本发明涉及烟草有益活性成分的提取和测定技术领域，尤其涉及一种同时提取并测定烟草西柏三烯二醇、维生素E、植物甾醇的方法。
背景技术：
西柏三烯二醇(CBT-二醇)是烟草腺毛分泌物的主要化学成分，也是影响卷烟香气品质的重要前体物质。国内外研究表明，CBT-二醇还具有抗肿瘤、神经保护剂、杀虫等多种生物活性。维生素E和甾醇均是在医药、保健品、食品领域得到广泛应用的植物天然活性成分，也是影响烟草品质和安全性的重要化学成分。对于传统卷烟，在烟支燃吸过程中，维生素E、甾醇仅有少部分直接转移到烟气中，大部分裂解合成苯、苯并芘等烟气有害成分，是烟草安全性的不利因素。但对于无烟气烟草制品，由于其通过口含消费，烟草中的维生素E、甾醇就成为了对人体有益的化学成分。因此，准确而快速测定烟草CBT-二醇、维生素E、甾醇含量，不论对于传统烟草制品还是正在迅猛发展的无烟气烟草制品原料的筛选和品质评价都具有重要支撑作用。
陈开波等(2005)研究了毛细管气相色谱法测定烟草维生素E的技术，刘悍等(2010)、马戎等(2013)分别探索了液相色谱测定烟草维生素E的条件。张峻松等(2007)、刘宇欣等(2010)分别研究了气相色谱法测定烟草不同甾醇的方法，薛芳等(2012)、戚大伟等(2013)、许燕娟(2006)等分别建立了采用气质联用仪测定烟草不同甾醇的实验条件。
根据国内外资料报道，目前烟草CBT-二醇、维生素E、植物甾醇测定均是独立进行的，且测定过程中存在前处理方法繁琐，有机溶剂消耗较多的缺点。目前还未见有关同时提取、测定CBT-二醇、维生素E、甾醇的报道。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的烟草有益活性成分测定均是独立进行且前处理方法繁琐，有机溶剂消耗较多的技术问题，本发明的目的在于提供一种同时提取并测定烟草CBT-二醇、维生素E、植物甾醇的方法。
本发明采取的技术方案为：
一种同时提取并测定烟草西柏三烯二醇、维生素E、植物甾醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取、皂化目标化合物：称取粉碎后的烟草样品，置于具塞离心玻璃管中，加入维生素C作为抗氧化剂，加入95％乙醇，放入恒温超声提取仪中，初次超声提取，使维生素C溶解，取出离心管，再加入含氢氧化钾的95％乙醇溶液作为提取剂、皂化剂，放入恒温超声提取仪中，在恒温超声条件下二次超声提取、皂化目标化合物；
(2)萃取：提取完成后，加入正己烷作为萃取剂，振荡、混匀，再加入8倍皂化剂体积的去离子水，震荡、离心后，溶液分层，CBT-二醇、维生素E、植物甾醇就转移到上层正己烷溶液中，皂化剂及水溶性杂质就转移到下层水溶液中；
(3)过滤：取正己烷层加入无水硫酸钠，过有机滤膜，注入气相进样瓶中，待测。
进一步的，所述步骤(1)烟草样品为干燥粉碎后烟草样品，烤烟、晒烟、香料烟、雪茄烟、白肋烟、野生烟的烟草叶片、花组织或器官样品，其中烟草叶片又包括调制后叶片及烟草不同生长时期鲜烟叶叶片。
进一步的，所述步骤(1)中初次超声提取的恒温超声条件为50-60℃超声提取10-15mim。
进一步的，所述步骤(1)中维生素C加入量(g)与称样量的比值为1.5:1。
进一步的，所述步骤(1)分别加入95％乙醇、95％乙醇-氢氧化钾溶液的体积比为1:1，加入95％乙醇和95％乙醇-氢氧化钾总体积与称样质量按照ml/g的液料比比值为40:1。
进一步的，所述步骤(1)95％乙醇-氢氧化钾溶液的浓度为2mol/L。
进一步的，所述步骤(1)中二次超声提取的恒温超声条件为60℃超声提取40mim。
进一步的，所述步骤(3)过滤工艺中无水硫酸钠和正己烷的质量体积比为1g/50ml。
进一步的，所述步骤(3)中有机滤膜的滤孔为0.22um。
一种检测烟草西柏三烯二醇、维生素E、植物甾醇的方法，所采用的仪器条件如下：
气相色谱条件：采用DB-5ms型30m*0.25mm*0.25um的毛细管柱；进样量1μL，分流比2:1；载气：He；流速：1.2ml/min；进样口温度：280℃；程序升温条件：120℃，保持4min，30℃/min的速率升至230℃，保持1min，再以15℃/min的速率升至250℃保持1min，最后以30℃/min的速率升至290℃保持14min，后运行5min；
质谱条件：EI离子源温度：230℃；接口温度：280℃；四级杆温度：230℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围40–550amu；SIM离子检测：CBT-二醇的特征碎片离子质荷比为81、95、107；维生素E的特征碎片离子质荷比为165、430、205；菜油甾醇的特征碎片离子质荷比为289、382、400；豆甾醇的特征碎片离子质荷比为255、271、412；谷甾醇的特征碎片离子质荷比为303、329、414；外标法定量。
本发明的有益效果：
该方法建立了超声波辅助条件下，同时皂化、提取烟草CBT-二醇、维生素E、植物甾醇所需的温度、试剂、料液比、时间条件，优化了SIM法同时测定烟草CBT-二醇、维生素E、植物甾醇的气相色谱和质谱条件。选用弱极性毛细管柱分析，获得的图谱整体性好，峰数目多且分离度好，方法步骤简单，溶剂消耗少，适用于批量检测。
