具有聚合物接枝的多孔薄膜、其方法及用途与流程

相关申请交叉引用

本申请涉及与本文同时提交的标题为“porousmembraneswithapolymergrafting,methodsandusesthereof”(具有聚合物接枝的多孔薄膜、其方法及用途)的美国专利申请14/548,383，其全部公开内容通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明一般涉及用聚合物涂层接枝以促进生物分子固定到多孔薄膜上的多孔薄膜。本文也描述制备和使用具有这些聚合物涂层的经改性多孔薄膜的方法。

背景

多孔薄膜，例如硝化纤维素薄膜，常规用于多种过程，包括需要固定一种或多种生物分子的生物应用。这些生物分子包括但不限于蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna))。需要薄膜用于固定生物分子，用于例如免疫检验、体外诊断试验(具体地讲，定点护理诊断方法)和分离多种生物过程和医疗技术的生物样品(例如，血尿、唾液、痰、其它身体分泌物和组织样品)中的分析物或生物分子。

硝化纤维素薄膜显示硝化纤维素薄膜和一种或多种生物分子之间的实质非特异相互作用，且研究者传统上依赖这种被动结合作为基础在多种“捕集”型固定方法中使用硝化纤维素薄膜。然而，为了在很多生物应用中成功使用硝化纤维素薄膜，对硝化纤维素薄膜和关注的生物分子之间这种被动相互作用的依赖可导致复杂性，因为必然限制可能固定在硝化纤维素薄膜上的生物分子的量。对这种被动结合过程的依赖足够用于其中在待分析的生物样品中存在足够高浓度的分析物或生物分子的某些应用。然而，这种被动结合过程限制基于传统硝化纤维素薄膜的技术，例如，在其中分析物或生物分子量低且由已知组合物和标准方法可能“不可检测”的病症中。硝化纤维素薄膜和关注的生物分子之间的被动相互作用可进一步导致在使用期间在基于流的检验(例如，侧流检验)中生物分子从硝化纤维素薄膜的一定程度分离。在液体流动通过薄膜用于洗涤、洗脱或检测时，生物分子可能分离。这造成由生物分子结合分析物的灵敏度损失，并增加成本，因为在结合检验中需要使用更多生物分子，以在不同应用中解释生物分子分离。

以前研究已用不同技术来改性多孔薄膜，例如硝化纤维素薄膜，以改善生物分子结合或固定在多孔薄膜基材上。促进生物分子结合到多孔薄膜的方法包括但不限于氨等离子体处理、氧等离子体处理、“桥连”分子共价结合和硝化纤维素薄膜羟胺处理。这些技术和薄膜改性未达到本领域技术人员希望的目标。

因此，在本领域需要能够较好固定和结合生物分子的基材和使基材(例如多孔薄膜)改性(例如，化学改性)以改善固定和结合关注的生物分子(例如，蛋白质和核酸)的方法。

概述

在一个实施方案中，本发明提供一种用免疫检验从生物样品检测分析物的方法，其中所述方法包括a)提供具有式(i)结构的经改性多孔薄膜，其中式(i)为：

其中a为电子束(e-beam)反应部分，聚(a)x为电子束反应部分的聚合物，x为聚(a)x聚合物中存在的a单体数；其中b为选自马来酰亚胺、碘乙酸酯、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐、硫化物、羧酸、醛或其组合的反应性基团；其中所述连接体在聚(a)x聚合物和b之间形成键；并且其中聚(a)x-连接体-b为共价接枝到多孔薄膜的聚合物涂层；b)用第一生物分子培养经改性多孔薄膜，其中第一生物分子通过与b反应性基团反应结合到经改性多孔薄膜，以形成包含第一生物分子的活性多孔薄膜；和c)将包含至少一种分析物的生物样品加到活性多孔薄膜，用于通过活性多孔薄膜的第一生物分子捕集分析物检测分析物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于检测生物样品中存在的分析物的生物分子固定的方法，其中所述方法包括a)提供具有式(i)结构的经改性多孔薄膜，其中式(i)为：

其中a为电子束(e-beam)反应部分，聚(a)x为电子束反应部分的聚合物，x为聚(a)x聚合物中存在的a单体数；其中b为选自马来酰亚胺、碘乙酸酯、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐、硫化物、羧酸、醛或其组合的反应性基团；其中连接体在聚(a)x聚合物和b之间形成键；并且其中聚(a)x-连接体-b为共价接枝到多孔薄膜的聚合物涂层；b)在包含第一生物分子的样品中培养经改性多孔薄膜，以引发第一生物分子结合到经改性多孔薄膜；和c)使第一生物分子固定到经改性多孔薄膜。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于固定抗体的多孔薄膜，其中所述多孔薄膜包括式(i)的结构：

其中a为电子束(e-beam)反应部分，聚(a)x为电子束反应部分的聚合物，x为聚(a)x聚合物中存在的a单体数；其中b为选自马来酰亚胺、碘乙酸酯、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐、硫化物、羧酸、醛或其组合的反应性基团；其中连接体在聚(a)x聚合物和b之间形成键；并且其中聚(a)x-连接体-b为共价接枝到多孔薄膜的聚合物涂层。

附图

图1为通过电子束照射在多孔薄膜上接枝的机制的示意图。

图2提供显示根据本发明的示例性方法的不同基团在硝化纤维素薄膜上接枝效率的atrftir光谱。

图3a显示对于分析物人绒毛膜促性腺激素(hcg)与未改性ff80hp硝化纤维素薄膜比较活性薄膜的侧流检验(lfa)试验性能。

图3b显示对于分析物肌酸激酶-mb(ckmb)与未改性ff80hp硝化纤维素薄膜比较活性薄膜的lfa试验性能。

图3c显示对于分析物肌钙蛋白i与未改性ff80hp硝化纤维素薄膜比较活性薄膜的lfa试验性能。

图4a提供对于分析物hcg(1000miu/ml)使用在室温和50%相对湿度(rh)老化的未改性ff80hp硝化纤维素薄膜的hcg的lfa试验性能。

图4b提供对于分析物hcg(1000miu/ml)使用在室温和50%rh老化的nhs-酯接枝薄膜的hcg的试验性能。

图4c提供对于分析物hcg(1000miu/ml)使用在室温和50%rh老化的环氧化物-接枝薄膜的hcg的lfa试验性能。

图4d提供对于分析物hcg(1000miu/ml)使用在室温和50%相对湿度(rh)老化的马来酰亚胺接枝薄膜的hcg的试验性能。

图4e为显示图4a的lfa性能的信号强度的曲线图。

图4f为显示图4b的lfa性能的信号强度的曲线图。

图4g为显示图4c的lfa性能的信号强度的曲线图。

图4h为显示图4d的lfa性能的信号强度的曲线图。

图5提供使用不同量的nhs-酯官能团接枝的硝化纤维素(nc)的hcg的lfa试验性能。

图6为显示与未改性ff80hp硝化纤维素比较作为在硝化纤维素上接枝的nhs-酯量的函数的背景校正试验线强度改善的曲线图。

图7a提供在2min(t=2min)后丙烯酸接枝硝化纤维素(nc-aa)的lfa试验性能，其中nc-aa为用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素(nc-nhs-酯)的水解产物。

图7b提供在20min(t=20min)后丙烯酸接枝硝化纤维素(nc-aa)的lfa试验性能，其中nc-aa为用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素(nc-nhs-酯)的水解产物。

图8a提供使用本发明的活性硝化纤维素薄膜、未改性ff80hpnc薄膜和市售硝化纤维素薄膜的hcg的lfa性能比较。

图8b为显示相对于ff80hp归一化的使用本发明的活性硝化纤维素薄膜、未改性ff80hpnc薄膜和市售硝化纤维素薄膜的hcg的lfa性能的信号强度比较的曲线图。

详述

在以下说明书和权利要求书中后续将提及一些术语，这些术语应限定为具有以下含义。

除非上下文另外清楚地指明，单数形式“一”和“所述”包括复数对象。“任选”或“任选地”意味随后描述的事件或情况可发生或可不发生，并且此描述包括事件发生的情况和不发生的情况。如在整个说明书和权利要求书中所用，可用近似语言修饰任何定量表示，这些表示可容许改变，而不引起所涉及基本功能的改变。因此，由术语例如“约”修饰的数值不限于所指定的精确值。在某些情况下，近似语言可相当于用于测量数值的仪器的精度。

