一种用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的制作方法

本发明属于材料技术领域，涉及一种具有过氧化氢类酶活性的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料，能催化H₂O₂氧化盐酸克伦特罗和3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)产生显色反应，可应用于基层实验室或现场快速检测饲料、食品中痕量盐酸克伦特罗。

背景技术：

盐酸克伦特罗(clenbuteerol,CLB)是一种平喘药，为β₂受体激动剂，属于拟肾上腺素类药物，临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。1984年美国一家公司发现高于治疗剂量5～10倍以上(>1μg/kg﹒d)CLB添加于饲料用于喂动物可显著促进动物生长、改善胴体品质、提高瘦肉率,于是欧美等国开始将CLB广泛用于动物饲料。20世纪80年代后期,我国也开始向饲料企业和养殖户推广将该物质添加至饲料中。CLB在体内消除半衰期25～39h，极易在动物组织中蓄积残留。人食残留盐酸克伦特罗的动物产品，如肉、肝、蛋、奶等，轻者肌肉兴奋性增强,重者肌肉震颤、痉挛，头痛头晕，呕吐和腹泻等，孕妇中毒则导致癌变、胎儿致畸等严重危害。因此，1987年欧盟、美国等宣布禁止CLB作为兽用饲料添加剂,我国1997年也明确宣布禁止其在饲料中添加使用。

目前，动物源食品中CLB的检测方法主要有感官识别(闫红军等,动物医学进展,2003,24(5):127；李杰.中国饲料,2003,4:31-32)、胶体金免疫层析试纸条法(李超辉等，食品科学，2013，34(12):114-118)、色谱法(Guanglei Li,J Chromatogr.A,2016,1456:242-248；Yiwei Tang,Food Chemistry,2016,190:952-959；Cun Li，J Chromatogr.A,2010,1217:7873-7877；Luca Amendola,J Chromatogr.B,2002,773:7-16)、酶联免疫分析(Hong-Cai ZHANG,Chinese J Analytical Chemistry,2012,40(6):852-856；李超辉等，食品科学，2013，34(14):182-186)、荧光免疫分析法(Jingyue Xu,Food Control,2014,46:67-74)电化学免疫分析等(Rong-Ning LIANG,Chinese J Analytical Chemistry,2012,40(3):354-358；Ling Wang,Food Chemistry,2014,164:113-118；Dan Chen,Biosensors and Bioelectronics,2016,80:525-531)。感官识别仅起初步判断作用；试纸条法虽然简单快速，但假阳性率高，不准确；色谱法检测灵敏度高，但设备昂贵、复杂，对操作人员技术要求高，过程烦琐，检测时间长；酶联免疫分析、荧光免疫分析和电化学免疫分析等三种方法的操作简便快速、灵敏度高，但荧光分析仪价格较高，电化学免疫分析的电极制备工艺复杂，成本较高，且酶联免疫分析和荧光免疫分析涉及天然酶的标记，易引起酶活力下降，加上天然酶价格昂贵，难保存，易失活，限制了这三种方法的实际应用。

