一种接枝视黄醇聚合物及采用其作为载体的喜树碱化合物的制作方法

本发明涉及药物领域，具体涉及一种接枝视黄醇聚合物及采用其作为载体的喜树碱化合物、制备方法及其应用。

背景技术：

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活和大量扩增在肝纤维化发生过程中占有非常重要的地位；通过抑制炎症反应、对抗氧化应激、调节相关细胞因子的活性、干扰细胞因子信号传导等途径抑制HSC的增殖、活化和诱导其凋亡已经成为治疗肝纤维化的重要手段；目前相继有人尝试使用紫杉醇、姜黄素、NO类等药物来抑制活化态HSC的增殖和ECM的沉积；HSC的激活和活化表型的维持需要旺盛的糖酵解代谢活动，抑制糖酵解代谢活动可以促使活化态HSC从肌成纤维母细胞(Myofibroblastic,MF)表型向静息态表型逆转；因此，本发明使用我国特有药物喜树碱来抑制糖酵解途径关键调控蛋白缺氧因子(hypoxia-inducible-factor 1-alpha,HIF-1-α)的蛋白水平和活性、从而抑制其下游糖酵解途径相关基因的表达和MF表型相关蛋白的表达；但是喜树碱难溶于水、毒副作用大；若制成盐则活性降低，进入体内又易为体循环系统清除；因此它在临床中的应用受到很大限制。

技术实现要素：

本发明提供一种对HSC具有特异性靶向作用，并可以减轻喜树碱对肝细胞等其它肝脏细胞和组织器官的非特异性毒副作用的采用接枝视黄醇聚合物纳米载体的喜树碱胶束、制备方法及其应用。

本发明采用的技术方案是：一种接枝视黄醇聚合物，化学结构式如下：

式中，n＝20，m＝40-44。

采用接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物为接枝视黄醇聚合物物理包裹喜树碱组成。

采用接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将喜树碱与接枝视黄醇聚合物按质量比为1:5、1:10或1:20的比例溶于二甲基亚砜；

(2)将步骤(1)中得到的溶液放入透析袋中，透析48h后，将收集得到的胶束溶液冷冻干燥后得到所需要的化合物；其中透析袋截留分子量为3500。

接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物可以降低纤维化肝组织中蛋白缺氧因子HIF-1-α的表达。

接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物可以降低纤维化肝组织中糖酵解途径限速酶基因的表达。

接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物可以降低纤维化肝组织中肌成纤维母细胞性标记基因的表达。

接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物能够作为促使活化态肝星状细胞向静息态表型的逆转的靶向性药物。

接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物能够作为抑制肝纤维化的发生发展的靶向性药物。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用的载体由双亲性嵌段聚合物形成，可以降低喜树碱对肝脏细胞的毒副作用；

(2)本发明采用视黄醇修饰的载体，利用配体受体间特异性识别和结合实现对HSC的主动靶向作用；

(3)本发明的接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物能延长其体循环时间、提高其在纤维化肝脏中的富集和对HSC的特异性靶向作用和降低使用剂量，并减少毒副作用；通过促使活化态HSC向静息态表型的逆转，具有温和安全而有效的效果。

