细胞释放过氧化氢浓度检测电极、检测方法及制备方法与流程

本申请属于细胞中过氧化氢浓度检测技术领域，特别是涉及一种细胞释放过氧化氢浓度检测电极、检测方法及制备方法。

背景技术：

随着对生命科学方面的日益关注，发现h2o2与人体代谢有密切关系，并且还有可能在肿瘤的发生发展中起到重要作用。所以我们希望得到具有更加快速、更廉价易得、灵敏度更高、生物相容性更好的h2o2电化学传感器。

细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元，其代谢过程中会产生各种活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)。活性氧(ros)作为活性氧代谢的重要产之一，其浓度与多种病理、生理现象相关。

活性氧在细胞信号转导过程中起着重要作用，参与多种因子细胞生物学效应的启动，但他们也能与细胞内的生物大分子反应，从而引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶变性、dna损伤等。h2o2是ros的重要代表，具有稳定性高、反应选择性专一及细胞膜渗透性强等特点，其浓度和超氧阴离子、羟基自由基等ros分子浓度密切相关。对细胞内h2o2及其释放过程的测定有助于理解相关疾病的生成机制，因而具有重要的意义。

过氧化氢是生物体系中一种重要化学物质，它严重影响细胞功能和新陈代谢，高浓度的过氧化氢甚至引起细胞死亡。因此，检测细胞释放过氧化氢具有重要意义。在许多酶促反应、蛋白质积聚和抗原-抗体识别过程中也伴随着过氧化氢的生成和消耗。过氧化氢的检测在环境、食品以及其他领域也具有重要意义。国外发达国家已经将h2o2用于环境保护，由于成本问题在这方面应用较少。h2o2在食品包装、食品纤维等方面用作消毒杀菌剂。

电流型生物传感器常规电极氧化h2o2时电位较高，如贵金属电极(0.5～0.7v)，玻碳电极上0.9v。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞释放过氧化氢检测电极、检测方法及制备方法，以克服现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请实施例公开一种细胞释放过氧化氢检测电极，包括疏水的导电基底、分布于导电基底表面的贵金属纳米颗粒、以及覆盖于贵金属纳米颗粒外部的壳聚糖或nafion溶液。

相应的，本申请公开了一种细胞释放过氧化氢的检测方法，包括步骤：

(1)、将细胞培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入ph7.4～8.0的pbs，通氮除氧30～60min，并在溶液上方维持n2气氛；

(2)、将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位，当电极响应电流达到稳定后，加入0.3～1.0mol/l的naoh溶液使细胞膜溶解，细胞内的h2o2释放出来并在所述的检测电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。

本申请实施例还公开了一种细胞释放过氧化氢检测电极的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)、配制贵金属纳米颗粒溶液；

(2)、采用涂布装置将贵金属纳米颗粒溶液沉积在疏水的导电基底上；

(3)、待贵金属纳米颗粒溶液干燥后，在贵金属纳米颗粒表面采用涂布方式覆盖壳聚糖或nafion溶液。

优选的，在上述的细胞释放过氧化氢检测电极的制备方法中，所述贵金属纳米颗粒溶液的涂布速度小于壳聚糖或nafion溶液的涂布速度。

优选的，在上述的细胞释放过氧化氢检测电极的制备方法中，所述步骤(2)中，涂布装置包括涂布探头、设于涂布探头下方支撑辊、以及分设于支 撑辊两侧的放料辊和收料辊，所述导电基底卷绕于所述放料辊和收料辊上，所述放料辊和支撑辊之间设有第一导引辊组件，该第一导引辊组件包括两个第一导引辊，该两个第一导引辊分设于所述导电基底的上下两侧，所述支承辊和收料辊之间设有第二导引辊组件，所述第二导引辊组件包括两个第二导引辊，该两个第二导引辊分设于所述导电基底的上下两侧，所述第二导引辊组件和收料辊之间设有用以对导电基底进行干燥的干燥箱。

优选的，在上述的细胞释放过氧化氢检测电极的制备方法中，所述支撑辊、涂布探头支撑于支架台上，所述支架台上还固定有一固定器，该固定器的一端固定于所述支架台上，另一端向下折弯延伸并阻挡于所述导电基底的上表面，所述涂布探头的底端固定有一螺旋固定仪。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明基于超薄涂层纳米涂布技术和纳微结构的构建电极，明显增强电子传递效率，增大电极有效接触面积；无需外加其他催化剂或酶即可用于检测细胞释放过氧化氢的电极。通过检测细胞释放过氧化氢，预防癌症、衰老等相关疾病的发生、发展。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a所示为本发明具体实施例中涂布装置的原理示意图；