为了更清楚和简要地描述和指出要求保护的发明的主题，对在以下描述和在随附权利要求中使用的具体术语提供以下定义。在整个说明书中，具体术语的例证应认作为非限制实例。

本文所用术语“硝化纤维素薄膜”包括含任何氮浓度、各种孔径和可变薄膜厚度的多孔薄膜产物。在具体实施方案中，多孔薄膜的孔径可在0.01至50微米范围内。另外，孔径可在整个多孔薄膜中均匀，或可替代地，孔径可不规则。选择多孔薄膜完全在本领域技术人员的技术和知识内，例如，具有合适氮含量、孔径和薄膜厚度的硝化纤维素薄膜，以得到具体的期望结果。另外，本领域技术人员应立即理解和了解短语“硝化纤维素薄膜”的意义，且例如这些硝化纤维素薄膜或市售硝化纤维素薄膜可以为“无背衬”或“未改性”薄膜，或可替代地包含“背衬材料”或“背衬载体”，如聚酯(pe)。选择使用“无背衬”还是“背衬”多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)取决于要进行的具体应用，且完全在本领域技术人员作出选择的范围内。

本文所用术语“经改性”，特别关于所公开的多孔薄膜和固相材料，旨在包括对多孔薄膜或固相材料的任何改变，例如初始未改性多孔薄膜或固相薄膜基材的化学改变。通过生成包含能够与其它亲核元素(例如氮或硫)形成共价键的化学部分的聚合物，可使多孔薄膜“改性”(例如，化学改性)，例如，接枝到多孔薄膜的包含n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)基团的化合物。在一个方面，多孔薄膜为包含接枝到多孔薄膜上的包含nhs-酯基团的化合物的聚合物的硝化纤维素薄膜。经改性多孔薄膜可包含至少一个接枝到多孔薄膜的聚合物涂层，以促进生物分子固定到多孔薄膜上。类似地，多孔薄膜可以为包含接枝到多孔薄膜上的包含nhs-酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺或溴化物基团的化合物或这些中的两种或更多种的组合的聚合物的硝化纤维素薄膜。

本文所用术语“包含n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)基团的化合物”指包含至少一个nhs-酯基团的任何化合物。可在本公开的组合物和方法中使用任何可聚合的包含nhs-酯基团的化合物，例如丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。在一个实施方案中，经改性多孔薄膜为用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的聚合物接枝的硝化纤维素薄膜。

本文所用术语“活性薄膜”指包含结合到经改性薄膜的一种或多种第一生物分子的薄膜。第一生物分子可通过反应性基团“b”结合到经改性薄膜，如参考结构(i)的化合物。在第一生物分子结合到经改性薄膜后，“经改性薄膜”成为“活性薄膜”。“活性薄膜”在本文中可互换称为“活性多孔薄膜”。

本文所用术语“第一生物分子”指结合到经改性薄膜表面的生物分子，其中所述生物分子可包括蛋白质、肽或核酸。在一个具体实施方案中，第一生物分子为蛋白质，例如抗体。第一生物分子可固定到经改性薄膜表面上，并形成活性薄膜。包含第一生物分子的活性薄膜可进一步用于捕集在生物样品中存在的一种或多种分析物。在一些实施方案中，分析物为生物分子，且活性薄膜上的第一生物分子捕集样品的分析物(生物分子)。

本文所用术语“多孔薄膜”指包含孔且至少一种聚合物可在其中接枝的任何薄膜。其中聚合物接枝可行的多孔薄膜包括任何市售多孔薄膜，具体地讲，市售硝化纤维素薄膜。

本文所用术语“分析物”指正通过检验或试验(例如免疫检验或其它诊断试验)确定在例如生物样品中其存在或不存在的物质或化学成分。在一些实例中，生物样品中存在的抗原可作为分析物，其中在分析期间抗原结合到固定在基材上的抗体。分析物的非限制实例可包括人绒毛膜促性腺激素(hcg)、肌酸激酶-mb(ck-mb)和肌钙蛋白i。

本文所用术语“抗分析物”指对结合到分析物分子具有特异性的物质或化学成分。抗分析物可帮助检测不同反应或检验中的分析物分子，例如，在免疫检验或其它诊断试验中。出于检测的目的，抗分析物分子可与在结合到分析物(例如抗原)时产生颜色或荧光或猝灭荧光的底物或荧光团连接。抗分析物分子可结合到探针，包括但不限于荧光探针、磷光探针、化学探针、光学探针等。例如，如果分析物为结合到在基材上固定的抗体的抗原，则探针改性的抗分析物可结合到该抗原，并通过产生检测颜色或荧光指示分析物存在。

本文所用术语“生物样品”包括但不限于从人或非人生物体得到的血液、血清、淋巴、唾液、粘膜、尿、其它身体分泌物、细胞和组织切片。也可将包含一种或多种生物分子的缓冲液认作为生物样品。

本文所用术语“生物分子”非限制性指核酸(例如，dna或rna)或蛋白质(例如，抗体)。生物分子还包括从生物体(例如，病人)得到的任何有机分子。

“免疫检验”在本文中以其最宽意义使用，包括基于抗体及其相应抗原之间相互作用的任何技术。这些检验基于抗体以高特异性结合到一个或很有限组的相似分子(例如，抗原)的独特能力。结合到抗体的分子称为抗原。免疫检验可用抗原或抗体作为“捕集”分子“捕集”抗体-抗原对的其它成员来进行。

在本文中提供经改性多孔薄膜(例如经改性硝化纤维素薄膜)和使用薄膜的方法的实施方案。经改性薄膜可用于多种应用，例如免疫检验、体外诊断试验(例如，定点护理诊断应用)或用于分离生物样品中关注的生物分子的技术。具有聚合物接枝的多孔薄膜改善生物分子固定和结合到多孔薄膜，并有利地超过在本领域已知的不同薄膜。经改性多孔薄膜可通过不同示例性方法产生。

改善生物分子固定和结合到多孔薄膜的方法的一个或多个实例包括提供具有式(i)结构的经改性多孔薄膜，其中式(i)为：

其中a为电子束(e-beam)反应部分，聚(a)x为电子束反应部分的聚合物，x为聚(a)x聚合物中存在的a单体数；其中b为选自马来酰亚胺、碘乙酸酯、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐或其组合的反应性基团；其中连接体在聚(a)x聚合物和b之间形成键；并且其中聚(a)x-连接体-b为共价接枝到多孔薄膜上的聚合物。所述方法进一步包括用第一生物分子培养经改性多孔薄膜，其中第一生物分子通过与b反应性基团反应结合到经改性多孔薄膜，以形成包含第一生物分子的活性多孔薄膜；随后将包含至少一种分析物的生物样品加到活性多孔薄膜，用于通过活性多孔薄膜的第一生物分子捕集分析物检测分析物。

示例的经改性多孔薄膜的示意图提供于以上式(i)中，包括接枝到多孔薄膜的聚合物，其中所述聚合物接枝到薄膜表面上。在一些实施方案中，经接枝聚合物包括1)可变长度的电子(电子束)反应部分单体链的聚合物，称为聚(a)x；2)标为b的官能团，该官能团与关注生物分子上存在的具体化学基团反应，例如胺(在b为n-羟基琥珀酰亚胺酯时)或硫醇(在b为碘乙酸酯或马来酰亚胺时)，从而通过形成共价键促进生物分子固定到多孔薄膜上；3)在聚(a)x和基团b之间形成键的连接体。经接枝聚合物(例如，在示意式中标为“聚(a)x-连接体-b”)包括数种组分(例如，聚(a)x聚合物、连接体和官能部分b)，且聚合物涂层接枝(例如，共价结合)到多孔薄膜的表面。