附图说明

图1本发明中PEG-PCL核磁¹H-NMR图谱。

图2为本发明中VA-PEG-PCL核磁¹H-NMR图谱。

图3为本发明中PEG-PCL和VA-PEG-PCL的TEM和粒径表征。

图4为大鼠原代活化态HSC细胞对本发明中PEG-PCL和VA-PEG-PCL装载尼罗红摄取行为荧光照片。

图5为大鼠原代活化态HC细胞对本发明中PEG-PCL和VA-PEG-PCL装载尼罗红摄取行为荧光照片。

图6为本发明中PEG-PCL和VA-PEG-PCL载尼罗红胶束的组织分布。

图7为本发明中慢性纤维化小鼠血清中ALT和AST水平变化。

图8为本发明中慢性纤维化小鼠肝组织切片HE染色结果。

图9为本发明对慢性纤维化小鼠肝组织切片Sirius Red染色结果。

图10为本发明对慢性纤维化小鼠肝组织中基因水平影响。

图11为本发明对慢性纤维化小鼠肝组织中蛋白表达影响。

图12为Western Blot结果定量分析。

图13为本发明对慢性肝纤维化小鼠肝组织切片免疫组化(PKM2)。

图14为本发明对慢性肝纤维化小鼠肝组织切片免疫组化(α-SMA)。

图15为本发明中VA-PEG-PCL制备流程图。

具体实施方式

一种接枝视黄醇聚合物，化学结构式如下：

式中，n＝20，m＝40-44。

作为载体使用时，需制备成纳米胶束，纳米胶束颗粒为球形，粒径的平均值为102nm；上述载体中亲水段材料为聚乙二醇，其分子量为1800～2200，疏水段材料为聚已内脂，其分子量为3921～4570；接枝视黄醇聚合物为双亲性嵌段聚合物，本发明中采用聚乙二醇和聚已内脂，不限于上述两种物质；可以是任何可药用的两嵌段聚合物胶束材料，这些载体材料包括但不限于，PEG、PEO、PVP、PEI和PLA。

采用接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物，所述化合物为接枝视黄醇聚合物物理包裹喜树碱组成。

一种采用接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将喜树碱与接枝视黄醇聚合物按质量比为1:5、1:10或1:20的比例溶于二甲基亚砜；

(2)将步骤(1)中得到的溶液放入透析袋中，透析48h后，将收集得到的胶束溶液冷冻干燥后得到所需要的化合物；其中透析袋截留分子量为3500。

一种接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的应用，所述胶束可以降低纤维化肝组织中蛋白缺氧因子HIF-1-α的表达。

一种接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的应用，所述胶束可以降低纤维化肝组织中糖酵解途径限速酶基因的表达。

一种接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的应用，所述胶束可以降低纤维化肝组织中肌成纤维母细胞性标记基因的表达。

一种接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的应用，所述胶束能够作为促使活化态肝星状细胞向静息态表型的逆转的靶向性药物。

一种接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱化合物的应用，所述化合物能够作为有效抑制肝纤维化的靶向性药物。

试验中用到的纳米胶束载体材料VA-PEG-PCL和PEG-PCL制备方法如下：

(1)双端羧基化的聚乙二醇(COOH-PEG-COOH)的制备

将聚乙二醇PEG2000、丁二酸酐、氯仿混合，油浴加热至60度反应12h。得到双端羧基化的聚乙二醇(COOH-PEG-COOH)，保存至真空干燥箱；

(2)单端接枝视黄醇VA的聚乙二醇(VA-PEG-COOH)的制备

将视黄醇，双羧基化的COOH-PEG-COOH按投料比1:1称量，COOH-PEG-COOH加入适量4-二甲氨基吡啶DMAP及1-(3-二甲基胺丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC，溶于二甲基亚砜DMSO，视黄醇VA充分溶于DMSO，在氩气保护下避光反应。反应结束后将反应物转移至MW3500的透析袋中透析，每2h换水一次，透析48h后进行冻干；

(3)二碳酸二叔丁酯保护的聚己内酯(Boc-PCL)的制备

称取N-叔丁氧羰基乙二胺、蒸馏纯化的己内酯单体、氯化亚锡置于单颈瓶中，置于40度水浴锅中加热搅拌并抽真空7h,达到真空度后置于140度烘箱反应7h；反应结束后向反应液中加入冰乙醇沉淀、搅拌、过滤、旋干，真空干燥得到N-叔丁氧羰基乙二胺聚己内酯(Boc-PCL)；

(4)单端氨基化聚己内酯(NH₂-PCL)的制备

称取N-叔丁氧羰基己内酯溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸并搅拌3h,旋蒸除去三氟乙酸，加饱和碳酸氢钠水调至pH为中性，去离子水使三氟乙酸尽可能除去，真空干燥得到单端氨基化聚己内酯(NH₂-PCL)；

(5)偶联视黄醇的聚乙二醇—聚己内酯(VA-PEG-PCL)的制备

称取NH2-PCL、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC.HCL、N-N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于DMSO，滴加少量三乙醇胺TEA，充分溶解混匀，其后向其中加入VA-PEG-COOH，在氩气保护下避光反应72h；其后将产物置于透析袋中(MW＝3500)中避光透析48h，冷冻干燥得到白色固体VA-PEG-PCL。

(6)聚乙二醇—聚己内酯(PEG-PCL)的制备

称取NH2-PCL、EDC.HCL、NHS溶于DMSO，充分溶解混匀2h，随后向其中加入COOH-PEG-COOH，避光反应72h。其后将产物置于透析袋中(MW＝3500)中避光透析48h，冷冻干燥得到PEG-PCL。