图1b所示为本发明具体实施例中支撑辊的安装结构示意图；

图2是实施例1中细胞释放过氧化氢浓度检测计时电流曲线；

图3是玻碳电极与实施例1中电极检测细胞释放过氧化氢浓度的电流时间曲线对比图；

图4是本发明实施例1-4中过氧化氢浓度的检测线性曲线对比图；

图5a是本发明实施例5中市场上过氧化氢浓度的检测电流时间曲线；

图5b是本发明实施例5中市场上过氧化氢的线性曲线图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本实施例提供一种细胞释放过氧化氢检测电极，包括疏水的导电基底、分布于导电基底表面的贵金属纳米颗粒、以及覆盖于贵金属纳米颗粒外部的壳聚糖或nafion溶液。

本实施例另一方面还提供一种细胞释放过氧化氢的检测方法，包括步骤：

(1)、将细胞培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入ph7.4～8.0的pbs，通氮除氧30～60min，并在溶液上方维持n2气氛；

(2)、将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位，当电极响应电流达到稳定后，加入0.3mol/l的naoh溶液使细胞膜溶解，细胞内的h2o2释放出来并在权利要求1所述的电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。

本实施例再一方面提供一种细胞释放过氧化氢浓度检测电极的制备方法，包括步骤：

(1)、配制贵金属纳米颗粒溶液；

(2)、采用涂布装置将贵金属纳米颗粒溶液沉积在疏水的导电基底上；

(3)、待贵金属纳米颗粒溶液干燥后，在贵金属纳米颗粒表面采用涂布方式覆盖壳聚糖或nafion溶液。

在一些实施方案中，前述导电基体可以是管状、网状，其中空内腔、孔隙可以作为所述的气流通道。所述导电基体可以由纳微结构材料形成，例如可选自由导电微纳米纤维组成的纳微结构材料、碳纳米管膜或者金属纳微材料，所述导电微纳米纤维包括碳纤维和/或金属纤维，且不限于此。藉由所述导电基体内的连续纳微结构可形成所述流动相通道。

较为优选的，所述纳米金属颗粒的粒径为2-50nm，其比表面积大，催化 活性良好，能进一步提升传感器的灵敏度和响应速度。进一步的，所述纳米贵金属颗粒是在所述导电基体上原位生长形成，或者，所述纳米贵金属颗粒是沉积在所述导电基体上。其中若采用前者，将能提升纳米贵金属颗粒于导电基体上的附着牢固度。

在一些实施方案中，可以通过选用贵金属的氧化态物质作为原料，利用热还原法、电化学沉积法制得纳米贵金属颗粒。其中，所述贵金属的氧化态物质包括贵金属酸或贵金属盐溶液，但不限于此。

在一些实施方案中，也可以提供纳米贵金属颗粒溶液(或称纳米贵金属颗粒溶胶)，并通过涂布方式将纳米贵金属颗粒负载于所述导电基体上。藉由这样的方案，可以高速超大规模制备所述电极。

进一步的，所测试细胞包括但不限于嗜中性粒细胞，也包括与癌症、衰老等疾病相关的任何细胞。

结合图1所示，步骤(2)中，涂布装置包括涂布探头1、设于涂布探头下方支撑辊2、以及分设于支撑辊两侧的放料辊3和收料辊4，所述导电基底5卷绕于所述放料辊3和收料辊4上，所述放料辊3和支撑辊2之间设有第一导引辊组件，该第一导引辊组件包括两个第一导引辊6，该两个第一导引辊分设于所述导电基底的上下两侧，所述支承辊和收料辊之间设有第二导引辊组件，所述第二导引辊组件包括两个第二导引辊7，该两个第二导引辊7分设于所述导电基底的上下两侧，所述第二导引辊组件和收料辊之间设有用以对导电基底进行干燥的干燥箱8。

结合图2所示，所述支撑辊2、涂布探头1支撑于支架台9上，所述支架台9上还固定有一固定器10，该固定器10的一端固定于所述支架台9上，另一端向下折弯延伸并阻挡于所述导电基底5的上表面，所述涂布探头1的底端固定有一螺旋固定仪11。

