非连续RNAG-四链体的检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及非连续rnag-四链体的检测方法。更具体地，本发明涉及硫磺素t在制备试剂盒中的用途、确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体的方法及用于检测非连续rnag-四链体的试剂盒。

背景技术：

rnag-四链体是由富含鸟嘌呤的rna序列形成的二级结构，该结构的基本单元为三或四个鸟嘌呤碱基通过hoogsteen氢键形成的g-tetrad平面结构，在一价阳离子(例如钾离子或钠离子)存在的情况下，通过多个g平面的堆积，形成独特的平行结构的g-四链体。在人类的转录基因的研究中发现，许多与恶性肿瘤发生发展关系密切的基因(如nras、zic1、mt3-mmp、ncam2、bcl-2、trf2、fgf-2、vegf等)，其转录产物mrna的5’-utr可形成大量的rnag-四链体结构，研究表明这些rnag-四链体在蛋白质的翻译过程中有重要的调控作用。然而近几年研究发现，一些非连续鸟嘌呤也可以形成rnag-四链体的结构，称为非连续rnag-四链体。因此，准确有效地检测识别非连续rnag-四链体结构对于抗肿瘤药物设计以及恶性肿瘤的早期检测都具有非常重要的意义。

然而，目前非连续rnag-四链体的检测方法仍有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明是基于发明人对下列问题和现象的发现而完成的：

现有检测rnag-四链体的方法都无法检测到非连续rnag-四链体存在，因此，能够调控基因表达的重要基因中非连续rnag-四链体结构的形成常常被忽略。

基于此，发明人提出了利用硫磺素t检测识别非连续rnag-四链体的方法，该方法灵敏度高而且操作简便。

在本发明的第一方面，本发明提出了硫磺素t在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒主要用于检测非连续rnag-四链体。发明人发现，硫磺素t与rnag-四链体接触时，硫磺素t的某些特性会发生变化，例如荧光光谱的荧光特征峰强度，进而能够通过检测硫磺素t的特征变化，以确定非连续rnag-四链体的存在。由此，根据本发明实施例的硫磺素t在制备试剂盒中的用途能够有效地检测非连续rnag-四链体，且灵敏度高、准确性好、操作简便。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将待测样品与硫磺素t接触，以便得到混合溶液，所述待测样品被预先确定含有rna；(2)对所述混合溶液进行荧光光谱分析；以及(3)基于所述荧光光谱分析结果，确定所述待测样品中是否存在非连续rnag-四链体，其中，所述荧光光谱分析结果中硫磺素t荧光特征峰强度与预定参数相比高50～500倍是所述待测样品中含有非连续rnag-四链体的指示，所述预定参数是利用硫磺素t进行空白对照试验确定的，所述硫磺素t荧光特征峰位置在480nm～512nm。发明人发现，硫磺素t与待测样品接触，能够使得硫磺素t荧光特征峰强度发生显著改变，进而能够确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体。由此，根据本发明实施例的确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体的方法能够有效地检测非连续rnag-四链体，且灵敏度高、准确性好、操作简便。

需要说明的是，根据本发明的实施例，“空白对照试验”是指以只含有硫磺素t的tris缓冲液(含钾离子)为对照溶液，其中，硫磺素t的浓度与上述混合溶液中硫磺素t的浓度相同，在与混合溶液相同检测条件下对上述对照溶液进行荧光光谱分析。与对照溶液中的硫磺素t荧光发射强度相比，非连续rnag-四链体可以使得硫磺素t的荧光发射增强50～500倍，从而使得硫磺素t荧光特征峰比对照溶液中的硫磺素t荧光特征峰强度高50～500倍，进一步确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体。

