技术领域本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种不同脉冲序列对水峰进行压制的研究方法。
背景技术：
代谢组学是后基因时代的一门新兴学科，与基因组学、转录组学和蛋白组学比较，具有以下优点：基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平上得到放大，从而使检测更容易；代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库；代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目；生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理和病理状态，目前对其理论、概念、方法尚在研究和完善中。代谢物分析一直是生命科学研究和代谢组学研究中的重要组成部分。传统的代谢物分析包括繁杂的样品准备和处理步骤，但是往往得到的只是有限的几个化合物分析结果。代谢组学的快速发展，主要得益于分析技术的发展使得对大量样品和大量代谢物的快速定量测定成为可能。目前，可用于代谢组学研究的分析测试技术较多，但是，最为重要的是核磁共振技术(NMR)和质谱技术(MS)。NMR是化学和分子生物学领域广泛使用的一门分析技术，主要用于分子结构、构象、动态和反应等的分析测试，其检测没有偏向性，经常使用的1HNMR谱对所有含氢化合物的灵敏度是一样的，单次检测可以得到所有含量在NMR检测限以上物质的特征NMR谱，谱图中谱峰的位置对应于样品中不同化合物分子，峰强度(如面积)反映相应的化合物分子的相对含量，因此图谱能够有效表达代谢物组成及含量信息，可以直接作为代谢指纹图谱进行分析研究。NMR样品的前处理简单，一般为非损伤性，不会破坏样品的结构和性质，可在接近生理条件下进行实验。NMR测试手段包括液体高分辨NMR、高分辨魔角旋转(HR-MAS)NMR和活体核磁共振波谱(MRS)。目前已经有不少将此方法用于肝脏、脑组织、前列腺等组织的研究报道以及其他代谢研究尿液是代谢组学研究中最常用的生物体液之一。尿样中包含大量的有机酸、碱、单糖、多糖、杂环、多元醇、氨基酸、低分子量的蛋白质和多肽以及各种无机盐Na+,K+,Ca2+,Mg2+,HCO3-,SO42-,PO43-等,这些化合物的变化情况直接反映了生物体内各种化学变化过程，由于尿液组分的复杂性,，尿液用于代谢研究过程的其中一个非常困难的问题就是谱图的指认解析，即一张1HNMR谱图中数百个谱峰的归属问题。也可以将尿样中化合物逐个分离后测得其NMR谱，然后与整个尿样1HNMR谱进行比对，逐步解析整个尿样1HNMR谱图，但这种方法由于其复杂性和介入性而趋向于不再使用。目前经常使用的代谢物指认方法是二维核磁共振谱学方法以及标准物质加入法的结合。即使如此，目前能对尿样中予以指认的代谢物也不到检测到代谢物总数的一半。如果能利用不同的脉冲序列进行做谱比较，可以发现最适合的水峰压制的方法，对于数据的分析有比较大的作用。作为当前代谢组学研究中的主要技术之一，与高效液相-质谱联用技术相比，核磁共振的缺点是灵敏度较低，但其优势也是非常明显的。核磁共振能对样品实现非破坏性、非选择性的分析，可在接近生理条件下进行实验,可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样。另外，核磁共振氢谱对各种含氢化合物均有响应，能完成代谢产物中大多数有机化合物的检测，满足了代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目的，因此被越来越广泛地用于代谢组学研究。在生物样品的核磁共振(NMR)研究中，通常以水作溶剂，90％的水溶液中，水的1H浓度接近100mol/L，约为生物样品浓度的l0倍。如果不进行溶剂峰的抑制，则会引起以下后果：信号超出谱仪模数转换器或NMR检测系统的线性范围；引起傅里叶变换的舍入误差；溶剂峰和某些感兴趣的信号峰重迭；溶剂峰两侧的信号产生畸变等。因此对水峰进行压制对于代谢组学、生物学、体育运动学、糖尿病血液分析都有较大的帮助。压制水峰的方法主要有预饱和法(presaturation)、激发塑型法和水门（Watergate），即用梯度脉冲选择性激发水峰(excitationsculpting)，WET(WatersuppressionEnhancedthroughT1effects)法等方法。现有的技术定量讨论了梯度场实验中的三种限制压水峰效果的机制：横向磁化强度散相的动力学、纵向弛豫效应和辐射阻尼效应，分析了正是这些效应使得梯度场压水峰方法受到一定的局限。