以下结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。

实施例1

本实施例涉及的一种应用于细胞释放过氧化氢检测的纳微结构电极检测细胞释放过氧化氢的制备方法具体为：

1.准备配制相应浓度溶液，6.25％贵金属纳米颗粒溶液配制

2.进样管去离子水清洗3～6次，相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，待连续滴出，推进器以一定2～30mm/s的速度移动，调节相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，连续滴出，涂布推进器参数设置包括微米推进速度以及安装技术。

3.涂布贵金属纳米颗粒，干燥后涂布壳聚糖为保证完全覆盖贵金属纳米颗粒，速度大于涂贵金属的速度；

4.冲洗3～6遍，壳聚糖溶液润洗进样管；

5.常温下放置于干燥箱中，完全干燥后，用仪器裁剪成等宽的工作电极；电化学实验在chi760c电化学工作站(chi，上海辰华)上进行，采用三电极系统，工作电极为修饰的碳纤维电极，对电极为pt丝电极，ag/agcl为参比电极；

6.实验前，电解质溶液通氮除氧至少20min，实验过程中，溶液上方保持氮气气氛，安培电流法检测细胞释放过氧化氢含量。

7.将含约5～100×10⁶个嗜中性粒细胞(淋巴b细胞)培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入5～20mlpbs(ph7.4～8.0)，小心通氮除氧30～60min(尽量不使细胞发生悬浮)，并在溶液上方维持n2气氛；将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位。

8.当电极响应电流达到稳定后，加入0.1～1.0mlnaoh溶液(0.3mol/l)使细胞膜溶解(由于加入的naoh体积较小，不会使缓冲液的ph发生较大变化)，细胞内的h2o2释放出来并在电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。该电极检测细胞释放过氧化氢含量的线性检测范围为50～440nm/l，检测限为20nm/l。

细胞释放过氧化氢检测计时电流曲线参图2所示。

在同样条件下以玻碳电极检测作为对比例，玻碳电极与实施例1中电极检测细胞释放过氧化氢的电流时间曲线对比图参图3所示，图中可以看出，碳纤维的响应电流比玻碳电极大。

实施例2

本实施例涉及的一种应用于细胞释放过氧化氢检测的纳微结构电极用于 检测细胞释放过氧化氢的制备方法具体为：

1.准备配制相应浓度溶液，12.5％贵金属纳米颗粒溶液配制

2.进样管去离子清洗三至六次，相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，待连续滴出，推进器以40～50mm/s(4000～5000hz)速度移动；

3.涂布贵金属纳米颗粒，干燥后涂布壳聚糖为保证完全覆盖贵金属纳米颗粒，速度大于涂贵金属的速度，细节注意，检查基材是否平整；

4.冲洗三遍，4～20mg/mlnafion溶液润洗进样管；

5.常温下放置于干燥箱中，完全干燥后，用仪器裁剪成等宽的工作电极；电化学工作站，三电极系统(辅助电极ag/agcl，工作电极，参比电极)；

6.实验前，电解质溶液通氮除氧至少20min，实验过程中，溶液上方保持氮气气氛，安培电流法检测细胞释放过氧化氢含量。

7.将含约5～100×10⁶个嗜中性粒细胞(淋巴b细胞)培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入5～20mlpbs(ph7.4～8.0)，小心通氮除氧30～60min(尽量不使细胞发生悬浮)，并在溶液上方维持n2气氛；将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位。

8.当电极响应电流达到稳定后，加入0.1～1.0mlnaoh溶液(0.3mol/l)使细胞膜溶解(由于加入的naoh体积较小，不会使缓冲液的ph发生较大变化)，细胞内的h2o2释放出来并在电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。该电极检测细胞释放过氧化氢含量的线性检测范围为50～440nm/l，检测限为20nm/l。

实施例3

本实施例涉及的一种应用于细胞释放过氧化氢检测的纳微结构电极检测细胞释放过氧化氢的制备方法具体为：

1.准备配制相应浓度溶液，25％贵金属纳米颗粒溶液配制

2.进样管去离子水清洗三次，相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，待连续滴出，推进器以29.412～50mm/s(3000～5000hz)速度移动，安装固定卡在槽内；