根据本发明的实施例，上述确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体的方法还可以进一步具有下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，上述方法的步骤(1)进一步包括：将所述待测样品溶解在tris缓冲液中，以便获得溶液a；将所述硫磺素t、高纯水和tris缓冲液混合，以便获得溶液b；将所述溶液a和溶液b混合并在避光条件下反应4～8小时，以便获得所述混合溶液，其中，所述混合溶液中rna与所述硫磺素t的分子摩尔比为0.5～4。根据本发明的另一个实施例，所述tris缓冲液含有钾离子，所述钾离子的浓度是40mm，所述tris缓冲液ph为7.0～8.0。发明人经过大量实验发现，tris缓冲液可以稳定rna，保持rna的生物活性，在该缓冲液条件下，硫磺素t与非连续rnag-四链体具有较强的相互作用。由此，根据本发明实施例的确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体方法的准确度、灵敏度进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于检测非连续rnag-四链体的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括硫磺素t。根据本发明的另一个实施例，所述试剂盒包括：tris缓冲液。根据本发明的另一个实施例，所述试剂盒包括：高纯水。根据本发明的实施例，本发明提出的试剂盒能够方便快捷地检测非连续rnag-四链体，且具有灵敏度高、准确度高的特点。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步具有下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述tris缓冲液含有钾离子，所述钾离子的浓度是40mm，所述tris缓冲液ph为7.0～8.0。发明人发现，tris缓冲液可以稳定rna，保持rna的生物活性，在该缓冲液条件下，硫磺素t与非连续rnag-四链体具有较强的相互作用。由此，根据本发明实施例的用于检测非连续rnag-四链体的试剂盒的准确度、灵敏度进一步提高。

附图说明

图1是根据本发明实施例的检测液丙(对照组)的荧光光谱图；

图2是根据本发明实施例2的检测液甲的荧光光谱图；

图3是根据本发明实施例2的检测液乙的荧光光谱图；

图4是根据本发明实施例3的检测液甲的荧光光谱图；

图5是根据本发明实施例4的检测液甲的荧光光谱图；以及

图6是根据本发明实施例5的检测液甲的荧光光谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种利用硫磺素t确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体的方法。

在本发明中，硫磺素t的分子结构如式i所示，

发明人发现，硫磺素t本身对光的吸收能力较差，产生的光信号较差。然而，硫磺素t与非连续rna-g四链体结合后，硫磺素t的空间结构发生了变化，使得其对光的吸收能力增强，从而可以通过光信号的检测，确定非连续rna-g四链体的存在。

根据本发明的实施例，利用硫磺素t可通过如下方法确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体：

制备rna和硫磺素t的混合溶液

将待测样品溶于ph值为7.0～8.0的tris缓冲液中，得到溶液a；将硫磺素t溶于高纯水，再用ph值为7.0～8.0的tris缓冲液稀释，得到溶液b；将溶液a和溶液b混合，使溶液中待测rna与硫磺素t的分子摩尔比为0.5～4，避光条件下反应4-8h后，以便获得rna和硫磺素t的混合溶液。

其中，缓冲液具体为tris-hcl(含k⁺)缓冲溶液，k⁺的浓度是40mm。发明人发现，在该缓冲液中，硫磺素t与非连续rnag-四链体具有较强的相互作用，而与单链rna几乎没有作用；基于硫磺素t的此特性，发明人进一步采用了荧光光谱分析法对获得rna和硫磺素t的混合溶液进行测定，以此来确定待测样品中是否存在非连续rnag-四链体。

荧光光谱分析

对上述待测含有rna的样品和硫磺素t的混合溶液进行荧光光谱分析，如果溶液在480nm～512nm处出现较强的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)，且混合溶液中硫磺素t荧光特征峰强度与预定参数相比高50～500倍，则待测样品中存在非连续rnag-四链体。

根据本发明的实施例，在非连续rnag-四链体与硫磺素t的摩尔比为0.5～4时，可使硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)荧光强度增强50～500倍。发明人发现，单链rna与硫磺素t的摩尔比在与非连续rnag-四链体与硫磺素t摩尔比相同的条件下，硫磺素t本身的荧光强度增强只有2-8倍。因此，通过检测硫磺素t与待测rna相互作用后的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)荧光强度，就能够快速简便地检测待测rna，从而判断待测样品中是否存在非连续rnag-四链体。

根据本发明的实施例，本发明提出的利用硫磺素t检测非连续rnag-四链体的方法能够在溶液体系中高效地识别非连续rnag-四链体；能够利用简单的光谱学仪器快捷地识别出非连续rnag-四链体。