当前对于水峰压制的研究在生物、医学病理分析、体育运动学等方面都有较大的用途。现在的研究主要是运用于单一的压制水峰的方法和单一的脉冲序列对水峰进行压制，对于系统的运用核磁共振波谱仪中不同的脉冲序列对水峰进行压制的研究还很少，因此利用核磁共振波谱仪中不同的脉冲序列对水峰进行压制的效果进行研究比较，对于更好的选择脉冲序列和优化数据参数有很好的研究前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种不同脉冲序列对水峰进行压制的研究方法，以解决上述背景技术中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种不同脉冲序列对水峰进行压制的研究方法，包括如下步骤：（1）样本的采集：选择不同年龄段的男性的尿液进行分析，年龄段的范围从14～36岁的男性，为了增加数据的可靠性，每个年龄段的样本取两个；（2）样品的处理：采集到的尿液样品于3～5℃，6000～8000r/min条件下离心8～12min以去除固体杂质，从每份尿液中取上层清液，加磷酸盐/D2O缓冲溶液，磷酸盐/D2O缓冲溶液的浓度为0.2mol/L，pH为7.3～7.5，并加摩尔浓度为0.9～1.1×10?3mol/L的2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸为内标物，样品静置8～12min，再于3～5℃，6000～8000r/min离心8～12min，取上层清液置于核磁管中，准备进行NMR测试；（3）NMR数据的采集：利用理化测试中心AVANCE400M超导傅里叶变换核磁共振谱仪，用不同的脉冲序列对尿液水峰进行压制，以比较各种脉冲序列对水峰的压制效果，优化制谱的效果和参数的设置；（4）NMR数据的处理：尿液样品1HNMR谱以TSP为化学位移参考峰的位置，设为δ0，相位和基线调整后将氢谱的δ0.2～9.8区域进行分段积分，每段为0.04；为了避开溶剂峰压制对谱图造成的影响，水峰附近的区域（δ4.2～5.2）被去除，将积分数据归一化，以文本文件或Excel文件贮存，用于随后的主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)；（5）数据分析和讨论：通过对得到的图谱进行分析，比较水峰压制的情况和水峰附近的峰是否受到压制、相位的调整情况、基线的平整程度，分别对几种脉冲序列压水峰的效果进行比较，以得到每种脉冲序列最佳的参数设置。作为本发明进一步的方案：所述步骤（3）中，不同的脉冲序列为预饱和脉冲序列、NOE效应的预饱和脉冲序列、激励塑性脉冲序列、水门脉冲序列。利用预饱和法，脉冲序列为zgpr，对压水峰的能量pl9参数进行调试，以达到最好的测试效果；利用NOE效应的预饱和法，脉冲序列为noesypr1d，对压水峰的能量pl9、氢谱的90°脉宽pl1、延迟时间D1、混合时间D8参数进行调试，以达到最好的测试效果；利用激励塑性法和水门压制法，脉冲序列zgesgp或watergate，对压水峰的能量pl18、pl1、p0、p27、纵向弛豫时间T1、z方向磁化强度、梯度脉冲长度参数进行调试，以达到最好的测试效果。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、采用了不同的脉冲序列对水峰进行压制，对于代谢产物的分析有很大的益处。2、利用了不同的脉冲序列对代谢产物的水峰进行压制，分析了传统预饱和法压制水峰与现在发展起来的利用梯度场压制水峰的区别。3、自己编制一些特殊的脉冲序列，可以补充原有的脉冲序列的不足。4、更好的优化参数，使仪器原有参数更符合压制水峰的要求。5、用不同的脉冲序列对水峰的压制参数的设置，得到好的制谱效果，积累的实验参数，可以为以后生物、化学、体育等专业教师做有关代谢组学、蛋白质分子的分析、生物提取物的分析、体育学院人体运动学专业需压制水峰的实验积累一定的实验数据。附图说明图1为预饱和法脉冲序列图。图2为一维NOE效应预饱和脉冲序列图。图3为NOEPR-EPMG脉冲序列图。