技术领域本发明涉及生物标本制备领域，具体而言，涉及一种鱼类早期生活史耳石样品制备方法。
背景技术：
鱼类生态学研究主要包括年龄、生长、食性、死亡以及种群数量变动等。由于鱼类种群数量变动一大部分取决于早期生活史阶段(胚胎期、仔稚鱼期以及幼鱼期)的存活率，所以早期生活史的生态学研究对于生物种类成体种群的补充、种群结构及种群规模具有十分重大的意义。带有编年信息，并且在整个生命过程中连续生长的，具有坚固解剖结构的鱼类骨骼结构诸如鱼鳞，鳃盖骨，鳍条，椎骨等通常可用于鱼类年龄与生长状况判定的参考。硬骨鱼类中最先钙化的结构通常是耳石，鱼类耳石位于内耳内，一般由矢耳石、微耳石和星耳石各1对组成。相比其他骨骼结构，耳石的特殊性在于生长具有连续性，受外界环境影响相对小，在野外采集所得的鱼类从来未发现耳石被重新吸收现象，并且一旦形成便保持不变，因而成为生活史事件永久记录的良好载体。自Pannella(1971)首次描述了鱼类耳石日沉积增长变化以来，鱼类耳石的研究得到了广泛的开展，随着相关理论和技术的发展，它已称为一种揭示鱼类生活史、生活史重建以及水体环境域变的关键技术。早期生活史阶段的鱼类相关生态学研究目前在耳石形态发育、日轮鉴定日龄以及日轮增长等有较多报道。耳石微结构检测与分析技术主要用于鉴别仔鱼种群、推测产卵时间、仔鱼早期发育条件和评估死亡率，目前已经成为研究鱼类早期生活史的重要手段。因此，制备好耳石样品是要检测分析耳石微结构重要一环。然而，现有的耳石制备方法多是针对的成年鱼，将其直接套用在仔稚鱼耳石的制备上，存在摘取耳石困难的问题。此外现有技术还存在标本不洁净、不易长久保存的问题。有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种鱼类早期生活史耳石样品制备方法，所述的制备方法操作易于掌握，可解决处于早期生活史的鱼类摘取耳石困难、制得的标本不洁净、不易长久保存的问题。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种鱼类早期生活史耳石样品制备方法，包括以下步骤：1)、将处于早期生活史的鱼样本置于解剖镜或者体视显微镜下，向所述鱼样本上滴加腐蚀性溶液以暴露耳石；所述腐蚀性溶液为弱酸、弱碱或强碱弱酸盐的溶液；2)、用纯化水清洗暴露的耳石多次，同时吸除清洗后的液体和/或组织残余；3)、待耳石室温干燥后用封片剂将耳石包埋，待封片剂铺平后烘干。鱼类早期生活史阶段作为鱼类整个生活史中的一个重要的环节，早期发育阶段成活率直接关系到鱼类的实际补充量的大小，是引起种群数量变动和年龄结构变化的主要原因，并与渔业资源开发利用尺度以及鱼类资源保护政策的制定等密切相关。一般情况下，鱼类早期生活史阶段主要包括胚胎(卵)、仔鱼期、稚鱼期及幼鱼期。这种分期的方法是根据鱼类器官结构的发育、营养和摄食等特征进行划分的。处于早期生活史阶段的鱼耳石较小，且样本本身体积也很小，因而耳石的摘取非常困难，本申请通过使用腐蚀性溶液腐蚀掉耳石周围的组织，使得耳石摘取变的很容易。此外，本申请没有采用常规的压片法，而是在将封片剂烘干后即可观察。这样制得的标本更洁净，杂质更少，更有利于标本的长期保存，且适用于体透明消失后时期的鱼样品。用纯化水清洗暴露的耳石的次数一般为3～4次。