近年来，一种基于纳米粒子模拟酶比色原理的新型快速检测技术迅速发展，并因其具有检测灵敏度高、选择性好、无需配套仪器、操作简便、适于现场分析等一系列优点，在环境和食品领域现场筛查及应急处置等方面展现出广阔的应用前景。目前已发现应用于比色分析的纳米粒子模拟酶主要有贵金属纳米粒子(Jiang H,Analyst,2012,137(23):5560–5564；He W W,Biomaterials,2011,32(4):1139–1147)、金属氧化物纳米粒子(Wan Y,Biosen.Bioelectron.,2012,33(1):69–74；Mu J S,Chem.Commun.,2012,48(19):2540–2542)、碳基纳米粒子(Liu S，Anal.Methods,2011,3(7):1475–1477；Song Y J,Adv.Mater.,2010,22(19):2206–2210；Song Y，Chem.Eur.J.,2010,16(12):3617–3621)等，其中磁性氧化铁纳米粒子因催化活性高，易分离回收、易再生而备受关注(Gao等,Nat.Nanotechnol.2007,2(9):577-583；Ding等，Analytical Chemistry，2012，82：5897-5899；聂冬霞，华东师范大学，2011；高原，吉林大学，2012)。但裸露的Fe₃O₄容易团聚、易失活，易引起催化活性下降(梁敏敏等，东南大学学报，2011，30：105-107；郭祖鹏等，磁性材料及器件，2012，43：9-19)。因此，制备分散稳定性高、使用寿命长及类酶活性高的Fe₃O₄的纳米粒子具有十分重要的意义。徐琰清用SiO₂包裹Fe₃O₄制备了四氧化三铁/二氧化硅复合颗粒，有效地阻止了Fe₃O₄粒子之间的团聚，增加了其分散稳定性(徐琰清，华东师范大学，2011)；Zhang等采用普鲁士蓝对磁性纳米粒子表面进行修饰来提高其催化活性(Zhang X,et al.J Mater.Chem.,2010,20:5110-5116)；Su等人(Su等,Analytical Chemistry,2012,84:5753-5758)和Shi等人(Shi等,Chem.Commun.,2011,47:10785-10787)通过贵金属掺杂的磁性纳米粒子来提高其催化活性，如ZnFe₂O₄、CoFe₂O₄纳米粒子。

众所周知，介孔材料具有很多独特的性质，如大的比表面积，可控的孔径和孔道结构，良好的电子传输性能；蒙脱土(montmorillonite，MMT)由两层Si-O四面体和一层A1-O八面体组成的层状结构，层间可交换阳离子，交换的阳离子进入蒙脱土后可撑开蒙脱土的层间距，增大蒙脱土的比表面积。不同的掺插剂与蒙脱土结合形成的新型材料具有不同酸度、层间距、吸附性和催化性，本发明针对裸露的Fe₃O₄容易团聚、易失活，易引起催化活性下降的问题，基于介孔硅材料和蒙脱土材料高比表面积、良好的电子传输性能、具有酸性，以及过氧化物酶底物3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)的碱性，发明一种易分离回收、分散稳定性高、使用寿命长及类酶活性高的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料，应用于基层实验室或现场快速检测饲料、食品中痕量盐酸克伦特罗。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种易分离回收、电子传输性能好、分散性好、类酶活性高、稳定、使用寿命长的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料即Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS，可应用于基层实验室或现场快速检测饲料、食品中痕盐酸克伦特罗。

本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料为Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS，是通过以下步骤来制备的：(1)将5～15mmol FeCl₃·6H₂O和5～7mmol FeSO₄·7H₂O溶于100～150mL蒸馏水，超声20～30min，然后加入1.0～1.5g分散剂和0.1～0.2g NaOH，超声10～20min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入恒温电热烘箱中反应6～8h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，真空干燥，得到Fe₃O₄纳米粒子；(2)将0.5～1.0g Fe₃O₄和0.5～2.0g十六烷基三甲基溴化铵分散于50～100mL乙醇-水溶液，超声20～30min除氧，加入0.1～0.2g NaOH，超声5～10min，然后在超声条件下缓慢滴加2～4mL四乙氧基硅烷溶液，继续超声5～10min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入恒温电热烘箱中反应6～8h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，再置于管式炉中在氮气保护下烘烧6～8h除去表面活性剂，得到磁性多孔硅纳米粒子即Fe₃O₄@mSiO₂；(3)将0.5～1.0g钠基蒙脱土(MMT)分散于40～100mL蒸馏水中，超声浸润30～60min得到蒙脱土乳液；将1.0～2.0g Fe₃O₄@mSiO₂分散于15～30mL无水乙醇，在搅拌下快速加入蒙脱土乳液，于恒温水浴中应2～3h，然后加入0.2～0.5g十二烷基硫酸钠(SDS)，继续反应6～8h，离心过滤，产物依次用水、无水乙醇洗涤2～3次，真空干燥，得到磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料即Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS。

根据本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的进一步特征，所述步骤(1)中，FeSO₄·7H₂O与FeCl₃·6H₂O的摩尔比为1:2，分散剂为聚乙二醇200，聚乙二醇400，聚乙二醇600，聚乙二醇2000。

