-启动子(在酵母中)或cmv-、sv40-、rsv-启动子(rous肉瘤病毒)、cmv增强子、sv40-增强子或珠蛋白内含子(在哺乳动物和其它动物细胞中)。本发明设想的其它表达系统应允许在昆虫细胞中表达，例如基于多角体基因启动子的系统。
此外，诱导型表达控制序列可以用于本发明所涵盖的表达载体中。诱导型表达系统和合适的表达控制序列是本领域熟知的。例如，用于转录反式激活的四环素应答调节系统描述于：zhuz,zhengt,leecg,homerrj,eliasja:tetracycline-controlledtranscriptionalregulationsystems:advancesandapplicationintransgenicanimalmodeling.《细胞与发育生物学研讨会(semin.celldev.biol.)》,2002,13:121-8；或shockettp,schatzd:induciblegeneexpressionusinganautoregulatory,tetracycline-controlledsystem.《分子生物学实验指南(curr.protoc.mol.biol.)》,2002,第16章:第16.14单元。这种诱导型载体可以包含tet或lac操纵子序列或由热休克或本领域描述的其它环境因素诱导的序列。例如，两个常用的诱导型表达系统是tet-off和tet-on；参见bujard和gossen,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》,89(12):5547-51。它们由tet阻遏子和vp16激活结构域的融合物组成，以产生转录激活蛋白(反式激活因子)而不是阻遏子。由于tet-off或tet-on蛋白与位于诱导型启动子内的四环素应答元件(tre)的结合，基因表达被激活。差异与其对多西环素(dox)(一种更稳定的四环素类似物)的相应应答有关：tet-off在不存在dox的情况下激活表达，而tet-on在存在dox的情况下激活。合适的载体可商购获得。例如，由clontech设置的tet-on3g载体可用于产生严格调节和高度应答的四环素(tet)诱导型哺乳动物表达系统，其通过向培养基中加入多西环素来开启。pcmv-tet3g载体表达tet-on3g(四环素控制的反式激活子)，其在诱导剂多西环素存在下表现出高活性，而在多西环素缺乏情况下表现出极低的活性。tet-on3g由突变tet阻遏子(tetr)的氨基酸1-207与形成来自单纯疱疹病毒vp16蛋白的三个最小“f”型转录激活结构域的39个氨基酸的融合产生。tet-on3g的组成型表达由人类巨细胞病毒即时早期启动子(pcmvie)驱动。此外，ef1α版本可用于其中cmv启动子被沉默的细胞系。关于进一步详细信息，请参阅clontech目录号631163及其中引用的参考文献。除了负责起始转录的元件之外，这些调节元件还可以包含转录终止信号，例如多核苷酸下游的sv40-多聚a位点或tk-多聚a位点。在本文中，合适的表达载体是本领域已知的，例如okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pbluescript(stratagene)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3、pcdna3.1(invitrogen)或psport1(invitrogen)或杆状病毒源载体。优选地，所述载体是表达载体和基因转移或靶向载体。源自病毒如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送至靶向的细胞群体。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建重组病毒载体；参见例如sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecularcloningalaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory(1989),(2001)n.y.和ausubel,《分子生物学实验指南(currentprotocolsinmolecularbiology)》,greenpublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1994)中所述的技术。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸、载体或融合蛋白。
如本文所用的术语“宿主细胞”涵盖原核和真核宿主细胞，优选分离的原核和真核宿主细胞。宿主细胞优选是真核宿主细胞。如本文所用的真核宿主细胞是适于产生本发明的融合蛋白的动物细胞，优选哺乳动物或人类细胞系。本发明的多核苷酸或载体可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或由宿主细胞瞬时表达。因此，如本文所提及的宿主细胞在一个方面涵盖酵母细胞、哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞或昆虫细胞，作为原代细胞或作为细胞系。例如，本文提及的神经毒素敏感细胞可以用作宿主细胞。