优选的，如上所述的鱼类早期生活史耳石样品制备方法，在滴加腐蚀性溶液以暴露耳石的步骤中，具体包括：滴加腐蚀性溶液再滴加纯化水减缓鱼样本被腐蚀的速度。由于生物样本的多样性和复杂性，不同鱼类的外层组织厚度，组织的构成等都可能有所差别，为了使得鱼体的溶解速度变的可控，所以可选的，需要用纯化水来稀释腐蚀性液体的浓度。优选的，如上所述的鱼类早期生活史耳石样品制备方法，所述包埋的步骤具体包括：将封片剂滴在耳石样品附近，再于所述封片剂上滴加有机溶剂使封片剂自由扩散将耳石包埋。这种包埋方式，封片剂以有机溶剂为载体，在表面张力的作用下缓缓扩散铺满整个载玻片，避免气泡的产生。有机溶剂还可起到透明耳石、稀释封片剂的作用，使其不至于太过黏稠。优选的，如上所述的样品制备方法，所述鱼样本包括处于胚胎期、仔鱼期、稚鱼期或幼鱼期的新鲜样本、低温保存样本或无水乙醇固定的样本。其中胚胎期具体为耳石已经形成后的胚胎期。优选的，如上所述的鱼类早期生活史耳石样品制备方法，当所述鱼样本为胚胎期或仔鱼期样本时，在步骤1)～2)中，耳石的暴露及清洗方法具体为：待腐蚀性溶液将耳石周围的鱼体腐蚀的洁净、透明时就开始用水清洗，并留下残存的鱼体作为耳石位置参照。这么做一方面是由于耳石过小、过轻、易滑动，很容易在清洗时，滤纸将其吸走；另一方面，对于胚胎期或仔鱼期样本，由于耳石过小，没有位置参照物，在显微镜下观察分析时很难找到耳石，因而需要在鱼体未被完全溶解之前，根据残存的鱼体作为耳石位置的参照，不要等鱼体完全溶解掉只剩下耳石再清洗。优选的，如上所述的鱼类早期生活史耳石样品制备方法，当所述鱼样本为稚鱼期或幼鱼期样本时，步骤1)包括：将所述鱼样本的鱼头剪下，弃鱼身；将腐蚀性溶液滴加在所述鱼样本的鱼头上以浸没鱼头，鱼头松软后在耳囊处将耳石挑出并移除多余的组织。通常稚鱼期和幼鱼期的鱼身就已经比较大，为了操作方便，应当将鱼头单独取下。稚鱼期的鱼身组织也比较厚实，所以用腐蚀性溶液将样本软化后，将耳石挑出之后就可以。进一步优选的，对于30日龄后耳石样品，在包埋之后封片之前，还包括磨片；所述磨片的操作具体包括：用2000～3000目水砂纸打磨包埋好的耳石至其核心暴露，再用5000～10000目的水砂纸将暴露出的核心抛光，用纯化水清洗2～3次，用有机溶剂将封片剂溶解，将未打磨的一侧朝外放置并烘干。通常前30日龄之前的耳石不需要进行打磨，而30日龄后的耳石已经有一定厚度，无法辨别轮纹，需要进行打磨抛光。优选的，如上所述的样品制备方法，所述腐蚀性溶液为次氯酸钠溶液。次氯酸钠为一种强碱弱酸盐，其溶液具有腐蚀性。进一步优选的，当所述鱼样本为胚胎期或仔鱼期样本时：当所述鱼样本为胚胎期或仔鱼期样本时，所述次氯酸钠为5.5～6.5％的次氯酸钠溶液；当所述鱼样本为稚鱼期或者幼鱼期样本时，所述次氯酸钠为10～13％的次氯酸钠溶液；所述次氯酸钠浓度以有效氯计。优选的，如上所述的鱼类早期生活史耳石样品制备方法：所述封片剂为中性树胶，所述有机溶剂为二甲苯。中性树胶，作为一种粘合剂，用于将载玻片和盖玻片粘合在一起，把生物组织切片封起来长久保留。它具有以下几个优点：透明度高，几乎和光学玻璃一样清晰；不腐蚀玻璃，因为它是中性的，而玻璃最怕碱性，如果不放心可以在粘合以前用盐酸或酒精浸泡晾干再粘可能会更好；不容易长霉，可能是因为中性树胶的溶剂二甲苯有杀霉菌作用。