如注意到，多孔薄膜包括电子束反应部分基团a的聚(a)x聚合物，其中x为聚(a)x聚合物中存在的a单体数。在电子束引起的聚合期间，电子束在多孔薄膜、单体(a)或生长聚(a)x聚合物上的位置产生自由基(未配对电子)。在多孔薄膜上生成的自由基作为聚(a)x聚合物生长所用的引发位点，导致聚(a)x接枝到多孔薄膜上。这一过程描述于方案(i)中，此时多孔薄膜为硝化纤维素，其中∪表示一个聚合物接枝到另一个聚合物上，x为经聚合单体数，b如上限定。在聚(a)x-连接体-b为共聚物的情况下，在电子束引起的聚合期间可存在两种或更多种单体。

方案i：聚合物通过电子束辐射接枝到硝化纤维素薄膜上

应注意到，基材通过电子束反应性a基团聚合(生成(ax))改性，并连接到基团b，以生成式(i)的经改性基材。经改性基材包含聚合形式而非电子束反应形式的基团a，基团a在a基团聚合之前为电子束反应性。经改性基材用于不同应用，例如免疫检验。

不旨在限于具体作用机制，本文所用术语“电子束反应部分”，在式(i)中指定为“a”，指认为在经过电子束照射时自聚合的任何化学官能团。示例性电子束反应部分包括但不限于包含甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯类、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物和基于叔碳(chr3)的化合物或两种或更多种上述电子束反应部分的那些化合物。另外，本领域技术人员可设想用于本发明基于此代表性列表的其它合适的电子束反应部分。

如所注意到，在式(i)中，b基团促进与化学基团反应，例如在关注生物分子上存在的胺基，并促进生物分子固定到多孔薄膜上。在一些实施方案中，b基团为选自马来酰亚胺、碘乙酰胺、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐或其组合的反应性基团。在一些实施方案中，经接枝聚合物可包含多于一种类型的b部分。在这些实施方案中，聚(a)x-连接体-b为共聚物。在共聚物的情况下，b包括无规或明确限定模型的一种或多种不同反应性基团。

在一个或多个实施方案中，b基团为n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)化合物。b基团可以为选自甲基丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯或丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的包含n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)基团的化合物。在具体实施方案中，b官能团为衍生自包含nhs-酯基团的化合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)的nhs-酯基团。在多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)的这些方面，薄膜可包括例如丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯化合物的经接枝聚合物。

甲基丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯

丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯

用于在多孔基材上生成经接枝聚合物的马来酰亚胺的实例可包括但不限于：

甲基丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯

丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯

甲基丙烯酸2-(((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基)羰基)氨基)乙酯

甲基丙烯酸2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基)脲基)乙酯

用于在多孔基材上生成经接枝聚合物的碘乙酰胺的实例可包括但不限于：

甲基丙烯酸2-(2-碘乙酰氧基)乙酯

丙烯酸2-(2-碘乙酰氧基)乙酯

用于在多孔基材上生成经接枝聚合物的溴化物的实例可包括但不限于：

甲基丙烯酸2-溴乙酯

丙烯酸2-溴乙酯

可用于在多孔基材上生成经接枝聚合物的酸酐的实例包括但不限于：

呋喃-2,5-二酮

(马来酸酐)

在一个实施方案中，除了包含至少一种马来酰亚胺、碘乙酰胺、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐基团的化合物或其组合外，b基团还包括包含环氧基的化合物。包含环氧基的化合物可选自甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)、丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚、甲代烯丙基缩水甘油基醚或其任何组合。除了包含至少一种马来酰亚胺、碘乙酰胺、溴化物、n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)、酸酐基团的化合物或其组合外，还可包括在式(i)示意表示中标记的b官能团，而不以任何方式限于包含环氧基的化合物、聚乙二醇(peg)、炔基、羟基、胺基、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基、硅烷基、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮烯、氢硅烷基、腈、烷基膦酸酯和这些官能部分中的两种或更多种的任何组合。

可用于在多孔基材上生成经接枝聚合物的环氧化物的实例包括但不限于：

甲基丙烯酸环氧乙烷-2-基甲酯

丙烯酸环氧乙烷-2-基甲酯

虽然不旨在限于具体作用机制，b官能团可通过电子束照射引入到多孔薄膜上，引起电子束反应部分自聚合，这继而使b官能团共价连接(接枝)到多孔薄膜上，同时使b官能团可用于与合适化学部分反应，例如胺、硫醇或生物分子(例如蛋白质，特别是抗体)上存在的其它亲核基团，从而促进第一生物分子固定到经改性多孔薄膜上。这种改性是有利的，因为很多多孔薄膜，例如未改性硝化纤维素薄膜，缺乏使具有例如氨基的关注生物分子(例如蛋白质，更具体地讲，抗体)共价结合到多孔薄膜必要的有机官能团。

经改性多孔薄膜上存在的一定量的b基团也可对侧流试验性能具有很强影响。本领域技术人员应预料，必须存在最低水平的b基团，以超过相应未改性多孔薄膜增强侧流试验性能。在用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(b基团=nhs-酯)接枝薄膜的情况下，有最大接枝水平，且在与相应未改性多孔薄膜比较时，高于该最大水平的接枝导致侧流性能降低，这是意料不到的观察结果(图5)。在侧流检验中，在高背景信号存在下观察到对于nhs-酯接枝薄膜的高于最大接枝水平的降低的侧流性能。在经改性多孔薄膜为用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素的情况下，用小于约350μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜，hcg侧流试验性能改善。与未改性硝化纤维素比较，在减去背景信号后(见图6)，如通过试验线强度定量，大于约450μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜导致减小的hcg试验性能增强。

在式(i)中，连接体在聚(a)x聚合物和b之间形成键，且聚(a)x-连接体-b为共价接枝到多孔薄膜的聚合物涂层。在一个或多个实施方案中，连接体包括酯、脂族链、脂环族链、芳族链、杂环化合物、亲水化合物、杂芳族化合物或以上连接体中的两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，连接体包括杂原子，例如o、s、n或p。式(i)中所示的在聚(a)x聚合物和官能b基团之间形成键的“连接体”包括但不限于酯、脂族链、脂环族链、芳族链、杂环化合物、亲水化合物、杂芳族化合物或这些示例性连接体中的两种或更多种的任何组合。

如所注意到，所述方法包括提供具有以上所示式(i)结构的经改性多孔薄膜，随后用第一生物分子培养经改性多孔薄膜，其中第一生物分子通过与b反应性基团反应结合到经改性多孔薄膜，以形成包含第一生物分子的活性多孔薄膜。

如所注意到，第一生物分子通过与b反应性基团反应结合到经改性多孔薄膜，其中在各第一生物分子和经改性多孔薄膜之间形成键。在这些实施方案中，聚合物接枝的薄膜的b反应性基团与第一生物分子的特定化学基团反应，从而通过形成共价键促进第一生物分子固定到多孔薄膜上。例如，在b为n-羟基琥珀酰亚胺酯基时，它与关注的第一生物分子上存在的胺基反应。在另一个实例中，在b为碘乙酸酯或马来酰亚胺时，它与关注的第一生物分子上存在的硫醇基反应，以形成共价键。在一些实施方案中，在各第一生物分子和经改性多孔薄膜之间的键为共价键。第一生物分子结合到经改性多孔薄膜形成活性多孔薄膜。

在一些实例中，所述方法进一步包括洗涤第一生物分子结合的经改性多孔薄膜，以去除未结合的生物分子。在这些实施方案中，去除未特异结合到薄膜的生物分子。在一些实施方案中，第一生物分子结合的活性薄膜的洗涤步骤是任选的。在这些实施方案中，可在经改性薄膜活化后直接使用薄膜。洗涤活性多孔薄膜可用包含非离子表面活性剂的溶液进行，且所述非离子表面活性剂可例如为乙氧基化脱水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

在一些实施方案中，一旦电子束引起的聚合完成，就用水洗涤薄膜，以去除任何未聚合单体和任何未接枝到多孔薄膜的聚合物。去除未聚合单体和任何未接枝到多孔薄膜的聚合物是有利的，因为它消除第一生物分子与未接枝到薄膜表面上的b基团的共价连接。对于减小产生精确分析物检测所需的第一生物分子的量，消除生物分子和未接枝b基团之间的连接可使性能增强超过未改性薄膜。在一些实施方案中，为了改变经改性多孔薄膜的亲水性及其相应流体流动性质，可任选用包含表面活性剂的水溶液洗涤薄膜。控制流体流动性质可导向控制在侧流检验中成功分析物检测所需的时间。