根据本发明所述的制备方法的进一步特征，所述步骤(1)中，恒温电热烘箱的温度为100～120℃，用10％乙醇水溶液洗涤的程度为洗至中性，真空干燥的温度为60～70℃，真空干燥的时间20～24h。

根据本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的进一步特征，所述步骤(2)中，Fe₃O₄与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:1～1:2，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为4:1。

根据本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料，所述步骤(2)中，所述恒温电热烘箱的温度为70～80℃，用10％乙醇水溶液洗涤的程度为洗至中性，烘烧温度为150℃。

根据本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的进一步特征，所述步骤(3)中，蒙脱土与Fe₃O₄@mSiO₂的质量比为1:4，蒙脱土与SDS的质量比为2:1～3:1。

根据本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的进一步特征，所述步骤(3)中，所述搅拌为高剪切乳化机搅拌，搅拌速度为500～600r/min，恒温水浴的温度为50～60℃，真空干燥的温度为60～70℃，真空干燥的时间至恒重。

本发明所述的用于快速检测盐酸克伦特罗的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料具有以下有益效果：

(1)制备过程简单，反应条件温和、易于控制；

(2)该纳米材料产品分散性好(团聚少)、稳定性好(多孔硅蒙脱土复合纳米材料制备后分别放置0天，15天，30天后用于催化反应，各催化溶液的吸光值基本一致)、使用寿命长(循环使用12次，其催化效果没有发生明显变化)；

(3)该纳米材料产品具有磁性、多孔性，易分离回收，电子传输性能好；

(4)该纳米材料产品具有类过氧化氢酶活性，且催化活性高(检出限达1.0×10^-8mol/L)；

(5)该纳米材料可应用于基层实验室或现场快速检测饲料、食品中痕量盐酸克伦特罗。

附图说明

图1是本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的红外光谱图。图中a是Fe₃O₄；b是Fe₃O₄@mSiO₂；c是Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS。

图2是本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的扫描电镜图。图中，A是Fe₃O₄@mSiO₂；D是Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS。

图3是本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的磁分离图。

图4是本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料使用重现性结果图。

图5本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料过氧化氢酶活性试验图。图中，a曲线是Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS+TMB+H₂O₂；b曲线是H₂O₂+TMB；c曲线是Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS+TMB。

图6是本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的稳态动力学参数结果图。

图7是本发明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS与Fe₃O₄@mSiO₂的酶活性强弱对比图。

图8本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料用于比色检测痕量盐酸克伦特罗的原理。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明不限制于这些实施例。

实施例1：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的制备

本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将2.7g FeCl₃·6H₂O和1.39g FeSO₄·7H₂O溶于100mL蒸馏水，超声20min，然后加入1.0g聚乙二醇400和0.1g NaOH，超声10min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入100℃恒温电热烘箱中反应6h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，70℃真空干燥20h，得到Fe₃O₄纳米粒子；(2)将0.5g Fe₃O₄和1.0g十六烷基三甲基溴化铵分散于50mL 80％乙醇水溶液，超声20min除氧，加入0.1g NaOH，超声5min，然后在超声条件下缓慢滴加2mL四乙氧基硅烷溶液，继续超声10min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入70℃恒温电热烘箱中反应6h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，再置于150℃管式炉中在氮气保护下烘烧6h除去表面活性剂，得到磁性多孔硅纳米粒子(Fe₃O₄@mSiO₂)；(3)将0.5g钠基蒙脱土(MMT)分散于40mL蒸馏水中，超声浸润30min得到蒙脱土乳液；将2.0g Fe₃O₄@mSiO₂分散于15mL无水乙醇，采用高剪切乳化机搅拌，在500r/min搅拌速度下快速加入蒙脱土乳液，于60℃恒温水浴中应2h，然后加入0.25g十二烷基硫酸钠(SDS)，继续反应6h，离心过滤，产物依次用水、无水乙醇洗涤3次，70℃真空干燥至恒重，得到磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料(Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS)。