二甲苯可溶解或稀释中性树胶，且具有透明剂的作用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1)、处于早期生活史阶段的海水鱼耳石非常小(如3日龄黄盖鲽矢耳石直径19.8μm，微耳石直径仅为13.3μm)，很难在解剖镜下将耳石挑出。本申请通过采用腐蚀性溶液溶解鱼体，大大降低了取得耳石的难度。2)、如果采集的样品量过大，通常需要需先将鱼体低温保存或者无水乙醇保存。鱼体保存后组织变性，不再透明，在用传统方法进行耳石摘取时面临更大的挑战，但本方法不存在此问题。3)、压片法虽是简单快捷，但是存在耳石样品不洁净、不易长期保存以及不适用于不透明或者体透明消失后时期的鱼样品。本申请没有采用常规的压片法，而是在将封片剂烘干即可。这样制得的标本更洁净，杂质更少，更有利于标本的长期保存，且适用于鱼体不透明的样品。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例2中黄盖鲽仔鱼的耳石；A：微耳石；B：矢耳石；图2为实施例3中消解过程中的红鳍东方鲀仔鱼；A：微耳石；B：矢耳石；图3为实施例3中消解、清洗后红鳍东方鲀仔鱼耳石；A：微耳石；B：矢耳石；图4为实施例5中62日龄黄盖鲽耳石获取过程中的耳石；A：微耳石；B：矢耳石；C：星耳石；图5为实施例5中封片后未磨片的62日龄黄盖鲽矢耳石；图6为实施例5中封片后未磨片的62日龄黄盖鲽微耳石；图7为实施例5中封片后未磨片的62日龄黄盖鲽星耳石；图8为实施例5中制备好的62日龄黄盖鲽矢耳石；图9为实施例5中制备好的62日龄黄盖鲽微耳石。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1一种鱼类早期生活史耳石样品制备方法，包括以下步骤：S11、将处于早期生活史的鱼样本置于解剖镜或者体视显微镜下，向所述鱼样本上滴加腐蚀性溶液以暴露耳石；所述腐蚀性溶液为弱酸、弱碱或强碱弱酸盐的溶液；S12、用纯化水清洗暴露的耳石多次，同时吸除清洗后的液体和/或组织残余；S13、待耳石室温干燥后用封片剂将耳石包埋，待封片剂铺平后烘干。实施例2一种透明胚胎期或仔鱼期耳石样品制备方法，包括以下步骤：S21、将新鲜黄盖鲽仔鱼放在载玻片中央，置于解剖镜或者体视显微镜下，调节放大倍数至适当的视野。S22、耳石获取及清洗向鱼体上滴加5.5％次氯酸钠溶液，让鱼体浸渍在溶液中，如果组织溶解过快，可添加纯化水适当稀释，以便以适当的、可控的溶解速度溶解鱼体组织；待耳石清晰可见时，用纯化水清洗3～4遍，每次用滤纸吸除周围液体。需待溶液溶解耳石周围洁净、透明时就开始用纯化水清洗，留下残存的鱼体作为耳石位置参照，不要等鱼体完全溶解掉只剩下耳石再清洗。将得到的耳石室温干燥。S23、耳石封片待载玻片干燥后，在耳石附近先滴加一滴中性树胶，然后再在中性树胶上滴上二甲苯，这样中性树胶以二甲苯为载体向周边扩散，包埋带有耳石的鱼体。然后将包埋好的耳石封片放置50～60℃烘箱里烘干，即可观察并永久保存。得到的耳石标本如图1所示。实施例3一种不透明的胚胎期或仔鱼期耳石样品制备方法，包括以下步骤：S31、将红鳍东方鲀仔鱼的新鲜样本放在载玻片中央，置于解剖镜或者体视显微镜下，调节放大倍数至适当的视野。