技术领域：本发明属于比色分析和青蒿素及其衍生物检测技术领域，特别是涉及一种运用纳米金和单链DNA来定性、定量的比色检测方法。技术背景：青蒿素是青蒿抗疟的有效成分，也是合成青蒿素系列药物的起始原料，当前青蒿素系列药物已取代奎宁成为治疗疟疾最安全有效的药物。近年来由于青蒿素及其衍生物在世界范围的广泛应用，促进了我国青蒿素提取业的快速发展，同时也带动了青蒿种植业的发展。因为青蒿的使用量大，市场需求广，一些不法商贩也借机用劣质青蒿或伪品冒充正品出售，给青蒿素提取厂商带来了很大的损失，因此建立青蒿素定性以及定量检测方法显得尤为重要。当前青蒿素的检测方法包括生物学方法、光谱分析法、色谱分析法等。生物学方法如酶联免疫法(ELISA法)、放射免疫分析法(RIA法)，在定量分析青蒿素时通常会遇到成本高、操作复杂等问题，不具有普遍性。光谱分析法如紫外光谱分析法，存在操作步骤烦琐、费时的缺点。色谱分析法如高效液相色谱法，虽具有准确度高、专属性强、结果准确等优点，但因仪器昂贵，成本太高而不能普及和推广。因此，建立一种快速、简便、准确、灵敏的青蒿素检测方法势在必行。近年来，随着新型纳米材料的不断出现，便携、实时、低成本的检测技术和装备迅速发展起来。其中，金纳米粒子因其特殊的物理化学性质而收到广泛关注和应用。纳米金是指直径在0.5-250nm的金超微粒子，一般分散在水中。Mirkin等首次将纳米金比色测定法应用于生理活性物质分析，利用纳米金溶液在聚集和解聚集过程中所产生的颜色变化，发展了肉眼可视化分析检测寡聚核苷酸杂交的DNA生物传感器。这种基于纳米金的裸眼可视化检测方法，其具有方便、快捷、灵敏度高、低成本、仪器简单等显著优点，因而更适合于现场筛查和现代社会对分析检测技术的需求。迄今为止，将纳米金用于青蒿素及其衍生物的可视化检测研究还未见报道。青蒿素及其衍生物含有过氧桥基团，可与亚铁反应后可生成高活性自由基，破坏单链DNA的结构，而单链DNA对纳米金可起稳定作用。本发明基于这些研究，通过青蒿素及其衍生物与亚铁反应生成自由基，破坏单链DNA，使其丧失对纳米金的保护作用，使分散的纳米金聚集，颜色由酒红色变为蓝紫色，达到裸眼检测青蒿素及其衍生物的目的。纳米金溶液颜色的变化对应于吸光度的变化，纳米金聚集使特征吸收峰红移，以吸光度比值对浓度做标准曲线，从而建立一种基于纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法。
技术实现要素：
：本发明的目的在于克服当下青蒿素及其衍生物检测过程中存在的操作繁琐费时、成本昂贵、依赖大型仪器设备等问题，提供了一种基于纳米金的新型比色检测方法，利用了纳米金独特的光学特性及青蒿素的特殊结构，构建了一个简单快速灵敏的检测体系。纳米金胶体分散状态时呈酒红色，聚集后呈蓝紫色，单链DNA可防止纳米金在亚铁离子溶液中聚集，从而对纳米金胶体起到保护作用。而青蒿素或其衍生物在亚铁离子催化下可产生自由基，破坏单链DNA结构，使其丧失对纳米金的保护，进而使纳米金聚集变色，实现对青蒿素及其衍生物的比色检测。所述的技术方案如下：本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于包括如下步骤：(1)分别向A、B离心管中加入单链DNA溶液；(2)向步骤(1)中得到的B离心管溶液加入含有青蒿素或其衍生物的丙酮溶液，A离心管加入等量丙酮溶液；(3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液分别加入亚铁离子溶液并混合均匀，反应一段时间，当青蒿素或其衍生物存在时将反应产生自由基，从而破坏单链DNA，若不存在则没有自由基产生，单链DNA结构保持完整；(4)向步骤(3)中得到的A、B离心管溶液分别加入纳米金胶体溶液并混合均匀，观察到B离心管中混合物颜色由酒红色变为蓝紫色，即指示了青蒿素或其衍生物的存在；而A离心管混合物中不存在青蒿素或其衍生物，没有自由基产生，纳米金胶体得到了结构完整的单链DNA的保护，保持分散状态的酒红色；(5)通过紫外分光光度计测定A、B离心管溶液的吸光度，当B离心管溶液有青蒿素或其衍生物存在时吸收峰红移；(6)配制梯度浓度的青蒿素或其衍生物的标准溶液，经过上述步骤后依次测定吸光度，以吸光度比值对浓度绘制标准曲线，利用该标准曲线实现对样品中青蒿素或其衍生物的含量测定。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：所述步骤(4)使用的纳米金胶体为柠檬酸钠还原法制备而成，粒径10-20nm，浓度为35nM，加入量为360μL。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于所述步骤(3)的反应时间范围为5-10min，优选8min。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)单链DNA分子，长度为7bp，序列为5’～CCAACCA～3’，浓度为20μM，检测使用量为5-10μL，优选7μL。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：所述步骤(2)加入丙酮体积为40μL。