数种b基团为水反应性，且在本领域已知其在与水接触时分解。本发明的实施方案的薄膜能够在经改性薄膜上保留b-基团官能团，例如n-羟基琥珀酰亚胺-酯(nhs-酯)官能团。应注意到，在b基团为nhs-酯时，用水洗涤经改性多孔薄膜不导致反应性损失。由于nhs-酯基一般在暴露于水时水解，防止在用水或缓冲液洗涤薄膜后包含nhs-酯作为b-基团的聚合物-接枝的活性损失是意料不到的结果。用nhs-酯官能团接枝的经改性多孔薄膜的水解产生用聚丙烯酸接枝的多孔薄膜，如实施例7中讨论。由于存在高背景信号，用聚丙烯酸接枝的多孔薄膜已显示在侧流试验中不良的性能，如图7a和7b中所示。

在所述方法的一些实例中，相对于第一生物分子在未改性多孔薄膜上固定，第一生物分子显示在经改性多孔薄膜上改善的固定。经改性多孔薄膜可允许通过在生物分子和多孔薄膜之间形成共价键增加生物分子(例如dna、rna和蛋白质，具体地讲，抗体)结合到多孔薄膜，从而导致改善免疫检验和诊断试验的特异性和灵敏度，减少假阳性和假阴性试验结果数，或者减小检测的分析物浓度要求。

如所注意到，在所述方法的一些实施方案中，可形成活性多孔薄膜，随后通过加入包含至少一种分析物的生物样品检测分析物。在这些实施方案中，将包含至少一种分析物的生物样品加到第一生物分子结合的活性多孔薄膜用于检测分析物，其中通过结合到经改性多孔薄膜的第一生物分子捕集分析物。另外，为了例如在免疫检验或定点护理诊断中精确检测生物分子，可通过使用活性薄膜减小生物样品中分析物(例如，生物分子)浓度的需求。这对检测生物样品中甚至少量存在那些分析物(例如，生物分子)特别有利。由于改善第一生物分子在活性薄膜上的固定效率，活性多孔薄膜可进一步缩短精确检测分析物(例如生物分子)存在所需的时间，从而也提供较快阳性或阴性试验结果。

在一些实施方案中，最大限度减少第一生物分子非特异结合到经改性多孔薄膜改善信号:噪声比，例如在免疫检验中。在这些实施方案中，免疫检验基于薄膜上固定的抗体(例如，第一生物分子)和分析这种生物分子的存在或量的样品中存在的分析物(例如关注的特异生物分子(例如，蛋白质))的特异相互作用。

可利用不同多孔薄膜产生本发明的实施方案的经改性多孔薄膜。未改性多孔薄膜的实例可包括但不限于硝化纤维素薄膜、纤维素薄膜、乙酸纤维素薄膜、再生纤维素薄膜、硝化纤维素混合酯薄膜、聚醚砜薄膜、尼龙薄膜、聚烯烃薄膜、聚酯薄膜、聚碳酸酯薄膜、聚丙烯薄膜、聚偏二氟乙烯薄膜、聚乙烯薄膜、聚苯乙烯薄膜、聚氨酯薄膜、聚苯醚薄膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物薄膜和以上薄膜中的两种或更多种的任何组合。

如所注意到，在一些实施方案中，薄膜为多孔薄膜，包括任何市售多孔薄膜，具体地讲，市售硝化纤维素薄膜。在某些方面，硝化纤维素薄膜经化学改性，以包括如式(i)中所述的促进生物分子(第一生物分子)固定到经改性多孔薄膜上的接枝到薄膜表面的聚合物。例如，一种这样的经改性多孔薄膜包括接枝到硝化纤维素薄膜的包含nhs-酯基团的化合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)。

如上限定，硝化纤维素薄膜可具有任何氮浓度、孔径或存在或不存在背衬载体。硝化纤维素薄膜具有多种化学和物理性质，并常规用于需要例如关注生物分子(例如抗体)固定到多孔薄膜的生物技术，或用于在这些多孔薄膜上收集生物分子，以使它们从待分析生物样品中的其它蛋白质、核酸和生物分子或类似物分离。任何硝化纤维素薄膜可用于经改性薄膜。由硝化纤维素聚合物制成的硝化纤维素薄膜对高分子量dna、rna和蛋白质具有强亲和性，并防止这些生物分子变性。

本发明进一步提供制备包含永久接枝到多孔薄膜上的聚合物涂层的多孔薄膜的方法(在图1中示意)。在一些实施方案中，通过多孔薄膜首先浸入包含电子束反应部分(a基团)、在聚-(a)x聚合物和可用于与生物分子上存在的官能部分反应的官能b基团(见式(i))之间形成键的“连接体”的单体的溶液，然后经过电子束，以生成聚合物，例如“聚-(a)x聚合物”，用聚合物接枝经改性多孔薄膜。例如，使多孔薄膜浸入包含n-羟基琥珀酰亚胺酯基团的化合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)，然后经过电子束照射。或者，在本发明的其它方面，通过首先使多孔薄膜经过电子束照射，随后如上所述使薄膜浸入例如包含琥珀酰亚胺酯基团的化合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)的溶液，制备经改性多孔薄膜。改变例如浸入方法步骤和电子束照射步骤次序的产生本文所述经改性多孔薄膜基材的方法也为制备经改性薄膜的方法所包括。

如下文更详细描述的用于制备经改性多孔薄膜的方法的上下文中使用时，术语“浸”多孔薄膜在例如包含n-羟基琥珀酰亚胺酯基团的化合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)的溶液中一般通过整个多孔薄膜浸入聚合物涂料(聚(a)x-连接体-b)溶液，然后去除任何过量溶液来完成。

在本发明的某些方面，经改性多孔薄膜，具体地讲，硝化纤维素薄膜，如上所述用单体的水溶液制备，形成聚合物接枝，在本文中描述为(聚(a)x-连接体-b)。单体溶液可进一步包含增溶剂，以改善单体在水中的溶解度。例如，表面活性剂，更具体地讲，非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(tween-20™))，可用作增溶剂，以提高例如丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯在水中的溶解度。本领域技术人员应了解，提高例如包含nhs-酯基团的化合物溶解度所需的特定增溶剂(例如，非离子表面活性剂，如tween-20™))的合适量必须实验确定和优化。

不旨在限于制备用聚合物(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)接枝的经改性多孔薄膜的具体方法，在本文中提供制备经改性多孔薄膜的示例性方法。也可用其它方法产生经改性多孔薄膜。在一个实施方案中，经改性多孔薄膜通过以下方法制备：提供多孔薄膜；使多孔薄膜浸入a基团、b反应性基团的单体的溶液；使所得多孔薄膜经过电子束照射，以生成聚(a)x-连接体-b的聚合物；干燥多孔薄膜，从而制备经改性多孔薄膜。或者，经改性多孔薄膜通过以下方法制备：首先使多孔薄膜经过电子束照射，然后使多孔薄膜浸入单体a的溶液。即，本发明的经改性多孔薄膜通过以下方法制备：首先提供多孔薄膜；使多孔薄膜经过电子束照射；使硝化纤维素薄膜浸入单体的溶液，以在电子束照射时生成聚合物，干燥多孔薄膜，从而制备经改性多孔薄膜。

不旨在限于具体机制，在以上关于产生经改性多孔薄膜的方法中，具体地讲，硝化纤维素薄膜，认为电子束辐射在多孔薄膜上产生自由基，然后可用于进攻例如包含丙烯酸酯基团的化合物(如丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)上的双键，从而引发电子束可聚合部分自聚合，并导致聚合物接枝到多孔薄膜上，具体地讲，硝化纤维素薄膜。接枝到多孔薄膜的官能团b(例如，nhs-酯基)然后可用于与关注生物分子上存在的胺和其它化学基团反应，引起与未改性多孔薄膜比较，增加生物分子结合到经改性多孔薄膜。增加生物分子(例如抗体)特异结合可改善例如免疫检验的灵敏度和特异性。