实施例2：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的制备

本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将3.78g FeCl₃·6H₂O和1.95g FeSO₄·7H₂O溶于150mL蒸馏水，超声30min，然后加入1.5g聚乙二醇2000和0.2g NaOH，超声20min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入120℃恒温电热烘箱中反应8h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，60℃真空干燥24h，得到Fe₃O₄纳米粒子；(2)将1.0g Fe₃O₄和2.0g十六烷基三甲基溴化铵分散于100mL 80％乙醇水溶液，超声30min除氧，加入0.2g NaOH，超声10min，然后在超声条件下缓慢滴加4mL四乙氧基硅烷溶液，继续超声10min，混合物转移至内衬有聚四氟乙烯的不锈钢水热反应釜中，密封，放入80℃恒温电热烘箱中反应8h，产物用10％乙醇水溶液洗涤，再置于150℃管式炉中在氮气保护下烘烧8h除去表面活性剂，得到磁性多孔硅纳米粒子(Fe₃O₄@mSiO₂)；(3)将1.0g钠基蒙脱土(MMT)分散于100mL蒸馏水中，超声浸润60min得到蒙脱土乳液；将4.0g Fe₃O₄@mSiO₂分散于30mL无水乙醇，采用高剪切乳化机搅拌，在600r/min搅拌速度下快速加入蒙脱土乳液，于50℃恒温水浴中应3h，然后加入0.4g十二烷基硫酸钠(SDS)，继续反应8h，离心过滤，产物依次用水、无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥至恒重，得到磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料(Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS)。

实施例3：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的红外表征

将实施例1制备得到的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料(Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS)进行红外表征，如图1所示。波数为580cm^-1为Fe–O的特征吸收峰(a曲线)，3429和1635cm^-1为–OH的特征吸收峰。制备的Fe₃O₄@mSiO₂(b曲线)在波数为580cm^-1的吸收峰，吸收强度减小，同时在1088cm^-1出现强的Si–O–Si特征峰，与曲线a比较，–OH的特征峰由3429cm^-1向高频位移为3445cm^-1，说明SiO₂成功地包覆在Fe₃O₄表面，但b曲线出现弱的–CH₃，CH₂特征峰(2923，2850，1470，1382cm^-1)，表明模板剂CTAB没有完全除去。制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS(c曲线)，在波数为580cm^-1的吸收峰，吸收强度进一步减小，1036的强吸收峰分别为Si–O特征峰，与b曲线相比，Si–O吸收峰发生位移，–OH的吸收峰由3445cm^-1向高频位移为3636，3455cm^-1，说明蒙脱土成功地包覆在Fe₃O₄@mSiO₂表面，同时c曲线出现1734cm^-1和1222cm^-1强吸收峰为SDS上的S＝O、S–O伸缩振动峰，与b曲线相比，–CH₃，CH₂特征峰(2923，2850，1470，1382cm^-1)吸收强度增大，说明SDS成功插层到蒙脱土里。

实施例4：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的多孔性和分散性

扫描电镜检测：将实施例1制备得到的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料通过扫描电镜进行观察，如图2所示。Fe₃O₄@mSiO₂(图2A)形貌为排列有序的链结球，平均粒径分布为30～40nm，表面粗糙，分散性良好，说明二氧化硅层能够有效阻止Fe₃O₄团聚；Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS(图2D)形貌为规则的球形，平均粒径分布为200～300nm，表面粗糙，多孔，比表面积大，经计算得到的BET表面积为680cm²/g，总孔体积为0.45cm³/g，球与球之间链结少，分散性好，说明蒙脱土能够进一步改善材料的团聚情况，提高材料的分散性。

实施例5：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的磁性和回收使用重现性

磁性试验：将实施例1制备得到的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料分散于水中，涡旋1分钟，用磁铁进行分离，结果见图3，表明制备的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料具有磁性，通过磁铁易于磁分离、回收。

