一种肾衰宁片有效成分的测定方法与流程

本发明涉及一种中药检测方法，特别涉及一种肾衰宁片有效成分的测定方法。

背景技术：

肾衰宁片为一种已经上市的中成药，配方为：太子参、黄连、半夏(制)、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草。

肾衰宁片具有益气健脾，活血化瘀，通腑泄浊功效。用于脾失运化，瘀浊阻滞，升降失调所引起的腰痛疲倦，面色萎黄，恶心呕吐，食欲不振，小便不利，大便粘滞及多种原因引起的慢性肾功能不全见上述症候者。

现有肾衰宁片的检测方法主要包括：大黄的鉴别，黄连的鉴别，丹参的鉴别，以及盐酸小檗碱含量的测定，和丹参素含量测定，其中盐酸小檗碱含量测定方法采用分光光度法，在345nm的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱的吸收度计算含量。其中丹参素含量测定采用高效液相色谱法，选择处方中丹参的有效成分丹参素作为含量指标，采用HPLC法进行测定，色谱条件流动相:磷酸盐缓冲液(0.5％Nail2P04-0.03％H3P04):甲醇＝95:5；检测波长220nm；流速:lml/ml；色谱柱:Purospher STAR RP一18e，5um(1504.6mn)；柱

但由于肾衰宁片化学成分种类较多且理化性质差异较大，仅对制剂中少数成分进行定量的方法评价制剂的质量，过于片面；很难完整表征其化学特征。

中药指纹图谱可以从分析角度完整的体现中药的化学成分，从而实现对中药的质量控制。因此建立肾衰宁片指纹图谱，可较为直观、全面地反映制剂的整体质量。本发明针对中药制剂肾衰宁片，建立了指纹图谱的评价方法，研究以系统指纹实现对制剂的整体质量评价。

技术实现要素：
：

本发明公开了一种肾衰宁片的检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每0.8-1.2ml含丹参素钠、盐酸小檗碱45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚8-12μg的溶液，即得。

步骤2：对照药材溶液制备

分别取太子参(0.4-0.6g)、黄连(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陈皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黄(0.7-0.9g)、丹参(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、红花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70-90％甲醇20-30ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤3：供试品溶液制备

取样品粉末0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤4：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各5-15μL，分别注入液相色谱仪检测，记录色谱图，将所得色谱图与标准指纹图谱进行对照比较。

优选的，本发明的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含丹参素钠、盐酸小檗碱50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚10μg的溶液，即得。

步骤2：对照药材溶液制备

分别取太子参(0.5g)、黄连(0.2g)、半夏(0.5g)、陈皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黄(0.8g)、丹参(1.0g)、牛膝(0.4g)、红花(0.2g)、甘草(0.2g)等药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤3：供试品溶液制备

取含量测定项下的样品粉末，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤4：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各1-6μL，分别注入液相色谱仪检测，记录色谱图，将所得色谱图与标准指纹图谱进行对照比较。

其中所述标准指纹图谱是经过对多批合格样品进行高效液相色谱检测，记录色谱图，并参考参照物的色谱图经过计算机统计计算，生成得到的标准高效液相色谱图。

本发明所述的检测方法是对未知样品进行高效液相色谱检测，得到色谱图，将所得色谱图和上述标准指纹图谱进行对比，相似度高于90％则为合格样品，否则为不合格样品。

为得到肾衰宁片的标准指纹图谱，本发明进一步研究出一种肾衰宁片高效液相指纹图谱建立方法，所述方法包括如下步骤：

1)合格样品溶液的制备：

取合格的肾衰宁片，粉碎成粉末，取0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用45-55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)参照物溶液的制备：

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每0.8-1.2ml含丹参素钠、盐酸小檗碱45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚8-12μg的溶液，即得。

另，分别取太子参(0.4-0.6g)、黄连(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陈皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黄(0.7-0.9g)、丹参(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、红花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70-90％甲醇20-30ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)检测：将合格样品溶液和参照物溶液分别注入液相色谱仪，测定，得到色谱图。

4)经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱，共有15个标记峰，其中2、6号峰为丹参特征峰，3、5、9、10、11、12、13、14、15号峰为大黄特征峰，4号为陈皮特征峰、8号为黄连特征峰。

优选的，本发明的肾衰宁片高效液相指纹图谱建立方法，包括如下步骤：

1)合格样品溶液的制备：

取合格的肾衰宁片，粉碎成粉末，取0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用45-55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)参照物溶液的制备：

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含丹参素钠、盐酸小檗碱50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚10μg的溶液，即得。

另，分别取太子参(0.5g)、黄连(0.2g)、半夏(0.5g)、陈皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黄(0.8g)、丹参(1.0g)、牛膝(0.4g)、红花(0.2g)、甘草(0.2g)等药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)检测：将合格样品溶液和参照物溶液分别注入液相色谱仪，测定，得到色谱图。

4)经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱，共有15个标记峰，其中2、6号峰为丹参特征峰，3、5、9、10、11、12、13、14、15号峰为大黄特征峰，4号为陈皮特征峰、8号为黄连特征峰。

本发明是在现有技术的基础上对有关检测方法进行筛选，最终得到一种实用有效的指纹图谱检测方法。

本发明的筛选方法如下：

1仪器与试药

仪器：Shimadzu 20A高效液相色谱仪(四元泵，DAD检测器)

试剂：乙腈为色谱纯，水为去离子水，其它试剂均为分析纯。

2色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C₁₈(4.6×250mm，5μm)

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％的磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃，进样量10μl。