选择将聚合物涂层接枝到多孔薄膜的方法中使用的电子束辐射的剂量，以使接枝到多孔薄膜的聚合物涂层的量达到最大限度，同时也限制已知由电子束照射造成的多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)的降解。本领域技术人员应认识到，用于制备本发明的经改性多孔薄膜的电子束辐射的合适剂量将需要实验优化。在具体实施方案中，在制备经改性多孔薄膜的方法中使用的电子束辐射的剂量可在小于1kgy至约50kgy范围内。适用于本发明的方法的参数优化的检验设计是标准的，且完全在本领域技术人员的常规能力内，参数例如为聚合物涂层、增溶剂的量和电子束辐射的剂量。

发现本发明的经改性多孔薄膜用于多种生物应用，这取决于生物分子在多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)上的固定，包括但不限于免疫检验、体外诊断试验和用于分离关注生物分子的技术。由于其固定核酸(例如，dna和rna)用于southern和northern印迹的独特能力和对氨基酸(例如，蛋白质)的结合亲和性，硝化纤维素薄膜特别用于生物技术。由于这些性质，硝化纤维素薄膜广泛在其中抗原-抗体结合提供试验结果的诊断试验(例如，家庭妊娠试验)中用作基材。

虽然未改性硝化纤维素薄膜结合生物分子(例如，高分子量核酸和蛋白质)的能力是有利的，但多孔薄膜(具体地讲，硝化纤维素薄膜)改性以促进固定生物分子(例如dna、rna和蛋白质，更具体地讲，抗体)提供超过这些生物分子结合到未改性多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)的显著优势。

在一个或多个实施方案中，第一生物分子为dna、rna或蛋白质。在一些实施方案中，第一生物分子为蛋白质或肽。蛋白质可以为生物合成蛋白质或肽。在一些其它实施方案中，肽可以为合成制备肽。在一个实施方案中，蛋白质生物分子可包括抗体。

所有抗体为蛋白质，更具体地讲，糖蛋白，并显示对关注抗原(例如，多肽的部分)的结合特异性。在活性薄膜的一些实施方案中，术语“分析物”在本文中可互换称为“抗原”。在这些实施方案中，第一生物分子为抗体，并且通过第一生物分子捕集的分析物为抗原。术语“抗体”以其最宽意义使用，包括完全组装抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，fab'、f'(ab)2、fv、单链抗体、双抗体)和包含前述的重组肽。“抗体片段”包括完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原-结合或可变区域。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段、双抗体和线性抗体(zapataetal.(1995)proteineng.8(10):10571062)、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异抗体。可在本发明实施中使用任何抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，所述方法可进一步包括测定结合到包含第一生物分子的活性多孔薄膜的分析物。分析物结合到第一生物分子在本文中也可互换称为通过结合到薄膜的第一生物分子“捕集”分析物。在这些实施方案中，通过包含一种或多种分析物的生物样品加到第一生物分子结合的基材，引发分析物结合到第一生物分子(例如抗体)。在这些实施方案中，分析物结合可进一步与分析物结合到未改性薄膜比较。

分析物结合到第一生物分子可用抗分析物检测。在一些实施方案中，抗分析物为生物分子。抗分析物可加到分析物结合的经改性多孔薄膜，其中抗分析物特异结合到分析物。在一些实施方案中，抗分析物生物分子包括dna、rna、蛋白质或肽。在一些实施方案中，抗分析物生物分子为蛋白质，例如抗体。在一个实施方案中，抗分析物生物分子为抗体，可包括单克隆抗体或多克隆抗体。

所述方法可进一步用于生物分子固定，用于检测在生物样品中存在的分析物。所述方法可允许检测生物样品的多于一种分析物。在一个示例实施方案中，分析物为抗原。

在一个或多个实施方案中，抗分析物分子可用检测分析物所用的可检测物质或检测探针标记。术语“可检测物质”和“检测探针”在下文可互换使用。在一些实施方案中，可检测物质包括酶、辅基、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、金颗粒、包含光学报道体的聚合物珠料或其组合。应提到，光学报道体可定义为包含在可见区域吸收光的染料的颗粒，例如量子点、金颗粒或炭黑。在一个或多个实施方案中，可检测物质提供分析物结合的定性评估。在一个实施方案中，抗分析物生物分子为用比色物质例如金颗粒标记的抗体。

免疫检验的示例性、非穷尽列表包括侧流检验(例如，家庭妊娠试验)、放射免疫检验(ria)、酶免疫检验(eia)、酶联免疫吸附检验(elisa)、荧光免疫检验和化学发光免疫检验。本领域技术人员具有选择和实施用于具体情况合适方法所需的技术和进行这些免疫检验的技术及解释结果的技术。根据所选择的具体检测方法，免疫检验可产生定性或定量结果。免疫检验可选自侧流免疫检验、放射免疫检验、酶免疫检验(eia)、酶联免疫吸附检验(elisa)、荧光免疫检验、化学发光免疫检验或其组合。

在一些实施方案中，所述方法用布置在固体载体上的活性多孔薄膜进行。固体载体可选自微量滴定板、皮氏板、玻片或结合到分析系统的固体载体。在一些实施方案中，固体载体为设备的部分，其中设备可以为分析设备、检测系统、便携设备、可域(fieldable)检测系统或免疫检验试剂盒的部分。

在一个或多个实施方案中，生物样品为血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘膜、身体分泌物、细胞、组织或缓冲液或盐水中的生物相关分子。生物样品可由经过自诊试验(例如，血糖监测)的个人得到，或者由通过多种技术训练的医学专业人员得到，包括例如用针抽吸血液，或者刮或擦患者皮肤上的特定区域，例如损伤。收集各种生物样品的方法在本领域熟知。

在本发明的某些方面，本文描述用于改善生物分子固定到多孔薄膜上的方法。具体地讲，在某些实施方案中，用于改善生物分子固定到多孔薄膜上的方法包括，提供包含如本文所述接枝的聚合物的经改性多孔薄膜；在第一生物分子的溶液中培养经改性多孔薄膜；洗涤多孔薄膜，以去除未结合物质，从而改善第一生物分子固定到多孔薄膜。多孔薄膜可在包含表面活性剂的水溶液中洗涤，具体地讲，非离子表面活性剂，更具体地讲，乙氧基化脱水山梨糖醇酯，例如tween-20™，以进一步使非特异结合到经改性多孔薄膜最大限度地减少。在一些实施方案中，固定到经改性多孔薄膜(具体地讲，硝化纤维素薄膜)上的生物分子为dna、rna或蛋白质(例如，抗体)。

在本文中也描述改善免疫检验灵敏度的方法，所述方法包括，提供包含本文详述的聚合物接枝(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的聚合物涂层)的经改性多孔薄膜；在特异结合到抗原的第一抗体的溶液中培养经改性多孔薄膜，从而使抗体固定到经改性多孔薄膜上，形成活性多孔薄膜；洗涤活性多孔薄膜，以去除过量未固定的抗体；用可包含分析物(例如，抗原)的生物样品培养包含经固定抗体的活性多孔薄膜，分析物通过活性多孔薄膜上的经固定抗体特异捕集；并检测由固定到活性多孔薄膜上的抗体捕集的抗原。

或者，可首先用特异结合到生物样品中存在的关注抗原的第二抗体培养生物样品，其中第二抗体缀合到可检测物质。然后，将用缀合到可检测物质的抗体预培养的生物样品施加到具有经固定第一抗体的包含例如丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的接枝聚合物的活性多孔薄膜，或用其培养。第一抗体捕集结合到第二抗体的抗原。在抗体上存在可检测物质允许检测正被分析的生物样品中的抗原。此类可检测物质包括但不限于酶、辅基、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、金颗粒、聚合物珠料、包含光学报道体的颗粒或其组合。