S32、耳石获取及清洗向鱼体上滴加浓度为6.5％次氯酸钠溶液，让鱼体浸渍在溶液中，如果组织溶解过快，可添加纯化水适当稀释，以便以适当的、可控的溶解速度溶解鱼体组织；消解过程中的红鳍东方鲀仔鱼如图2所示；待耳石清晰可见时，用纯化水清洗3～4遍，每次用滤纸吸除周围液体。需待溶液溶解耳石周围洁净、透明时就开始用纯化水清洗，留下残存的鱼体作为耳石位置参照，不要等鱼体完全溶解掉只剩下耳石再清洗。用尖细的解剖针将耳石挑出来，放置残余鱼体附近，室温干燥。S33、耳石封片待载玻片干燥后，在耳石附近先滴加一滴中性树胶，然后再在树胶上滴上二甲苯，这样树胶以二甲苯为载体向周边扩散，包埋带有耳石的鱼体或者残余鱼体和挑取出来的耳石。然后将包埋好的耳石封片放置50-60℃烘箱里烘干，即可观察和永久保存。前30日龄的耳石通过二甲苯透明后不用打磨即可观察分析。得到的耳石如图3所示。实施例4一种稚鱼期或幼鱼期耳石样品制备方法，包括以下步骤：S41、用解剖剪将无水乙醇固定的黄盖鲽鱼头剪下来放在载玻片中央，置于解剖镜或者体视显微镜下，调节放大倍数至适当的视野。S42、耳石获取及清洗：在鱼头上滴加氨水，浸没整个鱼头，浸泡至鱼头松软可挑即可。然后用镊子或者解剖针按压住鱼头后部，用另一把解剖针沿着耳囊的大致位置逐步挑取鱼头组织，耳石暴露出来后，将耳石移至载玻片干净处，用滤纸将余下的碎烂组织移除。最后用蒸馏水清洗耳石3～4遍，每次用滤纸吸除周围液体，室温干燥。S43、耳石封片：待载玻片干燥后，在耳石附近滴加中性树胶，然后再在树胶上滴上二甲苯，树胶以二甲苯为载体向周边扩散，包埋住所有耳石。然后将包埋好的耳石封片放置50～60℃烘箱里烘干，即可永久保存。实施例5一种稚鱼期或幼鱼期耳石样品制备方法，包括以下步骤：S51、用解剖剪将低温保存的62日日龄的黄盖鲽的鱼头剪下来放在载玻片中央，置于解剖镜或者体视显微镜下，调节放大倍数至适当的视野。S52、耳石获取及清洗在鱼头上滴加13％的次氯酸钠溶液，浸没整个鱼头，浸泡至鱼头松软可挑即可；用镊子或者解剖针按压住鱼头后部，用另一把解剖针沿着耳囊的大致位置逐步挑取鱼头组织，耳石暴露出来后，将耳石移至载玻片干净处，用滤纸将余下的碎烂组织移除；清理过程中的耳石如图4所示；用纯化水清洗耳石3～4遍，每次用滤纸吸除周围液体，防止载玻片干燥后残留氯化钠结晶，室温干燥。S53、耳石封片待载玻片干燥后，在耳石附近滴加中性树胶，然后再在树胶上滴上二甲苯，树胶以二甲苯为载体向周边扩散，包埋住所有耳石。然后将包埋好的耳石封片放置50～60℃烘箱里烘干。S54、磨片和固定30日龄后的耳石已经有一定厚度，无法辨别轮纹，需要进行打磨抛光。仔鱼、稚鱼前期耳石相对成鱼耳石较薄，不需使用砂纸打磨抛光。1)、用2000～3000目水砂纸对包埋好的耳石进行打磨，每打磨几秒后在低倍显微镜下观察，直至打磨至耳石核心处。2)、再用5000～10000目的水砂纸对其进行抛光，最终用纯化水清洗2～3次，用擦镜布将周围吸干。3)、加入一滴二甲苯将中性树胶溶解，翻转耳石，使未打磨那面朝外，烘箱烘干。按照步骤1)、2)操作，最终获得可以观察分析和永久保存的黄盖鲽鱼幼鱼耳石样品，这些样品如图5～9所示。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。