对制备的PEG-PCL和VA-PEG-PCL纳米胶束材料采用1H-NMR分析，将适量待测样品溶于氘代氯仿中，以四甲基硅烷为内标，通过核磁共振谱仪检测各样品中氢质子的位移，核磁测试结果见图1(PEG-PCL)及图2(VA-PEG-PCL)；通过核磁图分析可知，产物为PEG-PCL及VA-PEG-PCL，经过积分面积计算可得VA-PEG-PCL中VA的接枝率为91.7％。

聚合物纳米胶束的制备

称去5mg的VA-PEG-PCL完全溶解于5mL的二甲基亚砜中，利用注射器将其缓慢滴加至适量搅拌速度的去离子水中，然后转移至透析袋(MW＝3500)透析48h，备用；PEG-PCL纳米胶束的制备方法如上；相关形貌、粒径见图3.合成的聚合物所制备的胶束形貌为球形，PEG-PCL及VA-PEG-PCL粒径分别为107nm和103nm，分布较窄。

聚合物纳米喜树碱及载荧光分子尼罗红胶束的制备

将喜树碱与VA-PEG-PCL按分别1:5、1:10、1:20比例充分搅拌溶解于二甲基亚砜，随后转移至透析袋(MW3500)中，置于去离子水避光48h以上出去未包封的喜树碱，其后收集胶束溶液冷冻干燥，得到胶束冻干粉末避光保存于4℃；聚合物载荧光分子尼罗红胶束的制备方法和聚合物纳米喜树碱胶束制备方法相同；通过优化投料比，制备的胶束最大包封量为2.857％，包封率28.57％。

本发明采用CCl₄对小鼠腹腔一周两次重复注射以诱导肝纤维化发生，同时通过一周两次尾静脉注射对小鼠分别给予喜树碱裸药、PEG-PCL胶束载送的喜树碱药剂和视黄醇配体修饰的PEG-PCL纳米胶束载体包裹的喜树碱药剂；实验持续进行6周，采用细胞分子生物学、组化和组织免疫化学等手段对实验组小鼠进行检测。

实施例一 接枝视黄醇聚合物胶束的体外靶向性实验

采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞(HSC)及肝细胞(HC)接种于24孔板上，采用高糖DMEM培养基(含15％-20％FBS，1％双抗P/S)置于37℃，5％CO₂细胞孵箱中培养；待HC生长2天、HSC生长7天后，加入包覆尼罗红聚合物纳米胶束继续培养2h，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗两次，加入2.5％的戊二醛固定0.5h，PBS洗两次，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(1:600，V/V)约5min，再吸弃DAPI，清洗两次后加适量PBS避光保存，利用荧光显微镜观察HSC细胞及HC细胞摄取包覆尼罗红的视黄醇靶向纳米胶束(VA-PEG-PCL)及包覆尼罗红的无靶向纳米胶束(PEG-PCL)荧光分布，荧光照片结果如图4和图5；荧光分布检测所用仪器为TS100倒置荧光相差显微镜，Nikon，Japan。

图4显示了载尼罗红胶束同原代大鼠HSC细胞共孵育后细胞对尼罗红的摄取情形；可以明显看到，靶向性VA-PEG-PCL尼罗红纳米胶束所产生的荧光强度显著高于较无靶向性的PEG-PCL尼罗红胶束，表明接枝VA配体可显著增强HSC细胞对胶束的摄取；与此不同的是，VA配体的接枝并不增强肝细胞对胶束的摄取；如图5所示，两种聚合物所制备的装载尼罗红纳米胶束在原代肝细胞中所产生的荧光强度并无明显差异；这一结果显示视黄醇靶向纳米胶束对原代大鼠活化态肝星状细胞而非肝细胞具有特异性靶向。

实施例二 接枝视黄醇聚合物胶束在小鼠体内的靶向性实验

取16只小鼠，每组8只随机分成2组；通过腹腔分别向小鼠体内注射橄榄油(对照组)或20％CCl₄-橄榄油(剂量2ml/kg)进行急性肝损伤；给药两日后，将各组动物再随机均分成2组，通过尾静脉向小鼠体内分别注射载尼罗红VA-PEG-PCL和PEG-PCL胶束溶液；三小时后杀死小鼠，收集各小鼠心、肝、脾、肺、肾脏组织，匀浆后检测组织样品中尼罗红的荧光强度以分析胶束药物在体内的生物性分布情形，结果如图6所示。

用到的小鼠为SPF级别雄性ICR小鼠，体重20-25g，由成都市达硕动物有限公司提供；CCl₄为Sigma Aldrich产品，实验对照用橄榄油为Aladdin(上海)公司药用级橄榄油。