其中化学改性多孔薄膜(例如硝化纤维素薄膜)具有结合第一生物分子(例如dna、rna或蛋白质)改善能力的上述方法给予利用这些经改性多孔薄膜的免疫检验的多个优点。例如，增加抗体固定到经改性多孔薄膜上减小检测关注抗原存在所需的抗体的量，改善从生物样品捕集抗原，因为增加固定到经改性多孔薄膜(例如硝化纤维素薄膜)的抗体的量，导致增加结合到经固定抗体的抗原，并减小检测生物样品中生物分子存在的生物样品中抗体的量。蛋白质一般对未改性硝化纤维素薄膜具有亲和性，并固定到薄膜上，然而，与经改性(化学接枝)硝化纤维素薄膜不同，可通过洗涤从未改性薄膜去除经固定蛋白质。例如，在侧流检验期间样品通过未改性硝化纤维素薄膜时，可从薄膜洗掉经固定蛋白质。因此，第一生物分子可从未改性薄膜去除，不管其是否结合到关注分析物，导致分析物结合检验的灵敏度降低。

如所注意到，硝化纤维素薄膜用一种或多种化学部分接枝，例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、nhs-酯或这些中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，硝化纤维素薄膜用一种或多种化学部分(例如一种或多种马来酰亚胺、碘乙酰胺或nhs-酯)与环氧基组合接枝。

ftir数据(图2)显示硝化纤维素上单或双基的接枝效率。另外，在表1中提供在不同电子束辐射剂量下nhs-酯或马来酰亚胺接枝后未改性硝化纤维素薄膜(“nc”)的重量百分数增加(例如相对于未改性薄膜)。如由在去离子(di)水中可比毛细管上升时间显示，活性薄膜(经改性薄膜)显示经改性和未改性薄膜之间的流体性质不变(表2)。

用nhs-酯、马来酰亚胺或nhs-酯或马来酰亚胺与环氧化物组合接枝的经改性硝化纤维素薄膜可基于侧流检验模型中分析物的检测设计。在图3a、3b和3c中分别提供对于hcg(或hcg)、ckmb和肌钙蛋白i分析物使用未改性(nc)硝化纤维素薄膜或用马来酰亚胺、环氧化物或nhs-酯接枝的经改性硝化纤维素薄膜用侧流检验得到的结果。

用hcg作为模型生物标记分析不同样品的保存期限，例如由活性薄膜捕集的分析物。为了监测用nhs-酯、马来酰亚胺和环氧化物接枝的经改性多孔薄膜的稳定性，通过经接枝薄膜与相应未改性多孔薄膜的(图4a)比较，在制备经改性多孔薄膜后在不同时间分析试验结果。在使用用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝并老化3个月的硝化纤维素薄膜、用2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯接枝并老化6个月的硝化纤维素薄膜和用丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯接枝老化2个月的硝化纤维素薄膜(分别在图4b、4c和4d)时，观察到相同水平的性能改善。用不同hcg浓度进行试验，各活性硝化纤维素的信号强度改善总结于表7中。一般地，分析物浓度越低，信号强度改善越好，这突出在使用本文所述经改性多孔薄膜时提高的免疫检验灵敏度。分别对用2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯和丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素薄膜观察到最大5至10倍灵敏度改善。

在一些实施方案中提供一种设备，其中所述设备包括固体表面，其中所述表面可用经改性硝化纤维素基材材料涂覆。设备可进一步包括一个或多个不同部件，用于接收样品，并使样品与固定到经改性基材上的第一生物分子接触。在一些实施方案中，设备用于进一步引发结合施加到设备的样品中存在的分析物。可用设备作为侧流设备检测不同分析物。

侧流检验的性能、灵敏度和特异性用包含具有在其中接枝的聚合物的经改性多孔薄膜的侧流设备显著改善。使用包含经改性硝化纤维素薄膜的侧流设备，也降低对免疫检验得到精确试验结果所需的分析物的浓度，并减少检测分析物或生物分子存在或不存在的时间。

确定和优化合适抗体结合和检测技术是标准的，且完全在本领域技术人员的常规能力内。在本文中也提供用设备检测结合或固定到经改性薄膜(例如，聚合物接枝的硝化纤维素薄膜)上的抗体的方法。在一些实施方案中，可通过抗体偶联到可检测物质帮助检测抗体结合。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、金颗粒、聚合物珠料、包含光学报道体的颗粒及其组合。示例性合适酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；可偶联到抗体的可检测发光材料包括但不限于鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；用于检测抗体结合的合适放射性材料的实例包括125i、131i、35s或3h。

可使包含例如包含nhs-酯化合物的聚合物接枝的经改性多孔薄膜进一步改性，以包含固定到多孔薄膜上的亲水化合物。亲水化合物引入到包含聚合物接枝的经改性多孔薄膜上可作为阻断剂，以减少非特异背景结合到多孔薄膜(例如，硝化纤维素薄膜)。在一些实施方案中，最大限度减少分子非特异结合到经改性多孔薄膜改善信号:噪声比，例如在免疫检验中。在这些实施方案中，免疫检验基于薄膜上固定的抗体和关于这种生物分子存在或量分析的样品中存在的关注特异生物分子(例如，蛋白质)的特异相互作用。

经改性多孔薄膜可用于多种免疫检验，包括用于药物试验、激素、多种疾病相关蛋白、肿瘤蛋白标记和用于心脏损伤的蛋白标记的那些检验。设备也可用于免疫检验，以检测传染剂上的抗原，例如嗜血杆菌(hemophilus)、隐球菌(cryptococcus)、链球菌(streptococcus)、乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)、hiv、莱姆病(lymedisease)和沙眼衣原体(chlamydiatrichomatis)。这些免疫检验试验常用于确定具有这些和其它疾病的患者。因此，改善免疫检验中灵敏度、特异性和检测限度的组合物和方法在诊断医学领域中非常重要。包含经改性多孔薄膜的设备可用于免疫检验、体外诊断试验(例如，定点护理诊断应用)和用于分离生物样品中关注生物分子的技术。

提供以下实施例作为说明性，而不作为限制性。

实施例

实施例1：不同官能团接枝到硝化纤维素薄膜上

制备经改性多孔硝化纤维素薄膜(如图1中所示)包括：1)制备包含甲基丙烯酸酯/丙烯酸酯单体的涂覆溶液；2)在涂覆溶液中浸涂硝化纤维素；3)使经涂覆薄膜暴露于电子束照射(例如，10kgy)，以引发聚合，使聚合物接枝到硝化纤维素薄膜上；4)在水中洗涤薄膜，以去除增溶剂和未接枝物质；5)为了较佳流体性质用低浓度表面活性剂重整薄膜；和6)干燥。

制备涂覆溶液–在制剂中使用tween20，以提高单体在水中的溶解度，并改善薄膜的接枝效率。以下为对各薄膜制剂制备100ml涂覆溶液的实例：

为了制备nhs-酯接枝硝化纤维素薄膜(nc-nhs-酯)，制备100ml1:1tween20/水溶液，随后溶解4克丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。为了制备马来酰亚胺接枝硝化纤维素(nc-mal)薄膜，制备100ml1:1tween20/水溶液，随后溶解2克丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯。为了制备环氧化物接枝硝化纤维素薄膜，以3:12:85体积比混合2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯、tween20和水。

浸涂–将硝化纤维素薄膜浸入涂覆溶液，以使孔完全饱和，随后进行任选步骤，用橡胶刀片去除薄膜顶上的残余液体，如果在涂料中存在50%tween20。

电子束照射–使用实验室规模电子束照射单元(aeb,advancedelectronbeam,电子束单元,eblab-150)，利用125kv工作电压，和10kgy电子剂量递送，这足以使部分接枝到硝化纤维素薄膜，同时使硝化纤维素自由基降解最大限度地减少。

洗涤–分别在室温经30分钟用去离子水洗涤经接枝硝化纤维素薄膜三(3)次，以去除tween20和未接枝物质。

重整–为了得到良好表面性质和毛细管上升特性，在室温用表面活性剂水溶液处理经改性薄膜。

干燥经接枝薄膜–在50℃和25mmhg下干燥硝化纤维素薄膜过夜，随后进行化学物理表征。或者，在环境温度和大气压力干燥经改性多孔硝化纤维素薄膜过夜。

在某些实验中，首先使硝化纤维素薄膜暴露于电子束辐射，然后浸入涂覆水溶液。

在表1中提供相对于未改性薄膜用nhs-酯、马来酰亚胺或环氧基接枝的未改性ff80hp硝化纤维素薄膜(“nc”)(购自gehealthcare)的重量百分数增加。重量增加视情况表示为相对于未改性硝化纤维素薄膜的重量百分数增加。