流动相梯度洗脱表

3供试品溶液的制备取含量测定项下的样品粉末，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、对照溶液制备

4.1对照品溶液制备取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含丹参素钠、盐酸小檗碱50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚10μg的溶液，即得。

4.2对照药材溶液制备分别取太子参(0.5g)、黄连(0.2g)、半夏(0.5g)、陈皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黄(0.8g)、丹参(1.0g)、牛膝(0.4g)、红花(0.2g)、甘草(0.2g)等药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱峰的归属

样品共有15个标记峰，经与对照药材比对，其中2、6号峰为丹参特征峰，3、5、9、10、11、12、13、14、15号峰为大黄特征峰，4号为陈皮特征峰、8号为黄连特征峰。

5方法学考察

5.1重复性试验取同一批样品，同时制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果各共有峰的相对保留时间RSD值在0.05-0.1％之间，相对峰面积RSD值在2.1-3.5％之间，表明重复性良好。

5.2精密度试验取同一供试品溶液，连续进样6次，测定指纹图谱。结果各共有峰的相对保留时间RSD值在0.01～0.2％之间，相对峰面积为RSD值在1.2～2.1％之间，表明精密度良好。

5.3稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、4、8、12、15、24小时进样测定，结果各共有峰的相对保留时间RSD值在0.03-0.4％之间，相对峰面积值在1.1-2.3％之间，表明供试品至少在24内稳定。

6对照指纹图谱的生成及相似度计算

取10批样品，按正文方法进行测定，将测定结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成对照指纹图谱。按相似度评价系统，将供试品指纹图谱与生成的对照指纹图谱进行相似度计算，结果见下表。

10批样品的相似度分析结果

和现有技术相比，本发明准确度高，灵敏度高，稳定性好，重现性好，操作简单实用，取得了意料不到的技术效果。

附图说明

图1，样品色谱图

图2，丹参素钠色谱图

图3，丹酚酸B色谱图

图4，橙皮苷色谱图

图5，盐酸小檗碱色谱图

图6，芦荟大黄素色谱图

图7，大黄素色谱图

图8，大黄酸色谱图

图9，大黄酚色谱图

图10，大黄素甲醚色谱图

图11，陈皮色谱图

图12，大黄色谱图

图13，丹参色谱图

图14，黄连色谱图

图15，甘草色谱图

图16，法半夏色谱图

图17，茯苓色谱图

图18，红花色谱图

图19，牛膝色谱图

图20，太子参色谱图

图21，标准指纹图谱

图22，10批样品相似度图谱

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

步骤1：对照品溶液制备

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每0.8-1.2ml含丹参素钠、盐酸小檗碱45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚8-12μg的溶液，即得。

步骤2：对照药材溶液制备

分别取太子参(0.4-0.6g)、黄连(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陈皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黄(0.7-0.9g)、丹参(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、红花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70-90％甲醇20-30ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤3：供试品溶液制备

取样品粉末0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤4：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各5-15μL，分别注入液相色谱仪检测，记录色谱图，将所得色谱图与标准指纹图谱进行对照比较。

优选的，本发明的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含丹参素钠、盐酸小檗碱50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚10μg的溶液，即得。

步骤2：对照药材溶液制备

分别取太子参(0.5g)、黄连(0.2g)、半夏(0.5g)、陈皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黄(0.8g)、丹参(1.0g)、牛膝(0.4g)、红花(0.2g)、甘草(0.2g)等药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤3：供试品溶液制备

取含量测定项下的样品粉末，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤4：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各1-6μL，分别注入液相色谱仪检测，记录色谱图，将所得色谱图与标准指纹图谱进行对照比较。

本发明进一步公开一种肾衰宁片高效液相指纹图谱建立方法，所述方法包括如下步骤：

1)合格样品溶液的制备：

取合格的肾衰宁片，粉碎成粉末，取0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用45-55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)参照物溶液的制备：

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每0.8-1.2ml含丹参素钠、盐酸小檗碱45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚8-12μg的溶液，即得。

另，分别取太子参(0.4-0.6g)、黄连(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陈皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黄(0.7-0.9g)、丹参(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、红花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70-90％甲醇20-30ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)检测：将合格样品溶液和参照物溶液分别注入液相色谱仪，测定，得到色谱图。

4)经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱，共有15个标记峰，其中2、6号峰为丹参特征峰，3、5、9、10、11、12、13、14、15号峰为大黄特征峰，4号为陈皮特征峰、8号为黄连特征峰。

优选的，本发明的肾衰宁片高效液相指纹图谱建立方法，包括如下步骤：

1)合格样品溶液的制备：

取合格的肾衰宁片，粉碎成粉末，取0.8-1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入45-55％甲醇45-55ml，密塞，称定重量，超声处理25-35分钟，取出，放冷，再称定重量，用45-55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)参照物溶液的制备：

取丹参素钠、丹酚酸B、橙皮苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含丹参素钠、盐酸小檗碱50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚10μg的溶液，即得。

另，分别取太子参(0.5g)、黄连(0.2g)、半夏(0.5g)、陈皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黄(0.8g)、丹参(1.0g)、牛膝(0.4g)、红花(0.2g)、甘草(0.2g)等药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)检测：将合格样品溶液和参照物溶液分别注入液相色谱仪，测定，得到色谱图。

4)经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱，共有15个标记峰，其中2、6号峰为丹参特征峰，3、5、9、10、11、12、13、14、15号峰为大黄特征峰，4号为陈皮特征峰、8号为黄连特征峰。