本发明的融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的化学合成或重组分子生物学技术制造；参见例如sambrook,《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory,第三版,2001。在一个方面，这种制造本发明的融合蛋白的方法包括(a)培养本文别处描述的宿主细胞，和(b)从所述宿主细胞获得融合蛋白。在该方法的一个方面，本发明的融合蛋白可以通过常规纯化技术从宿主细胞裂解物获得，包括亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和/或制备型凝胶电泳。本发明的范围设想，融合蛋白还包括包含本发明的融合蛋白和其它蛋白质的多肽制剂。
此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的融合蛋白、编码融合蛋白的多核苷酸、载体和/或宿主细胞。如本文所用的术语“试剂盒”是指包含本发明提及的组分的试剂的集合，其以分开或共同的小瓶提供以备用方式来执行本发明的方法。在一个方面，所述试剂盒包括用于执行本发明方法的另外的试剂，在一个方面为包含神经毒素多肽的校准标准溶液和/或用于测量报告蛋白活性(例如荧光素酶活性)的试剂如用于报告蛋白或由所述报告蛋白转化的底物的检测剂。此外，所述试剂盒包括用于执行本发明方法的说明书。这些说明书可以作为手册提供，或者可以是数据存储介质上的计算机可执行算法的形式，其在执行时能够管控本发明方法的一个或多个步骤。在一个方面，所述试剂盒将用于执行上述本发明的方法。
最后，本发明涉及本发明的融合蛋白、编码融合蛋白的多核苷酸、载体和/或宿主细胞的用途，其用于测定神经毒素在神经毒素敏感细胞中的生物活性。
本发明现在将通过以下实施例进行说明，但所述实施例不应被解释为限制本发明的范围。
从头合成编码seqidno:2所示的氨基酸序列的具有seqidno:5所示序列的dna分子(胆碱转运蛋白-gfp-snap-25-荧光素酶；cht-gfp-snap-luc)，然后克隆到pcdna3.1载体(lifetechnologies)中。此外，扩增、提取和纯化质粒(具有插入构建体的dna载体)。dna合成、克隆、扩增和分离由geneart,lifetechnologies进行。
使用lipofectamine2000(lifetechnologies)将质粒转染到sh-sy5y细胞(atcccrl-2266)中。根据提供者的说明书进行细胞培养和转染。
质粒转染后，在庆大霉素存在下培养细胞，以选择性生长含有质粒的细胞。一旦培养物达到约5百万个细胞，就使用有限稀释法进行单个细胞克隆。通过这样做，产生约400个克隆并测试粘附质量、生长速率、质粒表达率和对bont/a的敏感性。根据pelletts,teppwh,clancycm,borodicge,johnsonea.《欧洲生化学会联合会快报(febslett.)》,2007年10月16日；581(25):4803-8，通过测量gfp荧光来测定表达率，同时通过western印迹snap-25切割测定法来测试bont/a敏感性。从表现出良好的粘附性和生长速率的克隆以及与sh-sy5y亲本细胞相比具有相当或更佳的敏感性的bont/a，选择具有最高gfp表达率的那些并储存在细胞库中。
对于bont/a报告基因测定法，将细胞接种在96孔板上，随后根据rasetti-escargueil等(enhancedsensitivitytobotulinumtypeaneurotoxinofhumanneuroblastomash-sy5ycellsafterdifferentiationintomatureneuronalcells,c.rasetti-escargueil,c.b.machado,r.preneta-blanc,r.a.fleck,d.sesardic,《肉毒杆菌杂志(thebotulinumj.(tbj))》,第2卷,第1期,2011)进行分化。将分化的细胞与培养基中稀释的bont/a一起温育72小时，在对数步骤中达到0.01至10pm的最终浓度。温育后，将细胞用pbs(10mm磷酸钠、0.9％nacl，ph7.4)洗涤一次，并用50μl链球菌溶血素o溶液(10mm磷酸钠、0.9％nacl、10mm二硫苏糖醇、50u/ml链球菌溶血素o，ph7.4)透化。在37℃温育15分钟后，将每孔的上清液转移到白色96孔板中，并且根据提供者的说明书(sigmaaldrichluc1-1kt)测定荧光素酶活性。将残留在培养板上的细胞用pbs洗涤一次，并在读板器中测量gfp荧光。对于每个单孔，通过除以测量的信号值来计算luc/gfp比。通过将未知样品的剂量-反应曲线与参考标准的相应曲线进行比较来计算bont/a生物活性，例如通过平行线测定法。
序列表
<110>莫茨药物股份两合公司
<120>用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法
<130>mp12470pc
<160>5
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<211>1574
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<220>
<223>融合蛋白
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