表1：在用不同涂覆材料接枝后硝化纤维素薄膜的重量增加

在以上所述接枝过程后重量增加证明在硝化纤维素薄膜上成功引入马来酰亚胺、nhs-酯或环氧化物。

为了进一步证明在多孔薄膜上成功接枝，使用perkinelmerspectrum100ftir分光光度计(perkinelmerlifeandanalyticalsciences,sheraton,ct)，通过atrft-ir分析硝化纤维素薄膜。在atr-ftir中(如图2中所示)，在光谱上通过在约1730cm^-1羰基拉伸表明由于改性在硝化纤维素上产生新羧基。为了分析化学接枝和接枝均匀性，计算该峰高与硝化纤维素硝基峰之一1640cm^-1之比。

实施例2：用nhs-酯、马来酰亚胺或环氧化物或其组合接枝的经改性硝化纤维素薄膜的性质

进一步表征用上述丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯或2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯接枝的经改性硝化纤维素薄膜，以评价薄膜厚度、毛细管上升和机械强度(例如，应力和应变)。经改性硝化纤维素薄膜如实施例1中所述接枝。

使用ontariodie10mm用50mm切口冲从未改性硝化纤维素薄膜和用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯或2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯接枝的经改性硝化纤维素薄膜切割试条，试验毛细管上升。将试条放入设备，以保持薄膜试条垂直。设备也具有浅槽保持试验流体(例如，蒸馏水)。记录100μl蒸馏水到在40mm高度切口的上升时间。测量未改性和经改性硝化纤维素薄膜的重复样品的毛细管上升。也测定hcg半棒(halfstick)试验中的检验时间。在hcg半棒试验中，将包含靶分析物的总共100μl流动缓冲液施加到棒，并流动通过半棒设备，设备包括硝化纤维素薄膜和吸收垫二者。结果总结于以下表2中。

表2：用马来酰亚胺、环氧化物和/或nhs-酯接枝的经改性ff80hp硝化纤维素薄膜的表征

实施例3：经改性薄膜的高通量筛选

为了跨一组候选捕集抗体快速筛选薄膜改性，进行高通量筛选实验。改性和性能试验在96孔真空歧管(s&smanifoldi)中进行。各孔代表不同改性组合，还包含抗体。为了改性，将无背衬硝化纤维素(ae98,gehealthcare)夹在歧管顶层和底层之间适当的位置，随后加入含有包含马来酰亚胺(m1)、碘乙酰胺(m2)、环氧化物(m3)、溴化物(m4)、nhs-酯(m5)、马来酸酐(m6)或任何两种上述官能团组合的官能团的电子束反应性单体的各种水溶液。薄膜改性所用不同官能部分显示于表3中。然后在96孔歧管中电子束处理薄膜，随后在水中彻底洗涤，以去除未反应物质和增溶剂。

表3：薄膜改性所用不同官能部分和不同实例

为了试验结合不同抗体中各改性方案的官能团，将经改性薄膜在室中放在bio-rad#170-3955印迹纸层上，并在96孔歧管中反夹，使得孔与薄膜的经处理区域对准。以2.8μg/μl浓度制备hcg、肌钙蛋白i或ck-mb抗体(关于这些抗体来源，见表5)。利用关于侧流检验试条所用的相同喷墨分配制剂(“油墨”)(30%甘油、0.1%tritonx-100、0.3%羧甲基纤维素(cmc))。向各孔加入2μl油墨溶液，例如对于试验孔加入具有抗体的检验混合物，对于对照孔加入没有抗体的检验混合物。使薄膜在室温干燥48-72小时，以允许在足够时间内捕集抗体，促进结合。为了减少非特异结合，各孔随后用包含1%bsa的200μl侧流检验(lfa)缓冲液处理2小时，然后用真空去除。

通过hcg、肌钙蛋白i和ck-mb靶蛋白与过量合适荧光标记检测抗体(根据制造商说明书用geamershamfluorolinkcy5标记试剂盒制备)混合，确定薄膜处理对检验性能的效果。将抗体-靶混合物(100μl)加到孔，并放在定轨摇床上15分钟。然后，在真空下，通过用pbst缓冲液洗涤去除未结合标记和靶分子。然后从真空装置移出薄膜，在pbst缓冲液中洗涤2h，在定轨摇床上避光，然后在getyphoon9400荧光扫描仪上成像。然后用imagej软件(来自nih的免费软件)分析来自各孔的信号强度，以便可能计算来自经处理和未处理薄膜的信号比。显示各改性方案的结合单独抗体改善的数据总结于表4中。概括地讲，在官能团组中，在硝化纤维素薄膜表面上存在它们时，nhs-酯、环氧化物和马来酰亚胺显示跨抗体优良的结合性能。因此，对于侧流免疫检验性能评价，选择以上化学物质用于薄膜接枝。

表4：96-孔板薄膜改性和抗体结合试验性能

实施例4：经改性硝化纤维素薄膜用于侧流检验的用途

需要在固相材料上固定蛋白质(更具体地讲，抗体)的侧流检验形成许多体外诊断试验的基础。这种技术的一个一般实例为依赖固定抗体的商业可行家庭妊娠试验，抗体识别人绒毛膜促性腺激素，一种在妊娠期间高水平产生的激素。基于妊娠试验模型设计在侧流检验中评价用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯或2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯接枝的经改性ff80hp硝化纤维素薄膜效用的技术。试验相对于ff80hp作为对照样品的基线性能归一化。

根据在本领域的标准技术，通过在dimatixdmp-2800压电喷墨印刷机上喷墨印刷，在未改性或用nhs-酯、马来酰亚胺或环氧化物接枝的经改性ff80hp硝化纤维素薄膜上产生对照和试验线。用包含甘油、tritonx-100和cmc的基础喷墨制剂制备还包含1.2mg/ml山羊抗小鼠igg的对照线。试验线油墨包含1mg/ml抗hcg、ck-mb或肌钙蛋白i的一级抗体(关于抗体列表，见表5)。

将与抗-hcg-β缀合的金颗粒(购自abcam)用于hcg侧流试验。由40nm金颗粒(dcn#cg020)的溶液制备与抗肌钙蛋白i或抗ckmb缀合的金纳米颗粒。将1.0ml金颗粒溶液加到三个不同1.5mleppendorf管，并将3μl0.2mk2co3加到各管，混合，并使其静置10分钟。向各管加入选择的14μg/ml肌钙蛋白i或ckmb抗体，混合10分钟，随后加入100μl在pbs中的10%bsa，并混合10分钟。通过在5,000xg离心20分钟使金颗粒成丸料。在弃去上清液后，使丸料重新悬浮于15μl0.1%bsa。合并重新悬浮的丸料，用160μl缀合物溶液(缀合物溶液：3%海藻糖+0.5%bsa+1.0%tween20(在10mmpbs中))洗涤管。

表5：用于免疫检验的抗体

在用gl187胶预处理的g&l聚酯背衬上层压用抗体印刷的硝化纤维素，随后在顶上层压27mmwhatmancf7吸附垫。然后，用截切机将半棒垫切成5mm长度运行条。通过将半棒条放入包含各种hcg(sigmaaldrich)、肌钙蛋白i(fitzgeraldcat.#30-at63)或ckmb(fitzgeraldcat#30-ac67)浓度、0.5%tween20作为阻断分子和抗hcg、ck-mb或肌钙蛋白i(关于抗体列表，见表5)靶向的金-抗体缀合物的100μllfa流动缓冲液，进行分析。在30分钟后完成检验，对试条拍照，并用imagej分析线强度。通过imagej分析评价比色报道信号强度，以得到定量比较。在定量过程中，通过光学扫描仪得到侧流条图像，然后用imagej从图像分离出绿色通道，随后在灰色标度上跨整个条绘制强度。通过在各条上从试验线减去背景信号，使在试验线的信号强度归一化。使用未改性ff80hpnc或用丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯或nc-马来酰亚胺、2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯或nc-环氧化物或丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯或nc-nhs-酯接枝的经改性硝化纤维素薄膜，关于hcg(1000miu/ml)、ckmb(130ng/反应)和肌钙蛋白i(210ng/反应)用侧流检验得到的结果提供于图3a、3b和3c中。