在本发明的另一方面，本发明提出了硫磺素t在检测非连续rnag-四链体的新用途。应用硫磺素t检测非连续rnag-四链体具有简单、快捷的优点，克服了现有方法无法检测到非连续rnag-四链体的缺陷。硫磺素t检测非连续rnag-四链体的方法可以通过荧光光谱的方法进一步快速检测非连续rnag-四链体。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例1制备样本

在以下实施例中所用的样本如下所述：

样本1：非连续rnag-四链体样本，在以下实施例中用到的非连续rnag-四链体分别为spinach(seqidno:1)、bulges(seqidno:2)、trna-ala(seqidno:3)以及trna-cys(seqidno:4)。

所示核苷酸序列：

gcagccggcuuguugaguagagugugagcuccguaacuggucgcgucgacgcgaccgaaugaaauggugaaggacggguccagccggcugc(seqidno:1)。

uuguggugggugggugggu(seqidno:2)。

ggggguguagcucagugguagagcgcgugc(seqidno:3)。

gggguauagcucagugguagagcauuuga(seqidno:4)。

所有核苷酸序列由广州锐博生物有限公司合成。将序列溶解于tris-hcl(含k⁺)溶液中，rna溶液(seqidno:1-4)的终浓度为20微摩尔/升，并加温至90℃后，然后自然降到室温，即分别得到样本1，2，3和4。

样本：单链rna样品，在以下实施例中用到的单链rna，又称为af22，af22具有seqidno:5所示的核苷酸序列。

caauuguauauauucg(seqidno:5)。

af20由广州锐博生物有限公司合成，将af20溶解于tris-hcl(含k⁺)溶液中，af20终浓度为20微摩尔/升，并加温至90℃后，然后自然降到室温，即可得到样本5。

硫磺素t：硫磺素t是一种商业化产品，可以通过市场购买获得。

在以下实施例中所用硫磺素t购自sigma公司，具有式i所示的结构。

实施例2检测非连续rnag-四链体

1、制备反应液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入40微升20微摩尔/升的样本4(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液甲，其中，非连续rnag-四链体与硫磺素t的摩尔比为2：1。

2)溶液乙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入40微升20微摩尔/升的样本5(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液乙，其中，单链rna与硫磺素t的摩尔比为2：1。

3)溶液丙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混匀，得到溶液丙，作为对照样品。

2、检测反应液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的浓度均为2微摩尔/升，溶液甲、乙、丙避光反应5h，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。

荧光光谱分析

将检测液甲、检测液乙和检测液丙进行荧光光谱分析。

检测结果如图1～3所示，其中图1是检测液丙的荧光光谱，图2是检测液甲的荧光光谱，图3是检测液乙的荧光光谱。

由图1～3结果可以看出，检测液丙(未加入rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(480-512nm)，强度为4；检测液甲(含有非连续rnag-四链体)的荧光光谱中会出现很强的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为1700，检测液甲的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)相对检测液丙的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度高约400倍；检测液乙(含有单链rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)未有明显的增加。

3、结果分析

进行荧光光谱分析时，当溶液中没有rna存在时，硫磺素t的荧光发射峰(494nm)(很弱，强度约为4，有时可忽略不计)；当加入非连续rnag-四链体时，硫磺素t与非连续rnag-四链体发生强烈的相互作用，使得硫磺素t的荧光发射峰增强至1700。当加入单链rna时，硫磺素t的荧光强度几乎不发生变化。

实施例3检测非连续rnag-四链体

1、制备反应液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本3(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液甲，其中，非连续rnag-四链体与硫磺素t的摩尔比为2：1。

2)溶液乙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本5(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液乙，其中，单链rna与硫磺素t的摩尔比为2：1。

3)溶液丙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混匀，得到溶液丙，作为对照样品。

2、检测反应液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的浓度均为2微摩尔/升，溶液甲、乙、丙避光反应5h，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。

