本发明涉及试剂盒的制备领域，具体为一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
弓形虫(TOXO)是一种细胞内寄生的真核病原体微生物，它能通过血液传播，感染宿主体内许多不同的器官和组织。弓形虫感染后，约50％的患者没有临床症状，而另外50％的感染者经潜伏期后，只有一些非特异性症状如低烧、疲乏、头痛、肌肉和关节痛；少数病人会出现高烧和颈部淋巴结肿大。儿童和未成年人感染后还会有1％的病人出现并发症如心肌炎、脑膜炎或肺炎等。孕妇弓形虫感染的筛查是有重大意义的。弓形虫通过胎盘传播在怀孕的各个阶段都有可能发生，通过胎盘垂直传播给胎儿，损害胚胎发育，严重者致畸甚至死亡，同时可使孕妇流产或早产，其危险性较未感染孕妇大10倍。
IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM，故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，血清中检出IgM提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。因此，TOX-IgM的检测对于孕妇的辅助诊断具有重要意义。
临床上用于TOXO IgM测定的常用方法有：放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、免疫放射分析法、时间分辨荧光免疫分析等。而磁微粒化学发光免疫诊断法(CLIA)是一种新型的检测方法，相比于传统的放射免疫分析法和酶联免疫吸附法，其通过磁微粒吸附特异性免疫复合物，使它的灵敏度高，步骤简便。临床上，通常采用间接法和捕获法测定TOXO IgM，但间接法测定TOXO IgM会有血清IgG的干扰，而采用捕获法测定TOXO IgM存在抗原标记碱性磷酸酶(ALP)活性及回收率较低的情况，造成试剂盒成本较高，临床推广难度大。因此需要发明制备一种既减小IgG类抗体干扰又成本较低的TOXO IgM检测试剂。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒，包括以下组分：
抗人IgM标记的FITC，该抗体为单抗，较兔多抗、羊多抗特异性、活性高；
TOXO抗原；
标记有抗FITC抗体的磁珠；
鼠抗TOX抗体标记ALP；
TOXO IgM定标液。
进一步的，所述的TOXO抗原为虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3。采用2种不同TOXO抗原：虫体表面膜蛋白1(SAG1)、弓形虫微线体蛋白3(MIC3)，这两种蛋白在虫体对宿主识别、转移粘附中具有重要作用，具有良好的免疫原性。虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3在2～8℃下混匀1h，确保充分混匀。
进一步的，该试剂盒还包括浓缩洗液，所述浓缩洗液为含有Tween-20、Proclin300的Tris-Cl缓冲液。
本发明的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)、将待测样本至合适浓度稀释；
2)、在反应管中加入待测样本、TOXO IgM定标液和抗人IgM标记的FITC，37℃孵育15min；
3)、加入TOXO抗原，37℃孵育15min；
4)、加入磁珠，37℃孵育5min；
5)、清洗三次后，加入鼠抗TOX抗体标记ALP，37℃孵育15min；
6)、清洗三次后，加入底物，读取发光值，仪器自动计算样本发光值与定标发光值的比值，即S/CO。
7)、结果判读：S/CO＜1.0为阴性；S/CO≥1.0为阳性。
本发明所达到的有益效果是：
本发明的试剂盒将稀释的样本与标记FITC的抗人IgM结合，反应后加入 TOXO抗原，减少了TOXO IgM检测时，IgG的干扰，而鼠抗人IgM亲和力和特异性较多抗优异，也避免了多抗特异性差引起的假阳性的；另一方面，本发明避免了抗原标记ALP回收率低的问题，因抗原在标记ALP过程中易失活和降解，其回收率一直不理想。本发明标记抗体，抗体稳定性较好，标记过程中活性损失少。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1抗人IgM抗体的确定
样本来源：临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例，阳性样本编号：1-5；阴性样本编号6-10。鼠抗人IgM购自厂家1，羊抗人IgM购自厂家2，兔抗人IgM购自厂家3。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本，待测样本按1:300比例稀释，浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL，再分别加入鼠、羊、兔抗人IgM标记的FITC 30uL，37℃孵育15min；
3)、加入30uL TOXO抗原，37℃孵育15min；
4)、加入磁珠30uL，37℃孵育5min；
5)、清洗三次后，加入100uL TOXO抗体-ALP，37℃孵育15min。
6)、清洗三次后，加入底物，读取发光值，计算S/CO，结果如表1所示：
表1不同抗人IgM抗体对检测的影响
表1的结果表明，采用鼠抗人IgM，结果符合临床样本检测要求，而羊抗人和兔抗人则存在假阳性。
实施例2TOXO抗原的确定
样本来源：临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例，阳性样本编号：1-5；阴性样本编号6-10。TOXO SAG1、MIC3购自厂家4。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本，待测样本按1:300比例稀释，浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL，再加入鼠抗人IgM标记的FITC 30uL，37℃孵育15min；
3)、分别加入30uL SAG1、30uL MIC3抗原、30uL SAG1和MIC3(5ug/ml，各15uL)，37℃孵育15min；
4)、加入磁珠30uL，37℃孵育5min；
5)、清洗三次后，加入100uL TOXO抗体-ALP，37℃孵育15min。
6)、清洗三次后，加入底物，读取发光值，计算S/CO。
表2不同TOXO抗原对检测的影响
表2的结果表明，采用SAG1和MIC3抗原共同使用，结果符合临床样本检测要求，而单独使用两种抗原都则存在错误结果，无法达到临床样本要求。
实施例3TOXO抗体标记ALP的确定
样本来源：临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例，阳性样本编号：1-5；阴性样本编号6-10。鼠抗TOXO购自厂家1、兔抗TOXO购自厂家3。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本，待测样本按1:300比例稀释，浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行；
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL，再加入鼠抗人IgM标记的FITC 30uL，37℃孵育15min；
3)、分别加入30uL抗原、30uL(SAG1和MIC3各15uL)，37℃孵育15min；
4)、加入磁珠30uL，37℃孵育5min；
5)、清洗三次后，各加入100uL鼠、兔抗TOXO抗体-ALP，37℃孵育15min。
6)、清洗三次后，加入底物，读取发光值，计算S/CO。
表3不同TOXO抗体标记ALP对检测的影响
表3的结果表明，采用鼠抗TOXO标记ALP，结果符合临床样本检测要求， 而使用兔抗TOXO存在假阴和假阳，无法达到临床样本要求。
实施例4-临床符合率
样本来源：临床筛选弓形虫IgM抗体阳20例、阴性100例。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本，待测样本按1:300比例稀释，浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL，再加入鼠抗人IgM标记的FITC 30uL，37℃孵育15min；
3)、分别加入30uL抗原、30uL(SAG1和MIC3各15uL)，37℃孵育15min；
4)、加入磁珠30uL，37℃孵育5min；
5)、清洗三次后，各加入100uL鼠、兔抗TOXO抗体-ALP，37℃孵育15min。
6)、清洗三次后，加入底物，读取发光值，计算S/CO。
表4120例临床样本的符合率
结果表明，临床样本检测符合率：阳性100％，阴性100％。相比于临床结果，本发明试剂盒有相同的灵敏度和符合率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。