一种基于单壁碳纳米角修饰电极的电化学酶传感器制备及应用的制作方法

本发明涉及电化学、电分析化学方面的化学修饰电极领域，以及电化学酶传感器领域。

背景技术：

1975年化学修饰电极的问世，突破了传统电化学只限于研究裸电极/电解液界面的范围，开创了从化学形态上人为控制电极表面结构的领域。化学修饰电极是由导体或半导体制作的电极，在电极表面涂敷了单分子的、多分子的、离子的或聚合物的化学物薄膜，借Faratary(电荷消耗)反应而呈现出此修饰薄膜的化学的、电学的或光学的性质。化学修饰电极丰富了电化学的电极材料，其变化奥妙无穷，电极由此带来的奇特效应及潜在的应用价值引起了人们广泛的研究兴趣，很快吸引了化学家从不同角度进行研究，推进了化学修饰电极的迅速发展。

目前电化学酶传感器已发展到第三代，具有简单便携、灵敏度高、检测范围广和检测限低等优点。其原理是以无媒介体的氧化还原蛋白质和酶的直接电化学行为为基础，以酶与电极之间的直接电子转移为检测特征的新型生物传感器，这种传感器无需引入媒介体，与氧及其他电子媒介体无关，因此制作过程相对简单，无外加有毒性物质，是当前最理想的生物传感器。近年来以氧化还原蛋白质直接电化学为基础的第三代无媒介体传感器成为电化学生物传感器研究领域的最重要的发展方向之一。

碳材料具有低成本、宽电位窗口、相对惰性的性能、电催化作用等特点，碳材料电极在电化学方面已经得到了广泛关注。单壁碳纳米角(SWCNHs)是一种新型导电单壁碳纳米管材料，具有大的比表面积和较大的内部空间，气体和液体都很容易浸透到其内部，这些奇异的特性使得它非常适合于用作化学反应的催化剂。目前SWCNHs被广泛的应用在吸附和存储气体、催化剂载体、药物载体、气体传感器、生物传感器和电化学储能等方面。

技术实现要素：

本发明克服了前两代酶传感器的诸多问题，例如线性范围窄、受测定体系的限制、使用介体制作电极过程复杂，且介体有可能污染电极等，通过将肌红蛋白固定在SWCNHs修饰电极表面，制备出第三代电化学生物传感器。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

1. 一种基于单壁碳纳米角修饰电极的电化学酶传感器制备，其特征在于，包括以下步骤：

(1)离子液体修饰碳糊电极的制备

按一定的比例将石墨粉、离子液体和液体石蜡充分混合研磨后，装入内插细铜丝的玻璃电极管内压实，即得离子液体修饰碳糊电极(CILE)，使用前在抛光纸上打磨至镜面；

(2)修饰电极的制备

采用滴涂法将单壁碳纳米角(SWCNHs)修饰在CILE表面，室温晾干后在其表面进一步滴涂肌红蛋白(Mb)，室温晾干后将固定膜壳聚糖(CTS)修饰在电极Mb/SWCNHs/CILE表面，室温晾干待用。按照同样方法制备CTS/CILE、CTS/SWCNHs/CILE、CTS/Mb/CILE等不同修饰电极。

所述的离子液体修饰碳糊电极，其特征在于，离子液体为N-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)，其与石墨粉的质量均为0.8 g，液体石蜡的用量为250 µL。

所述的修饰电极，修饰材料SWCNHs的用量和浓度分别为6.0 μL和1.0 mg·mL^-1；Mb的用量和浓度分别为6.0 μL 和 15 mg·mL^-1；CTS的用量和浓度分别为8 μL 和 0.5 mg·mL^-1 (0.5%醋酸中)。

所述的修饰电极，利用扫描电子显微镜(SEM)表征电极修饰材料的微观形貌结构。

所述的修饰电极，利用傅里叶红外光谱(FT-IR)研究Mb是否发生构象变化。

采用循环伏安法(CV)考察了Mb在CTS/SWCNHs/CILE修饰电极上的直接电化学行为。

根据上述的Mb的直接电化学行为，其电解质溶液为pH 3.0 的PBS缓冲溶液，扫速为100 mV s^-1。

一种基于单壁碳纳米角修饰电极的电化学酶传感器的应用，在于利用所构建的电化学酶传感器对三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠(NaNO2)实际样品进行电催化还原检测。

根据上述的电化学酶传感器应用，将pH 3.0 的PBS缓冲溶液作为空白溶液，采用CV电化学技术测试酶传感器的实际应用性能，扫速为100 mV s^-1。

附图说明

图1为不同材料的SEM图，A、B为不同放大尺寸下SWCNHs，(C)在CILE电极表面的SWCNHs，(D)为在SWCNHs/CILE修饰电极表面的Mb膜。

图2为 (a) Mb，(b)Mb和SWCNHs混合物的红外光谱图。

图3为不同修饰电极的循环伏安曲线 (a) CILE; (b) CTS/CILE; (c) CTS/SWCNHs/CILE; (d) CTS/Mb/CILE; (e) CTS/Mb/SWCNHs/CILE (pH 3.0 PBS缓冲溶液，扫速为100 mV s^-1)。

图4为修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图（a 到 i 为0.9, 4, 10, 17, 25, 34, 41, 47, 51 mmol L^-1） (插图：还原电流大小与TCA的浓度之间的关系曲线)。