如图6所示，载尼罗红的VA-PEG-PCL胶束组和PEG-PCL胶束组在正常组和CCl₄处理组小鼠的心肺肝脾肾几大脏器均有分布，其中在肝脏中的尼罗红的信号最强，其次是在肾脏，而在其它几大主要器官中的荧光信号差异不大，表明静脉注射的胶束材料主要进入肝肾；除此之外，在正常组小鼠各检测脏器中两组胶束材料的分布均未呈现显著性差异；在CCl₄处理组小鼠的心肺脾中，两组材料的分布几乎维持不变；然而，在处理组小鼠的肝肾中，尽管PEG-PCL组胶束材料的分布较在正常组小鼠肝肾中的分布未有明显变化，靶向性VA-PEG-PCL胶束材料在肝脏中的荧光强度却显著增高，高出非靶向性PEG-PCL胶束组一倍多；靶向性载体材料在处理组小鼠肾脏中的分布也有较小幅度的的增高；考虑到一次性CCl₄注射引起的急性肝脏损伤的显著特征就是静息态的HSC被激活而迅速增殖扩展，说明VA-PEG-PCL胶束材料的确可在体内有效地靶向活化的HSC，进一步确保其所载送的药物在纤维化肝脏中的定向和富集。

实施例三 采用接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱胶束对慢性纤维化小鼠的治疗实验

取20只体重20-25g健康小鼠，每4只一组随机分成5组；一组动物腹腔注射橄榄油作为正常组，其余四组小鼠腹腔注射20％CCl₄-橄榄油(2ml/kg)，每周注射两次，持续共6周，诱导小鼠慢性肝纤维化发生；所有动物于川大华西医院动物实验中心SPF级别动物房饲养。

所用小鼠为SPF级别雄性ICR小鼠，由成都市达硕动物有限公司提供；CCl₄为Sigma Aldrich产品，实验对照用橄榄油为Aladdin(上海)公司药用级橄榄油。

造模第三天开始通过尾静脉向小鼠注射药剂；五组小鼠的注射分别为：正常组注射PBS，CCl₄模型组注射PBS，其它三组分别注射喜树碱、PEG-PCL装载的喜树碱和接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱(氯化聚醚剂量1mg/kg)；每次CCl₄注射后第三天进行尾静脉注射，持续6周，末次注射后第三天，摘除眼球取血，室温静置20min后离心收集血清备用；随后剖取肝脏，迅速切取部分肝组织块于10％福尔马林液中浸泡固定48h以作后期石蜡包埋和组织切片，以备组化和免疫组化分析；将剩余肝组织切块，在液氮中速冻后迅速转移至-80℃冻存。

取冻存的血清，通过生化测试分别检查血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的酶活水平；如图7所示，CCl₄处理后ALT和AST两种酶在血清中的水平分别升高了43倍及10倍；静脉注射喜树碱、PEG-PCL装载的喜树碱二者的水平略有降低但不显著；而注射接枝视黄醇聚合物作为载体的喜树碱后，二者的水平显著下降，高出正常组5.8倍及1.3倍，说明肝脏的功能得到很好的恢复；检测酶活性水平采用ELX800酶标仪，Biotek，USA。

取石蜡切片进行常规的HE染色和Sirius Red染色，然后在显微镜下检查肝脏组织损伤修复情形和纤维化程度；图8和9分别为肝组织切片的HE染色和Sirius Red染色结果；与正常组比较，肝纤维化模型组小鼠肝脏中可看到明显坏死的肝组织，大量的炎性细胞浸润受损部位，肝脏组织结构均有不同程度的破坏；Sirius Red染色也显示，模型组小鼠肝脏中在汇管区、中央静脉、门静脉区均有较大程度的纤维组织增生、肝脏实质结构开始被间隔、假小叶逐渐形成，显示慢性肝纤维化造模成功；肝脏的这些纤维化结构特征在注射喜树碱和PEG-PCL装载的喜树碱后几乎未有改善，只有在注射VA-PEG-PCL载送的喜树碱后才被显著减轻；肝脏中中央静脉及门静脉区仅有少量纤维束放散延伸，单无纤维间隔形成，肝小叶结构大部分保存；这些结果充分说明本发明的VA配体介导的靶向HSC的喜树碱可以对CCl₄诱导的小鼠肝纤维化疾病进行有效治疗。