本发明实现了烟草CBT-二醇、维生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇的同时提取、检测，检测步骤简单，溶剂消耗少，适用于烟草样品活性成分的批量检测，环保、安全，效率高，提高目标物的检出效率；检测灵敏度高，同时可获得更高的灵敏度和更低的检出限，重现性和稳定性好。
本发明使目标化合物的提取、皂化以及与皂化剂和水溶性杂质的分离在一根离心管中即可完成，提高了烟草活性成分的检测效率。
附图说明
图1为样品测试液总离子流图I；
图中，2、CBT-二醇；4、维生素E；5、菜油甾醇；6、豆甾醇；7、谷甾醇。
具体实施方式
(1)目标化合物提取
称取粉碎后的烟草粉末样品，置于具塞离心玻璃管中，加入维生素C作为抗氧化剂，加入氢氧化钾的乙醇溶液作为提取、皂化剂，放入恒温超声提取仪中，在恒温超声条件下提取、皂化目标化合物，提取完成后，加入正己烷作为萃取剂，振荡、混匀，再加入8倍皂化剂体积的去离子水，震荡、离心后，溶液分层，CBT-二醇、维生素E、植物甾醇就转移到上层正己烷溶液中，皂化剂及水溶性杂质就转移到下层水溶液中。取正己烷层加入无水硫酸钠，过0.22um有机滤膜，注入气相进样瓶中，待测。
(2)仪器条件
气相色谱条件：毛细管柱为DB-5ms(30m*0.25mm*0.25um)；进样量1μL，分流比2:1；载气：He；流速：1.2ml/min；进样口温度：280℃；程序升温条件：120℃，保持4min，30℃/min的速率升至230℃，保持1min，再以15℃/min的速率升至250℃保持1min，最后以30℃/min的速率升至290℃保持14min，后运行5min。
质谱条件：EI离子源温度：230℃；接口温度：280℃；四级杆温度：230℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围40–550amu。SIM离子检测：CBT-二醇(81、95、107)、维生素E(165、430、205)、菜油甾醇(289、382、400)、豆甾醇(255、271、412)、谷甾醇(303、329、414)，外标法定量。
(3)工作曲线
准确配制CBT-二醇、维生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇标准工作溶液，各化合物工作曲线的浓度分别为：CBT-二醇13.31μg/mL、26.61μg/mL、53.24μg/mL、79.85μg/mL、106.5μg/mL、133.1μg/mL；维生素E2.08、4.16、6.24、8.32、10.4、12.48ug/mL；菜油甾醇6.4、12.8、19.2、25.6、32、38.4ug/mL；豆甾醇3.2576、6.5152、9.7728、13.0304、16.288、19.5456ug/mL；谷甾醇2.448、4.896、7.344、9.792、12.24、14.688ug/mL。
将以上标准工作溶液分别进样，分别获得CBT-二醇、维生素E、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇浓度(Y)与响应值(X)的线性回归方程参数及决定系数见下表1，由下表看出，目标化合物工作曲线决定系数均大于0.999，线性关系良好，符合定量分析要求。
表1为目标化合物工作曲线参数及决定系数
(4)仪器检出限、方法定量下限
将CBT-二醇、维生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇标准工作溶液逐步稀释检测，获得的各化合物以信噪比(S/N)为3计算仪器检出限，以信噪比(S/N)为10计算的方法定量下限见下表2。
表2检测指标仪器检出限、方法定量下限
(5)回收率及精密度试验
如表3所示，通过空白标准添加获得的CBT-二醇、维生素E、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇的平均回收率分别为103％、88.7％、101％、101％、105％，平均相对标准偏差分别2.29％、3.32％、3.09％、3.36％，为说明方法准确度、精密度均较高，符合定量分析要求。
表3为CBT-二醇、维生素E和植物甾醇加标回收率及相对标准偏差
(6)实施例1
称取0.1g调制后烤烟烟末样品，置于具塞离心玻璃管中，加入0.2g维生素C，混匀，加入2mL95％乙醇，放入恒温超声提取仪中，60℃超声提取10mim，使维生素C溶解，取出离心管，再加入2M的氢氧化钾-95％乙醇溶液2mL，继续放入恒温超声提取仪中，60℃超声提取40mim，冷却，加入5mL正己烷，16mL去离子水，震荡、离心；取正己烷层加入0.1g无水硫酸钠，过0.22um有机滤膜，注入气相进样瓶中，待测。如图1，为样品测定液的液相色谱图。
(7)实施例2
称取称取0.1g调制后香料烟烟叶粉末样品，置于具塞离心玻璃管中，以下操作步骤如实施实例1。
(8)实施例3
称取称取0.1g干燥后的香料烟烟花样品，置于具塞离心玻璃管中，以下操作步骤如实施实例1。
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。