图5为修饰电极在不同浓度NaNO2存在下的循环伏安图a 到 g 为0.00, 0.04, 0.14, 0.34, 0.54, 0.74, 0.78 mmol L^-1） (插图：还原电流大小与NaNO2的浓度之间的关系曲线)。

具体实施方式

下面给出的实施例对本发明作进一步说明，但不超出本发明保护范围的限制。

实施例1

电极修饰材料的电镜表征

图1A和B所示展示了不同放大尺寸下的单壁碳纳米角，图1C为球状单壁碳纳米角均匀的分散在CILE电极表面，其直径约为80-100 nm。图1D为修饰在SWCNHs/CILE电极表面的Mb薄膜。纳米角由于具有大的比表面积，故在其表面有利于进一步固定氧化还原蛋白质。

实施例2

红外光谱分析

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)是一种有效的研究血红素蛋白质是否发生构象变化的工具。酰胺I (1700-1600 cm^-1)和IIII (1620-1500 cm^-1)的形状可以反应蛋白质多肽链的二级结构。如图2a所示，Mb自身的酰胺I和酰胺II的吸收带分别位于1647.7 cm^-1 和 1547.8 cm^-1，而Mb在SWCNHs复合膜内的吸收带分别位于1648.2 cm^-1 和 1532.5 cm^-1 (图2b)，吸收峰位置变化不大。结果显示Mb与SWCNHs混合后仍然保持了其原本的结构，没有发生变性。

实施例3

Mb在修饰电极上的直接电化学

图3为不同修饰电极在pH 3.0 的PBS缓冲溶液中的循环伏安图。CILE (曲线 a), CTS/CILE (曲线 b) 和 CTS/SWCNHs/CILE (曲线c)修饰电极上都没有出现检测信号，说明这些修饰电极表面并没有发生电化学反应。然而当Mb固定到CILE表面后，在CTS/Mb/CILE (曲线d)电极上出现不对称的氧化还原峰，说明Mb和CILE之间的电子转移速度缓慢。而CTS/SWCNHs/Mb/CILE (曲线e)明显峰型更加对称，氧化还原峰电流也随之增加，其还原峰电流增加到55.18 µA，是曲线d上还原峰电流的1.5倍。多扫循环伏安表明其氧化还原峰几乎不变。说明高导电性SWCNHs的存在可以构建一种快速的电子传递方式，加快Mb的直接电子转移速率，实现Mb在修饰电极表面上的直接电化学反应，快速方便的实现Mb的电化学活性中心和电极表面之间的直接电子传递。还原峰电位(Epc)与氧化峰电位(Epa)值分别为-0.285 和 -0.190 V (曲线 e)，峰电位差(△Ep)和式电位(E^0')分别为95 mV 和 -0.237 V (vs. SCE)，表现出氧化还原蛋白质内血红素辅基Fe(III)/Fe(II)氧化还原电对的特征电化学行为。

实施例4

Mb修饰电极对TCA的电催化

实验探究了CTS/Mb/SWCNHs/CILE电催化还原TCA的催化效果，结果如图4所示。在pH 3.0的PBS缓冲溶液中加入TCA后，在-0.223 V处检测到还原峰逐渐增加，同时氧化峰逐消失，且随着TCA加入量的增大，在-0.496 V出现新的还原峰，还原峰电流明显增大而氧化峰逐渐减少，这是典型的TCA还原过程。TCA的浓度在0.9 - 51.0 mmol/L的范围内时，还原峰电流和TCA的浓度大小成良好的线性关系，得出线性回归方程为：Ipc (μA) = 2.635 C (mmol L^-1) + 8.19 (γ = 0.989)，检测限为0.3 mmol L^-1 (3σ)。当TCA的浓度大于 51.0 mmol L^-1时，峰电流基本不变，出现一个平台，表明为典型的Michaelis-Menten动力学过程。通过计算可得TCA催化反应的表观米氏常数为43.16 mmol L^-1。因此CTS/Mb/SWCNHs/CILE对TCA的催化效果良好，这是由于CTS/SWCNHs复合膜具有良好的生物相容性，使得Mb与修饰电极之间的电子转移速率加快从而加强了对TCA的催化效果。

实施例5

Mb修饰电极对NaNO2的电催化

按照上述实验方法，研究了CTS/Mb/SWCNHs/CILE对NaNO2的电催化行为，结果如图5所示，由曲线a到曲线g可观察到在-0.703 V左右还原峰电流明显增大，且氧化峰随着NaNO2 浓度增加逐渐减小甚至消失。还原峰电流和NaNO2的浓度在0.04 - 0.74 mmol L^-1范围内成良好的线性关系，线性回归方程为Ipc (µA) = 91.994 C (mmol L^-1) + 3.058 γ = (0.998)，检测限为0.13 mmol L^-1 (3σ)。当 NaNO2 的浓度大于 0.74 mmol L^-1时，峰电流基本不变，出现一个平台，表明为典型的Michaelis-Menten动力学过程，进一步求解出表观米氏常数为0.325 mmol/L。匀的分散在CILE电极表面，其直径约为80-100 nm。图1D为修饰在SWCNHs/CILE电极表面的Mb薄膜。纳米角由于具有大的比表面积，故在其表面有利于进一步固定氧化还原蛋白质。