取小块冻存肝组织进行匀浆、分别制备总RNA和总蛋白，然后进行定时荧光定量QRT-PCR和蛋白质印迹法Western Blot实验分别分析肝组织中基因的RNA和蛋白表达水平。石蜡切片常规脱蜡、水化和内源性过氧化酶灭活；随后置于pH6.0的0.01mol/L柠檬酸钠盐缓冲溶液中加热进行抗原修复，以DAKO protein-free blocking reagent进行封闭；随后分别和PKM2一抗(1:1000稀释)、α-SMA一抗(1：500稀释)和相应等量的I型collagen进行4℃孵育过夜，漂洗后进一步和耦合HRP的抗兔IgG二抗(DAKO)在室温孵育1h；漂洗后以DAB⁺(DAKO)显色、苏木精复染、脱水、透明和封片，最后进行显微镜观察；QRT-PCR实验采用CFX96QRT-PCR仪，Bio-Rad，USA；Western Blot实验采用Power Pac电泳仪，Bio-Rad，USA；α-SMA单克隆抗体为Abcam公司产品，PKM2单克隆抗体Cell signaling technology公司产品，免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均为Dako North America公司产品；如图10、11、12所示，与注射橄榄油的正常组比较，肝纤维化模型组小鼠肝脏组织中HIF-1-α蛋白显著增多，糖酵解限速酶基因PKM2的RNA和蛋白表达显著升高，纤维化表型标记基因α-SMA和I型collagen基因的RNA和蛋白水平也随之显著增强；尽管未包裹的喜树碱在体外可有效抑制以上这些蛋白的表达，直接通过静脉注射到小鼠体内的喜树碱在肝脏内则完全失去了对这些蛋白的抑制作用；特别值得注意的是，PEG-PCL包载的喜树碱虽然能很好地保护喜树碱，却未能有效地恢复喜树碱的这些抑制功能；而与此相反的是，经靶向性VA-PEG-PCL纳米胶束包裹的喜树碱，不仅极大地抑制了肝脏组织中的HIF-1-α蛋白，还显著地降低了PKM2、I型collagen和α-SMA的RNA和蛋白的表达水平。

图13-14分别显示了CCl₄处理后肝脏中PKM2和α-SMA阳性HSC细胞明显扩增；喜树碱和PEG-PCL包载的喜树碱均未能有效遏制其扩增，唯有VA-PEG-PCL胶束载体包载的喜树碱可显著减少肝脏中的这些阳性HSC细胞；这些结果说明，本发明制备的VA-PEG-PCL胶束包载的喜树碱不仅可定向作用于纤维化肝脏中活化HSC，还可通过降低该细胞中HIF-1-α蛋白来抑制其旺盛的糖酵解代谢活动，从而实现对其活化表型向静息态的逆转；HIF-1-α单克隆抗体为Affinity公司产品；ST 16R低温台式离心机，Thermo，USA；ChemiDoc凝胶成像系统，Bio-Rad，USA。

实验中所有数据均采用统计软件SPSS进行统计分析，以t检验分析组间差异，计量数据以平均数±标准差表示。

实验结果表明，VA-PEG-PCL为载体的喜树碱胶束可以富集于纤维化肝脏中、定向作用于肝脏中大量增殖的活化HSC，并通过抑制细胞中的HIF-1-α蛋白遏制细胞中旺盛的糖酵解代谢活动和逆转细胞的纤维化表型，从而减少肝组织中胶原纤维的沉积、恢复肝脏的正常功能；本发明的化合物通过促使活化态肝星状细胞向静息态表型的逆转来明显改善肝纤维化的损伤，有效而安全，具有良好的临床应用前景；本发明采用CCl₄对小鼠腹腔一周两次重复注射以诱导肝纤维化发生，同时通过一周两次尾静脉注射对小鼠分别给予喜树碱、PEG-PCL胶束载送的喜树碱和VA-PEG-PCL纳米胶束载体包裹的喜树碱；实验持续进行6周；采用细胞分子生物学、组化和组织免疫化学等手段对实验组小鼠进行检测；结果显示仅有VA靶向纳米载体材料包裹的喜树碱能显著抑制肝组织中HIF-1-α、PKM2(HSC中)等糖酵解基因表达，有效降低α-SMA和I型Collagen等肝纤维化表型的标记基因的RNA和蛋白水平；肝组织中胶原纤维的沉积和血清中丙氨酸转氨酶ALT及天门冬氨酸氨基转移酶AST活性也受到明显遏制；这些结果充分体现了本发明化合物具有有效而安全的治疗肝纤维化作用。