图4为ES-EPMG脉冲序列图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1不同脉冲序列对水峰进行压制的研究步骤：（1）样本的采集：选择不同年龄段的男性的尿液进行分析，年龄段的范围从14～36岁的男性，为了增加数据的可靠性，每个年龄段的样本取两个；（2）样品的处理：采集到的尿液样品于4℃，7000r/min条件下离心10min以去除固体杂质，从每份尿液中取400μL上层清液，加入200μL磷酸盐/D2O缓冲溶液，磷酸盐/D2O缓冲溶液的浓度为0.2mol/L，pH为7.4，并加摩尔浓度为1×10?3mol/L的2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸为内标物，样品静置10min，再于4℃，7000r/min离心10min，取上层清液550μL置于5mm核磁管中，准备进行NMR测试；（3）NMR数据的采集：利用理化测试中心AVANCE400M超导傅里叶变换核磁共振谱仪，用不同的脉冲序列对尿液水峰进行压制，以比较各种脉冲序列对水峰的压制效果，优化制谱的效果和参数的设置；利用预饱和法，脉冲序列为zgpr，对压水峰的能量pl9参数进行调试，以达到最好的测试效果；利用NOE效应的预饱和法，脉冲序列为noesypr1d，对压水峰的能量pl9、氢谱的90°脉宽pl1、延迟时间D1、混合时间D8参数进行调试，以达到最好的测试效果；利用激励塑性法和水门压制法，脉冲序列zgesgp或watergate，对压水峰的能量pl18、pl1、p0、p27、纵向弛豫时间T1、z方向磁化强度、梯度脉冲长度参数进行调试，以达到最好的测试效果；（4）NMR数据的处理：尿液样品1HNMR谱以TSP为化学位移参考峰的位置，设为δ0，相位和基线调整后将氢谱的δ0.2～9.8区域进行分段积分，每段为0.04；为了避开溶剂峰压制对谱图造成的影响，水峰附近的区域（δ4.2～5.2）被去除，将积分数据归一化，以文本文件或Excel文件贮存，用于随后的主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)；（5）数据分析和讨论：通过对得到的图谱进行分析，比较水峰压制的情况和水峰附近的峰是否受到压制、相位的调整情况、基线的平整程度，分别对几种脉冲序列压水峰的效果进行比较，以得到每种脉冲序列最佳的参数设置。实施例2选用不同的脉冲序列如：预饱和法中的反转恢复法利用zgpr和zgcppr脉冲序列、带相移的反转恢复法利用noesypr1d脉冲序列；激励塑性法利用zgesgp脉冲序列；水门压制法中的wg脉冲序列对人体的尿液进行水峰压制的实验，来比较不同压制方法的效果比较，达到优化制谱效果和参数设置的目的。NOESYPRESAT序列常用于血液1HNMR制谱的水峰压制，如图1，它的基本思想与预饱和方法一致，都是将射频脉冲对准水峰照射足够长的时间，使其达到饱和，其中第1个90°脉冲的作用是将磁化矢量翻转到xy平面进动；而后第2个90°脉冲将磁化矢量又重新翻转到z向，在随后的混合期内，有些磁化矢量之间发生了NOE效应；第3个90°脉冲重新又将它们翻转到横向并检测。NOESYPRESAT优于常规预饱和序列PRESAT的地方在于：它在弛豫时间和混合时间段两次对水峰进行饱和，从而取得更好的抑制效果。图1预饱和法脉冲序列，图2一维NOE效应预饱和脉冲序列；对于复杂的生物样品，如乳汁、血清等，其1H-NMR谱包含具有不同强度和宽度的各种谱线。其中，大分子的有些自旋由于具有短的弛豫时间或与其它自旋存在交换,谱线表现为宽包。小分子自旋的谱线叠加在这些宽包上，有时小的信号与宽峰重叠,甚至被掩埋在宽包中，给谱的指认和解析带来困难。CPMG的自旋回波方法可以选择性地滤去宽包而得到窄的谱线，将该方法用于血样和组织样品的测定,可消除蛋白质类大分子物质的干扰，同时小分子代谢物的信号也不衰减。因此，NOESYPRESAT跟CPMG结合便成为另一种常用的制谱方法。如图2，CPMG序列由90°和180°的射频脉冲组成，按(90°-π-180°y'-2π-180°y'-2π-180°y'-…)顺序排列，一个90°的翻转角后接一系列180°的重聚脉冲，可以消除化学位移进动所引起的相位畸变，消除脉冲的不完全性和磁场不均匀性所引起的误差。ES（ExcitationSculpting）序列的基本思想与WATERGATE水门序列类似，都是用梯度脉冲选择性地激发水峰。原始水门序列为自旋回波序列在中间非选择性180°脉冲两边加上一对选择性90°脉冲，这一对脉冲抵消了180°脉冲对水峰的作用，使水峰经受零或360°的作用，水的磁化强度就被梯度脉冲所驱散得不到重聚；由于这一对脉冲是选择性脉冲，不影响生物样品的磁化强度，因此生物样品磁化强度在采样处形成回波，这样就达到了消除水峰的目的。改进后的ES脉冲序列如图3，其中W5是组合选择性脉冲，它由10个强度不等但间隔相等的非选择性脉冲代替一个180°脉冲，以非选择性脉冲实现选择性激发，这10个脉冲角度分别为7.8°，18.5°，37.2°，70°，134.2°，134.2°，70°，37.2°，18.5°，7.8°。本项目主要是利用以上的压制水峰的方法，选择不同的脉冲序列，对代谢产物中的水峰进行压制，已达到好的压制效果和制谱方法。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。