在用未改性硝化纤维素薄膜进行的检验中在约3-5分钟内和在用经改性硝化纤维素薄膜的那些检验中只在约1分钟内，比色报道信号是可见的。在检验时间范围，在未改性硝化纤维素薄膜和经改性硝化纤维素薄膜之间观察不到背景信号差异。

跨不同分析物和分析物浓度证明活性ff80hp硝化纤维素薄膜的性能。对于试验的所有三种分析物，经证明，所有三种活性薄膜均有明显性能改善，例如，在妊娠试验中在1000miu/mlhcg浓度下(图3a)，在ck-mb试验中在130ng/反应下(图3b)，和在肌钙蛋白i试验中在220ng/rxn下(图3c)，与nc-环氧化物比较，对nc-nhs-酯和nc马来酰亚胺接枝薄膜二者均观察到显著改善。不同活性薄膜改善侧流信号强度的能力作为分析物和分析物浓度二者的函数总结于表6中，表6清楚地显示通过活性硝化纤维素薄膜在灵敏度和检测限度二者的试验性能改善超过未改性硝化纤维素薄膜。

表6.活性薄膜在lfa中跨分析物相对于未改性硝化纤维素(ff80hp)的性能改善

nc-环氧化物、nc-nhs-酯和nc-马来酰亚胺在室温下用50%相对湿度储存。为了监测与对照(图4a)比较使用nc-环氧化物、nc-nhs-酯和nc-马来酰亚胺(分别为图4b、4c和4d)这些样品的保存期限，在不同时间分析在hcg试验中经老化样品的性能。图4a、4b、4c和4d中带的信号强度用imagej分析检测，分别图示说明于图4e、4f、4g和4h的曲线图中。观察到相同水平性能改善，例如，在nc-nhs-酯老化3个月时(图4b和4e)，nc-环氧化物老化3个月时(图4c和4f)，nc-马来酰亚胺老化1.5个月时(图4d和4g)。图4a、4b、4c和4d分别显示关于未改性ff80hpnc、nc-nhs-酯、nc-环氧化物和nc-马来酰亚胺的老化天数(也在以下表7中提到)。试验在不同hcg浓度下进行，各活性硝化纤维素的信号强度改善总结于表7中。

表7.在hcg试验中经老化活性ff80hp薄膜的性能改善

实施例6：作为薄膜上nhs-酯水平的函数的hcg试验性能

通过调节接枝涂料制剂中的单体浓度，用nc薄膜上不同nhs-酯接枝水平制备nc-nhs-酯薄膜。为了确定对侧流提供最大效率的nhs-酯接枝浓度，在nc薄膜上不同nhs-酯接枝浓度分析hcg试验性能。使用包含0.5%tween20和0.15mg/ml金-抗-hcg-β的100µl流动缓冲液pbs，在1000miu/mlhcg测定hcg试验性能。

hcg试验性能的结果显示于图5中，其中用低(50μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜)、最佳(300μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜)和高(450μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜)浓度的丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(在图5中提到，ff80hp-nhs酯)接枝的硝化纤维素薄膜与未改性硝化纤维素(ff80hp)比较。在接枝的丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的最佳浓度观察到性能改善(图5)。硝化纤维素上高浓度接枝的丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯引起非特异结合，导致高背景信号和低信号:噪声。

在侧流检验中，在高背景信号存在下观察到对于nhs-酯接枝薄膜高于最大接枝水平的降低的侧流性能(图5)。对于用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素，用小于约350μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜，hcg侧流试验性能改善。与未改性ff80hp硝化纤维素比较，在减去背景信号后(见图6)，如通过试验线强度定量，大于约450μmolnhs-酯接枝/克硝化纤维素薄膜导致减小的hcg试验性能增强。

图6显示在三种不同hcg浓度下用nhs-酯接枝的硝化纤维素和相应未改性薄膜的背景校正试验线强度比作为在薄膜上接枝的nhs-酯的量的函数。在使用较低分析物(hcg)浓度时，与未改性硝化纤维素比较，除了在大于约450μmol/g硝化纤维素下nhs-酯浓度改善损失外，性能改善更大。这证明经改性薄膜改善灵敏度的事实。

如下测定接枝到硝化纤维素薄膜上的nhs-酯官能团的量。将h2o(1ml/10mg具有背衬的经改性硝化纤维素薄膜)加到2打兰玻璃瓶中用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯接枝的硝化纤维素薄膜的大体积片。然后在定轨摇床上在100rpm下使瓶旋流40min。一旦旋流完成，去除h2o，并将等体积0.1mnh4oh加到玻璃瓶中的薄膜。再次在定轨摇床上在100rpm下使瓶旋流40min。一旦旋流完成，在260nm下测定由于薄膜接枝nhs-酯水解产生的2,5-二氧代吡咯烷-1-醇铵的吸光度，并用9297m^-1cm^-1摩尔吸收系数转化成浓度。假定具有背衬体的经改性多孔薄膜的80%来自背衬，其余20%来自经改性硝化纤维素薄膜，使浓度转化成μmolnhs-酯/gnc。

实施例7：丙烯酸接枝硝化纤维素(nc-aa)薄膜用于侧流检验

在nc上接枝的nhs-酯(例如，丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)降解使硝化纤维素(nc-aa)上的丙烯酸接枝携带-coo基团。通过ff80hpnc浸入丙烯酸水溶液，随后电子束照射，洗涤并干燥，制备丙烯酸接枝ff80hp硝化纤维素或nc-aa薄膜。通过使具有山羊抗小鼠igg的nc或nc-aa成条，随后在包含0.5%tween20和0.15mg/ml金-小鼠-抗-hcg-β的100µlpbs缓冲液中运行，测定侧流检验试验性能。图7a和7b分别显示在开始侧流(t=0)后在2min(t=2min)和20min(t=20min)后测定的侧流检验条。nc-aa上的负电荷阻止金-抗-hcg-β顺利流动通过，导致金颗粒在薄膜上聚集(如图7b中所示)。虽然在未改性ff80hpnc上，金-抗-hcg-β仍能够流动通过，并由经成条的山羊抗小鼠igg线捕集。带电荷表面和抗体之间的静电相互作用阻止金缀合物适当通过薄膜，这显示于图7a和7b中。

实施例8：超过市售产品的经改性薄膜的性能

在基于妊娠试验模型设计的侧流检验中用丙烯酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、丙烯酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酯接枝的经改性ff80hp硝化纤维素薄膜和用2-甲基丙-2-烯酸环氧乙烷-2-基甲酯接枝的薄膜评价超过市售产品的经改性薄膜的性能。试验相对于ff80hp作为对照样品的基线性能归一化。根据在本领域的标准技术，通过在dimatixdmp-2800压电喷墨印刷机上喷墨印刷，在未改性、经改性硝化纤维素薄膜和市售薄膜上产生对照(c)和试验线(t)。用包含甘油、tritonx-100和cmc的基础喷墨制剂制备还包含1.2mg/ml山羊抗小鼠igg的对照线。试验线油墨包含1mg/ml抗hcg的一级抗体。所述方法与以上实施例4中所述相同。通过使具有相同试验或对照线抗体密度的不同薄膜成条，测定使用侧流检验的半棒中hcg试验性能。用薄膜条运行包含0.5%tween20、0.15mg/ml金-标记-抗-小鼠hcg-β和1000miu/mlhcg的100µlpbs缓冲液。

然后将经改性硝化纤维素薄膜的性能与较宽范围的市售产品比较，如图8a和8b中所示。例如，在图8a中，将经改性硝化纤维素薄膜的性能与具有可比流动性质称为cp的市售薄膜(市售产品)和来自gehealthcare称为ff120hp和ff80hp的两种不同级薄膜比较。带的信号强度用imagej分析检测，并图示说明于图8b中。如图8a和8b中所示，用环氧化物或nhs-酯基官能化的两种硝化纤维素薄膜均能够与未改性硝化纤维素薄膜比较在1000miu/mlhcg下改善hcg试验信号强度。数据(图8a和8b)证明以下事实：通过聚合物接枝薄膜改性提高抗体在薄膜上的固定效率，这进一步提高侧流免疫检验性能。