在30℃的水浴中，将30mg新制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS用于催化(3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)+200μL 2mg/mL TMB+300μL 400μM H₂O₂)混合溶液10min，然后通过磁铁回收Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS，同时用紫外可见分光光度计测定反应溶液在652nm的吸光度。回收的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS依次用水、乙醇洗涤3次，70℃真空干燥至恒重，再用于催化(3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)+200μL 2mg/mL TMB+300μL 400μM H₂O₂)混合溶液，如此循环使用12次，结果见图4。Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS循环使用12次，反应溶液在652nm的吸光值没有发生很大的改变，循环使用7次，吸光度的相对标准偏差为1.9％，循环使用12次，吸光度的相对标准偏差为5.5％，说明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料稳定性和重现性好，可回收利用。

实施例6：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的过氧化氢酶活性

选择实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS纳米材料进行过氧化氢酶活性试验。

取3支试管分别加入3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)，然后在a号试管中加入300μL 200μM H₂O₂、30mg Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS和200μL2mg/mL TMB；b号试管中加入300μL 200μM H₂O₂和200μL 2mg/mL TMB；c号试管中加入200μL 2mg/mL TMB和30mg Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS；最后将a、b、c号试管用超纯水定容至4.00mL，室温反应10min后进行紫外光谱扫描，结果如图5。b管和c管为无色溶液，在400nm到750nm之间几乎呈一条直线，说明室温下H₂O₂和TMB反应慢，Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS不能催化溶液中的溶解氧氧化TMB；c号试管的溶液呈现蓝色，在652nm左右出现TMB氧化物的特征吸收峰，说明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS能催化H₂O₂氧化TMB，具有过氧化氢模拟酶活性。

实施例7：本发明所述的磁性多孔硅蒙脱土复合纳米材料的过氧化氢模拟酶的动力学参数

采用实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS纳米材料进行以下实验。

固定底物TMB的浓度不变，改变H₂O₂的浓度。将200μL 2mg/mL TMB和30mg Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS分别加到3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)，摇匀，再分别加入300μL不同浓度(100～500μM)H₂O₂，30℃水浴反应，测定反应体系最初5min在652nm波长的最大吸光值，根据Lineweaver-Burk公式：1/v＝Km/v_m(1/[s]+1/Km)计算米氏常数，结果见图6。由图6的线性方程可以计算出Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS过氧化氢模拟酶的米氏常数K_m＝0.4302mM，V_max＝1.33×10^-7M/s，说明Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS对H₂O₂的亲和力和催化反应速率极高，具有高的H₂O₂模拟酶催化活性。

实施例8：本发明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS与Fe₃O₄@mSiO₂的酶活性强弱对比

采用实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS与Fe₃O₄@mSiO₂进行以下实验。

在含3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)+200μL 2mg/mL TMB+300μL 400μM H₂O₂的2支试管中分别加入30mg Fe₃O₄@mSiO₂和Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS，然后在30℃的水浴中反应30min，磁分离后的溶液用紫外可见分光光度计测定652nm处的吸光度，结果见图7。从图7可见，以Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS为催化剂，反应体系的吸光度更大，说明SDS插层蒙脱土能显著增强Fe₃O₄@mSiO₂的催化活性，导致Fe₃O₄@mSiO₂@MTT-SDS的酶活性大于Fe₃O₄@mSiO₂的酶活性。

实施例9：本发明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS的稳定性和使用寿命

采用实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS进行以下实验。

将30mg保存于干燥器中0，5，10，15，30，60天的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS分别加到3.0mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)+200μL 2mg/mL TMB+300μL 300μM H₂O₂混合溶液中，30℃的水浴反应30min，然后用紫外可见分光光度计测定混合溶液在652nm的吸光度。测得的吸光度分别为0.668、0.66、0.656、0.651、0.649、0.638，相对标准偏差为1.0％，相对极差为4.5％，表明随着保存时间增加，所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS模拟酶的催化活性不变，具有良好的稳定性和使用寿命。

实施例10：本发明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS用于检测盐酸克伦特罗的灵敏度

采用实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS用于检测盐酸克伦特罗的原理见图8，实验步骤如下。