3.涂布贵金属纳米颗粒，干燥后涂布壳聚糖为保证完全覆盖贵金属纳米 颗粒，速度大于涂贵金属的速度；

4.冲洗三遍，4～20mg/ml壳聚糖溶液润洗进样管；

5.常温下放置于干燥箱中，完全干燥后，用仪器裁剪成等宽的工作电极；运用电化学工作站，通过三电极系统(辅助电极ag/agcl，工作电极，参比电极)进行电化学检测；

6.实验前，电解质溶液通氮除氧至少20min，实验过程中，溶液上方保持氮气气氛，安培电流法检测细胞释放过氧化氢含量。

7.将含约5～100×10⁶个嗜中性粒细胞(淋巴b细胞)培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入5～20mlpbs(ph7.4～8.0)，小心通氮除氧30～60min(尽量不使细胞发生悬浮)，并在溶液上方维持n2气氛；将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位。

当电极响应电流达到稳定后，加入0.1～1.0mlnaoh溶液(0.3mol/l)使细胞膜溶解(由于加入的naoh体积较小，不会使缓冲液的ph发生较大变化)，细胞内的h2o2释放出来并在电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。该电极检测细胞释放过氧化氢含量的线性检测范围为50～440nm/l，检测限为20nm/l。

实施例4

本实施例涉及的一种应用于细胞释放过氧化氢浓度检测的纳微结构电极的制备方法具体为：

1.准备配制相应浓度溶液，50％贵金属纳米颗粒溶液配制

2.进样管去离子水清洗三次，相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，待连续滴出，推进器以20～50mm/s(2000～5000hz)速度移动；

3.涂布贵金属纳米颗粒，干燥后涂布壳聚糖为保证完全覆盖贵金属纳米颗粒，速度大于涂贵金属的速度；

4.冲洗三遍，4～20mg/mlnafion溶液润洗进样管；

5.常温下放置于干燥箱中，完全干燥后，用仪器裁剪成等宽的工作电极；三电极系统(辅助电极ag/agcl，工作电极，参比电极)，计时电流法检测细胞释放过氧化氢含量。

6.实验前，电解质溶液通氮除氧至少20min，实验过程中，溶液上方保持氮气气氛，安培电流法检测细胞释放过氧化氢含量。

7.将含约5～100×10⁶个嗜中性粒细胞(淋巴b细胞)培养液进行分离使细胞沉积在离心管底部，弃去上层培养液后，加入5～20mlpbs(ph7.4～8.0)，小心通氮除氧30～60min(尽量不使细胞发生悬浮)，并在溶液上方维持n2气氛；将电极置于细胞上方并施加0.5～1.0v电位。

当电极响应电流达到稳定后，加入0.1～1.0mlnaoh溶液(0.3mol/l)使细胞膜溶解(由于加入的naoh体积较小，不会使缓冲液的ph发生较大变化)，细胞内的h2o2释放出来并在电极上发生电催化氧化，根据催化电流计算出细胞内的h2o2的含量。该电极检测细胞释放过氧化氢含量的线性检测范围为50～440nm/l，检测限为20nm/l。

图4是实施例1-4中过氧化氢的检测线性曲线对比图。

实施例5

本实施例涉及的一种应用于细胞释放过氧化氢检测的纳微结构电极的制备方法具体为：

1.准备配制相应浓度溶液，6.25％贵金属纳米颗粒溶液配制，贵金属纳米颗粒的载量为20-300ng/mm²，溶剂为乙醇水溶液(体积比10:1)；

2.进样管去离子清洗三次，相应浓度贵金属纳米颗粒胶体润湿，待连续滴出，推进器以一定速度移动1-100mm/s；

3.涂布贵金属纳米颗粒，干燥后涂布壳聚糖为保证完全覆盖贵金属纳米颗粒，速度大于涂贵金属的速度；

4.冲洗三遍，4～20mg/ml壳聚糖乙酸溶液润洗进样管；

5.常温下放置于干燥箱中，完全干燥后，用仪器裁剪成等宽的工作电极；三电极体系(辅助电极ag/agcl，工作电极，参比电极贵金属丝)，

6.根据催化电流计算出h2o2的含量。该电极检测过氧化氢含量的线性检测范围为50nm/l～140mm/l，检测限为20nm/l。

采用该电极对实验室分析纯中的过氧化氢进行检测，图5a和图5b分别为检测电流时间曲线图和线性曲线图。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。