本发明涉及一种药物的筛选方法，具体涉及一种筛选效率高，基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，属于抗血栓药物筛选与评价方法领域。
背景技术：
血栓是在血管中形成的血块，在循环系统中会妨碍或阻断血流。目前抗血栓药可分为抗凝血药、抗血小板聚集药和溶血栓药三大类。血管内皮细胞受损后，产生的凝血激酶增多，促进凝血酶形成，凝血黄素A2也增多，同时制造抗凝物质前列环素减少，易诱发血栓形成。因此，抑制凝血酶可以抗血栓形成，人们已经从天然植物中发现了很多天然的凝血酶抑制剂。
很多药物筛选系统是基于荧光的在线或离线高通量筛选，尽管灵敏度高、选择性好，但是建立荧光筛选系统需要的时间较长，因为必须选择合适的荧光报告分子，这项工作成本高、耗时长，其次是荧光信号只代表了hit的亲和性，没有化合物的化学信息，而化合物库中所含的杂质和降解产物经常呈现假阳性。近年来，使用质谱检测同时获得化学和生物学信息的方法非常普遍，可以降低假阳性和假阴性。使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测。这种方法会使很多未结合的化合物滞留在样品中，膜材料与蛋白和化合物的非特异性结合也会影响实验的准确性。另外有一种方法是把蛋白固定在柱子上作为固定相，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，但是所需要的洗脱溶剂与质谱的兼容性不好。
目前，选择凝血酶作为药物靶标，通过应用磁珠键合技术，建立基于磁珠分离的凝血酶抑制剂筛选的方法尚无人报道。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的在于提供一种工艺设计合理，采用磁性分离和化学信息采集(液质联用)技术，分析靶标蛋白结合物，用于药物抗血栓作用的筛选和评价的方法，本发明提供的方法，筛选效率高，筛选准确度高，对于新的抗血栓药物的筛选具有重要应用价值。
技术方案，为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，包括以下步骤：先应用化学键合技术在磁珠上键合靶标蛋白得到靶标蛋白键合磁珠，然后将未键合的靶标蛋白分离，将靶标蛋白键合磁珠和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱，然后对变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息，筛选出具有抗血栓作用的成分。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，孵育结束后先用PBS缓冲液清洗4次，变性清洗液为体积浓度50％的乙腈水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，将靶标蛋白键合磁珠和待筛选的药物在37℃下孵育70min。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，将靶标蛋白键合磁珠和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的pH在6.2～6.8内进行孵育。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，将靶标蛋白键合磁珠和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的的离子强度为10mM，pH在6.2～6.8内进行孵育。
本发明提供的一种基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，其包括以下步骤：
(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)清洗2～3次，每次次10～15min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)和50mg/ml NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺)，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4～6min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化磁珠，加入凝血酶溶液，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4～6min，移除键合剩下的上清液，得到凝血酶键合磁珠；
(3)称取灯盏细辛药材，加入甲醇回流提取，得提取液，过滤，取滤液，离心，取上清液，得灯盏细辛粗提物，备用；
(4)取灯盏细辛粗提物，加入步骤(3)制备得到的凝血酶键合磁珠，加入PBS缓冲液，放在振荡器上混匀，使溶液的离子强度为10mM，pH值为6.2，在37℃下孵育70min，然后放在磁铁上，使键合磁珠与溶液分开，先用PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析。
以上所述的一种基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法，液相条件为:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相A相为0.1％甲酸水–B相为乙腈，梯度洗脱：0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL。质谱条件:负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压－4.5kV喷雾气压379.21kPa，去簇电压－60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z 100-1500，二级质谱激活类型CID。
有益效果：本发明提供的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法具有以下优点：
本发明提供的基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法工艺设计合理，通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH和离子强度和变性清洗液。
本发明提供的筛选和评价方法能够用于大规模天然产物库或组合化学库的筛选，设备简单经济，适合于在早期开展对于抗血栓药物(包括化学合成药以及天然产物)的筛选和先导化合物的发现。与传统紫外筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应。同时，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所用试剂：
凝血酶(bovine plasma，sigma)、野黄芩苷(成都植标化纯生物技术有限公司)、磁性纳米粒(天津倍思乐色谱技术开发中心)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，sigma)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，sigma)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,sigma)。
实施例所用仪器：AB Sciex 5600Q-TOF高分辨质谱仪(AB Sciex公司)。
实施例1 凝血酶键合磁珠的制备