在2.5mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)中加入200μL 800μM H₂O₂和30mg Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS，然后再分别加入300μL浓度分别为0.3、1.2、3.6、7.2、9.6、13.2、14.4μM的盐酸克伦特罗标准溶液，30℃水浴反应30min，然后加入200μL 2mg/mL TMB，混合均匀，于30℃水浴反应10min，磁分离，取一定体积的反应液于比色皿中，在652nm条件下测定溶液的吸光度，以盐酸克伦特罗的浓度对相应吸光值进行线性回归分析，盐酸克伦特罗在3.0×10^-8～1.44×10^-6mol·L^-1范围内与A呈良好的线性关系，线性回归方程为A＝-0.022c+0.619(r²＝0.9966)，检出限(S/N＝3)1.0×10^-8mol·L^-1。样品按实施例11进行处理，得到本方法应用于饲料、猪肉样品检测的检出限为0.63μg·kg^-1，农业部第38号文件规定超过1μg·kg^-1即为阳性，说明本方法的灵敏度高，能满足饲料、猪肉中盐酸克伦特罗的现场快速检测要求。

实施例11：本发明所述的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS应用于检测饲料和猪肉中痕量盐酸克伦特罗

采用实施例1所制备的Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS进行以下实验。

实验材料：瘦猪肉1#(购自肇庆市东岗市场)，瘦猪肉2#(购自肇庆学院市场)，瘦猪肉3#(购自肇庆市大润发超市)，饲料样品均为广东肇庆联合饲料公司产品。

(1)饲料中盐酸克伦特罗的提取：称取饲料5.0g置于100mL三角瓶中，加入50.0mL提取液(0.1mol·L^-1HCl:甲醇＝80:20)和1.0mL饱和醋酸铅溶液，振摇，超声30min，静置5min，11000r·min^-1离心10min，收集上清液，40℃水浴氮吹至近干，用5mL 2％甲酸溶解残渣，待净化。

(2)瘦猪肉中盐酸克伦特罗的提取：称取已均质的试样5.0g于50mL塑料离心管中，加入8mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝5.2)和50μLβ-葡糖醛酸苷肽酶，涡旋混匀，37℃振荡酶解16h。取出冷却至室温，8000r/min离心5min，转移上清液并加入5mL 0.1mol/L HClO₄，用HClO₄调pH至1.0±0.2，8000r/min离心5min，转移上清液，并用10mol/L NaOH溶液调节pH至9.5±0.5，加入2g NaCl和10mL乙酸乙酯-异丙醇(6:4，V/V)，涡旋振荡10min，8000r/min离心5min，收集上清液，40℃水浴氮吹至近干，用5mL 2％甲酸溶解残渣，待净化。

(3)提取液净化：依次用3mL甲醇、水、2％甲酸溶液活化Strata-X-C固相萃取柱，将5mL样品提取液加到萃取柱上，依次用3mL 2％甲酸溶液、甲醇淋洗柱子，负压抽干，用6mL 3％氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃水浴氮吹至近干，用0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)溶解残渣并定容至1.0mL，待测定。

(4)提取液测定：在1.0mL提取液中依次加入1.8mL 0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.0)，200μL 800μM H₂O₂和30mg Fe₃O₄@mSiO₂@MMT-SDS，混合均匀，30℃水浴反应30min，然后加入200μL 2mg/mL TMB，混合均匀，于30℃水浴反应10min，磁分离，取一定体积的反应液于比色皿中，在652nm条件下测定溶液的吸光度，由测得的吸光度计算盐酸克伦特罗的含量。饲料样品和瘦猪肉样品同时采用GB/T 22286-2008液相色谱－质谱/质谱法(LC-MS/MS)进行对照实验，结果见表1。采用本发明的方法，猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼配合饲料和3个瘦猪肉样品中均未检测出盐酸克伦特罗，与LC-MS/MS测定结果相一致。在饲料、瘦猪肉样品中分别添加3个水平盐酸克伦特罗，进行加标回收试验，每个浓度平行测定3次。饲料、瘦猪肉样品的加标回收率在80.0％～93.1％，相对标准偏差在3.7％～7.2％，表明本方法具有高的精确性和准确性，能应用于现场快速检测饲料、猪肉中痕量盐酸克伦特罗。

表1不同样品中盐酸克伦特罗的检测结果(n＝3)

“–”表示未检出，1#购于东岗市场，2#购于超市，3#购于校园商业街。