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：所述步骤(3)亚铁离子的使用浓度为1.0％-1.5％，优选1％，检测使用量为16-22μL，优选18μL。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：所述步骤(5)、(6)所述的波长为610nm和540nm；以两波长处吸光度比值(A610/A540)为标准曲线的纵坐标做图。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：对青蒿素及其衍生物的检出限为1μM。本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于：对检测青蒿素及其衍生物的检测线性范围为3-40μM。本发明的有益效果是：该比色检测方法显色快、易操作、成本低、灵敏度高，为今后黄花蒿采收日期的确定、道地青蒿药材鉴定和筛选、青蒿素衍生物的检测等方面提供了便利，具有较大的临床应用潜力和农业生产应用潜力。附图说明：图1、纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法示意图；图2、纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的紫外-可见吸收光谱图；图3、纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的标准曲线图；图4、纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的特异性检测结果图；图5、青蒿素衍生物I和II的化学结构。具体实施方式：下面结合具体实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附属权利要求书所限定的范围。一种比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，具体步骤如图1所示：实施1：纳米金制备将氯金酸(HAuCl4)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入4mL1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液，继续加热煮沸10min。观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，全过程约2-3min。停止加热后继续搅拌15min，冷却至室温后用蒸馏水定容至100mL，得到直径为16.7nm，浓度为35nM的纳米金溶液。实施2：青蒿素及其衍生物检测方法的定性分析(1)分别向A、B离心管中加入20μM单链DNA溶液7μL；(2)向步骤(1)中得到的B离心管溶液加入待测青蒿素或其衍生物丙酮溶液40μL，A离心管加入相同量的丙酮溶液；(3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液分别加入1％硫酸亚铁铵溶液18μL，混合均匀，放置8min，当青蒿素或其衍生物存在时反应产生自由基，从而破坏单链DNA，若不存在青蒿素则没有自由基产生，单链DNA结构保持完整；(4)向步骤(3)中得到的A、B离心管溶液分别加入纳米金胶体360μL，并混合均匀，观察到B离心管中混合物颜色由酒红色变为蓝紫色，即指示了青蒿素及其衍生物的存在。而A离心管混合物中不存在青蒿素，没有自由基产生，纳米金胶体得到了结构完整的单链DNA的保护，保持分散状态的酒红色，紫外分光光度计测定结果显示溶液在540nm有明显吸收峰(图2)。当B离心管溶液存在青蒿素及其衍生物时，540nm处的吸光度降低，610nm处产生强的吸收峰，由此实现对青蒿素及其衍生物的定性分析。实施3：青蒿素及其衍生物检测方法的定量分析(1)向8支离心管中分别加入20μM单链DNA溶液7μL；(2)向步骤(1)所得离心管中分别加入不同浓度的青蒿素或其衍生物溶液40μL；(3)向步骤(2)所得离心管中分别加入1％硫酸亚铁铵溶液18μL，充分混匀，放置8min；(4)向步骤(3)所得离心管中分别加入纳米金溶液360μL，混合均匀；(5)分别检测步骤(4)所得溶液吸光度。以标准品溶液的A610/A540为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图3。根据样品的A610/A540值在标准曲线上计算出样品浓度，实现定量分析。实施4：青蒿素及其衍生物检测方法的特异性分析(1)向5支离心管中分别加入20μM单链DNA溶液7μL；(2)向步骤(1)所得离心管中分别加入40μL含有青蒿素、青蒿素衍生物(图5)以及干扰物(葡萄糖、果糖)溶液；(3)向步骤(2)所得离心管中分别加入1％硫酸亚铁铵溶液18μL，充分混匀，放置8min。(4)向步骤(3)所得离心管中分别加入纳米金溶液360μL，混合均匀；(5)分别检测步骤(4)所得溶液吸光度。如图4所示，本方法仅对青蒿素及其衍生物具有高灵敏响应。与现有技术相比，本发明具有以下特点：试剂廉价易获取、显色快、灵敏度高、操作简便、不依赖大型复杂仪器。