取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES溶液(pH为6)清洗两次，两次10min，在清洗后的磁珠上加入等体积的新鲜配制的EDC溶液和NHS溶液(50mg/ml)，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育30min。孵育后，把管子放在磁铁上4min，移除上清液，最后使用25mM MES溶液(pH为6)清洗两次，得到活化磁珠，备用。
分别取25、50、75、100μL活化磁珠各1份，加入200μL凝血酶(1mg/ml)溶液，震荡混合均匀，在室温孵育过夜。孵育后，把管子放在磁珠上4min，移除键合剩下的上清液，使用Bradford法测定其中蛋白含量。键合磁珠加入100μL0.5％BSA溶液震荡15min后移去清洗液，使用Bradford法测定其中蛋白含量。
并使用X光谱衍射、透射电镜、振动磁性测定仪、红外、粒径分布对凝血酶键合磁珠和空白磁珠进行性状表征。
X衍射的磁珠的主峰，如2.9706，2.5322，2.1008，1.7122，1.6146和1.4837，与标准Fe3O4XRD谱匹配。键合磁珠的最大饱和磁化程度(57.3emu·g-1)比空白磁珠的最大饱和磁化程度(79.4emu·g-1)小一点，是因为在键合磁珠表面有凝血酶包覆。
磁珠的磁性测定结果：键合磁珠的最大饱和磁化程度(57.3emu·g-1)比空白磁珠的最大饱和磁化程度(79.4emu·g-1)小一点，表明在键合磁珠表面包覆有凝血酶。
磁珠表面键合蛋白的定量结果：通过磁珠的数量不同，来确定凝血酶结合疗效与凝血酶恒定量的最优比例。结果表明：恒定凝血酶的量为80μl，75μl磁珠键合率最高。
磁珠的红外光谱图，凝血酶的红外光谱图和凝血酶键合磁珠的红外光谱图分析表明：凝血酶与磁珠键合后在1638cm-1出现的新的酰胺带，说明通过酰胺键连接产生共轭。
以上结果说明本发明得到的凝血酶键合磁珠符合要求。
实施例2 基于磁珠分离的抗血栓药物筛选方法的各因素研究
(1)以野黄芩苷为模型药物，对变性洗脱溶剂进行优化
取以上实施例1制备得到的10μL凝血酶键合磁珠，加入野黄芩苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和170μLPBS缓冲液(pH7.4)混合，孵育30min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，洗脱液进液相分析，最后，分别以体积浓度10％、30％、50％、70％和90％乙腈-水溶液(v/v)及体积浓度10％、30％、50％、70％和90％甲醇-水溶液(v/v)进行变性洗脱，分别取变性洗脱液进行液相分析。
(2)以野黄芩苷为模型药物，对孵育时间进行优化
取以上实施例1制备得到的10μL凝血酶键合磁珠，加入野黄芩苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和170μLPBS缓冲液(pH7.4)混合，在10、20、30、45、60、70、80min后孵育，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(3)以野黄芩苷为模型药物，对孵育温度进行优化
取以上实施例1制备得到的10μL凝血酶键合磁珠，加入野黄芩苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和170μLPBS缓冲液(pH7.4)混合，在25、30、37、40、45℃孵育70min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(4)以野黄芩苷为模型药物，对孵育pH值进行优化
取以上实施例1制备得到的10μL凝血酶键合磁珠，加入野黄芩苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和170μLPBS缓冲液(pH值分别为5.7，6.2，6.8，7.4，8.0)混合，在37℃孵育70min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(5)以野黄芩苷为模型药物，对孵育离子强度进行优化
取10μL凝血酶键合磁珠，加入野黄芩苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和170μLPBS pH6.2的缓冲液(离子强度分别为10mM、50mM、100mM、250mM、500mM)混合，在37℃孵育70min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(6)各因素筛选结果
(6.1)变性洗脱溶剂优化结果
清洗的目的在于排除没有键合或非特异性的化合物产生的干扰，本发明通过大量实验对不同的清洗次数进行考察，结果表明，先用PBS缓冲液清洗四次可以足够消除未键合的化合物。变性洗脱液可以将键合在磁珠上的凝血酶清洗下来，结果表明，50％(v/v)乙腈—水洗脱溶剂洗脱效率优于其它洗脱溶剂。
(6.2)离子强度和pH优化结果
因为磁珠与凝血酶的键合非共价作用主要是静电相互作用，离子强度和pH则具有重要意义。实验结果表明溶液的pH值在6.2～6.8范围内最适宜，凝血酶的等电点约为7.05，当溶液pH小于凝血酶的等电点，凝血酶键合磁珠表面带正电荷，有利于与带负电荷的灯盏花素(pKa 3.29)相互作用。另外PBS缓冲液的离子强度为10mM最佳。
(6.3)孵育反应时间和反应温度的条件优化考察结果
孵育时间的长短与温度的高低也是影响键和程度的重要因素，结果表明，在37℃下孵育70min磁珠与凝血酶的键合程度最高。
实施例3 灯盏细辛抗血栓成分的筛选
(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液清洗2次，每次次10min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化磁珠，加入凝血酶溶液，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4min，移除键合剩下的上清液，得到凝血酶键合磁珠；
(3)称取1g灯盏细辛粉末，加入50ml甲醇，回流2h，过滤，滤液13400rpm离心10min，吸取上清液，备用；
(4)取灯盏细辛粗提物和灯盏花素注射液50μl，加入50μl步骤(3)制备得到的凝血酶键合磁珠，补足PBS缓冲液至1ml，放在振荡器上混匀，使溶液的离子强度为10mM，pH值为6.2，在37℃下孵育70min，然后放在磁铁上，使键合磁珠与溶液分开，先用PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析(液相条件:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相A(0.1％甲酸-水)-B(乙腈)，梯度洗脱(0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B)，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL。质谱条件:负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压－4.5kV喷雾气压379.21kPa，去簇电压－60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z 100-1500，二级质谱激活类型CID)。
(5)通过在线液-质联用技术同时获得灯盏细辛活性化合物的化学信息，确定11种凝血酶抑制剂，其中有10种凝血酶抑制剂为首次报道，具体结果如表1所示。
表1单体化合物对凝血酶活性的抑制作用
a表示在200μM.抑制率小于10％
本发明提供的基于磁性分离的凝血酶抑制活性筛选方法，并用传统的活性筛选方法对筛选结果进行了验证，表明本发明提供的筛选方法结果准确可信。与传统的基于96孔板的凝血酶抑制剂筛选方法相比，本发明的优点是能够快速的发现活性化合物，筛选效率更高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。