荧光光谱分析

将检测液甲、乙和丙检测液进行荧光光谱分析。

检测液丙的荧光光谱同实施例2中检测液丙的荧光光谱，检测液乙的荧光光谱同实施例2中检测液乙的荧光光谱检测结果如图3所示，图4是检测液甲的荧光光谱。

由图1，图3和图4结果可以看出，检测液丙(未加入rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为4；检测液甲(含有非连续rnag-四链体)的荧光光谱中会出现很强的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为700，检测液甲硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)相对检测液丙硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度高约200倍；检测液乙(含有单链rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度未有明显的增加。

进行荧光光谱分析时，当溶液中没有rna存在时，硫磺素t的荧光发射峰(494nm)(很弱，强度约为4，有时可忽略不计)；当加入非连续rnag-四链体时，硫磺素t与非连续rnag-四链体发生强烈的相互作用，使得硫磺素t的荧光发射峰增强至700。当加入单链rna时，硫磺素t的荧光强度几乎不发生变化。

实施例4检测非连续rnag-四链体

1、制备反应液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本2(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液甲，其中，非连续rnag-四链体与硫磺素t的摩尔比为2：1。

2)溶液乙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本5(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液乙，其中，单链rna与硫磺素t的摩尔比为2：1。

3)溶液丙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混匀，得到溶液丙，作为对照样品。

2、检测反应液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的浓度均为2微摩尔/升，溶液甲、乙、丙避光反应5h，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。

荧光光谱分析

将检测液甲、乙和丙进行荧光光谱分析。

检测液丙的荧光光谱同实施例2中检测液丙的荧光光谱，检测液乙的荧光光谱同实施例2中检测液乙的荧光光谱检测结果如图3所示，图5是检测液甲的荧光光谱。

由图1，图3和图5结果可以看出，检测液丙(未加入rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为4；检测液甲(含有非连续rnag-四链体)的荧光光谱中会出现很强的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为300，检测液甲硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)相对检测液丙硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度高约100倍；检测液乙(含有单链rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度未有明显的增加。

进行荧光光谱分析时，当溶液中没有rna存在时，硫磺素t的荧光发射峰(494nm)(很弱，强度约为4，有时可忽略不计)；当加入非连续rnag-四链体时，硫磺素t与非连续rnag-四链体发生强烈的相互作用，使得硫磺素t的荧光发射峰增强至300。当加入单链rna时，硫磺素t的荧光强度几乎不发生变化。

实施例5检测非连续rnag-四链体

1、制备反应液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本1(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液甲，其中，非连续rnag-四链体与硫磺素t的摩尔比为2:1。

2)溶液乙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后加入80微升20微摩尔/升的样本5(ph7.2)，继而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混匀，得到溶液乙，其中，单链rna与硫磺素t的摩尔比为2:1。

3)溶液丙

在2ml的反应管中加入4微升200微摩尔/升的硫磺素t的高纯水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混匀，得到溶液丙，作为对照样品。

2、检测反应液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的浓度均为2微摩尔/升，溶液甲、乙、丙避光反应5h，得到检测液甲，检测液乙和检测液丙。

荧光光谱分析

将检测液甲、乙和丙进行荧光光谱分析。

检测液丙的荧光光谱同实施例2中检测液丙的荧光光谱，检测液乙的荧光光谱同实施例2中检测液乙的荧光光谱检测结果如图3所示，图6是检测液甲的荧光光谱。

由图1，图3和图6结果可以看出，检测液丙(未加入rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为4；检测液甲(含有非连续rnag-四链体)的荧光光谱中会出现很强的硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)(494nm)，强度为200，检测液甲硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)相对检测液丙硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度高约50倍；检测液乙(含有单链rna)的荧光光谱中硫磺素t荧光特征峰(此处为荧光发射峰)强度未有明显的增加。

进行荧光光谱分析时，当溶液中没有rna存在时，硫磺素t的荧光发射峰(494nm)(很弱，强度约为4，有时可忽略不计)；当加入非连续rnag-四链体时，硫磺素t与非连续rnag-四链体发生强烈的相互作用，使得硫磺素t的荧光发射峰增强至200。当加入单链rna时，硫磺素t的荧光强度几乎不发生变化。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述针对的未必是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。