本发明涉及一种齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法，属于分析化学领域。
背景技术：
齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursolic acid，UA)是两种典型的五环三萜类化合物。研究表明，它们具有低的细胞毒性和广泛的生物活性，例如具有杀虫、消炎、防流感、抗糖尿等功能。熊果酸现已被证明能够阻断艾滋病蛋白酶的聚合作用，同时对于其它恶性肿瘤细胞亦表现出强烈的抑制作用；齐墩果酸可减轻肝损伤，对急性、慢性肝炎及肝硬化动物均有明显的降低谷丙转氨酶及退黄效果，是治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎较理想的药物，且毒性低，不良反应少。
对于齐墩果酸和熊果酸的检测方法，文献报道的方法有毛细管胶束电动色谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法和液相色谱质谱等。其中，毛细管胶束电动色谱法的重现性不佳，限制了其发展；薄层扫描法对薄层条件要求比较苛刻，且一般很难分离，所得的定量检测结果为齐墩果酸和熊果酸的总和；而采用高效液相色谱法时，由于OA和UA的分子结构中均仅有一个双键，其特征吸收波长接近200nm，导致在使用紫外检测器检测时基线波动大，灵敏度低；如采用高效液相色谱-质谱法，由于OA和UA的分子结构中的-COOH基团在电喷雾离子源(负离子模式)中离子化效率差，使得方法的灵敏度低；而采用高效液相色谱-串联质谱法定量检测OA和UA时，由于离子化效率低，且OA和UA的化学结构非常稳定，在串联质谱的碰撞池中不易碎裂，因此无法使用高灵敏度的多反应监测模式(MRM)进行分析。现也有文献报道将两种目标物衍生后使用荧光检测器检测，虽然灵敏度有所提高，但中药大量的复杂的基质给定性定量带来巨大困难。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法，样品取样量少，且前处理简单、快速，大幅度提高信号响应。更重要的是，该方法无需购买每种标准品的同位素内标，而是通过衍生化向目标分子中引入稳定同位素，在分析过程中可以消除基质效应带来的影响。
一种齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)准确称取待测样品，提取齐墩果酸和熊果酸，得到齐墩果酸和熊果酸的提取液；
(2)配制齐墩果酸和熊果酸标准溶液，同样加入三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)和N,N-二甲基乙二胺进行衍生化反应，得到衍生后的标准样品；
(3)选择一齐墩果酸和熊果酸标准溶液，加入三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)和d4-N,N-二甲基乙二胺进行衍生化反应，得到衍生后的内标溶液；
(4)将步骤(1)所得齐墩果酸和熊果酸的提取液中加入三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)和N,N-二甲基乙二胺进行衍生化反应，得到衍生后的待测样品；
(5)将衍生后的内标溶液平行定量加入到各衍生后的标准样品和衍生后的待测样品中，然后分别进入高效液相色谱-串联质谱分析，采用内标法定量测定待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。
按上述方案，所述待测样品通常为中草药。中草药可以为原材料或者加工品等形式，其中中草药原材料包括枇杷叶、女贞子、夏枯草、柿叶、楤木叶片、车前草、山楂、大枣、山茱萸等；中草药加工品可以为粉剂、溶液和膏剂等，如枇杷膏、山楂膏等。
按上述方案，所述步骤(1)中的提取齐墩果酸和熊果酸时，采用有机溶剂提取即可，无需复杂的净化、浓缩等步骤。
按上述方案，步骤(1)中所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚或丙酮等中的一种或几种。
优选地，所述待测样品为中草药原材料时，将待测样品准确称量后研磨至粉末状，加入有机溶剂提取，固液分离出上清液，即为齐墩果酸和熊果酸的提取液。优选地，所述待测样品为中草药膏剂时，将待测样品准确称量后用水或饱和食盐水稀释，然后加入有机溶剂，液液分离出上清液，即为齐墩果酸和熊果酸的提取液。
按上述方案，所述步骤(2)、(3)中N,N-二甲基乙二胺(DMED)或d4-N,N-二甲基乙二胺(d4-DMED)加入量与齐墩果酸和熊果酸的总摩尔数的比值在200～5000之间；三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)的分别起到提供碱性环境和催化剂的作用，在衍生化反应体系中其浓度均在0.5～1.2μmol/mL之间；所述步骤(4)中N,N-二甲基乙二胺(DMED)三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)的加入量参照步骤(2)、(3)平行加入。
按上述方案，所述步骤(2)、(3)、(4)中衍生化反应的温度在10～60℃，时间为5～60min。
按上述方案，所述步骤(2)、(3)和(4)中，先加入三乙胺、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)，混匀后，再加入DMED或d4-DMED，然后所得溶液于振荡加热的条件下进行衍生化反应。
按上述方案，所述步骤(2)中熊果酸和齐墩果酸标准溶液中，熊果酸和齐墩果酸的浓度线性范围均为0.01～50μg/L。
按上述方案，所述步骤(3)中所选择的齐墩果酸和熊果酸标准溶液中，熊果酸和齐墩果酸的浓度不低于其标准溶液线性范围最高值的80％。
按上述方案，所述步骤(5)中高效液相色谱-串联质谱分析时采用正离子多反应监测(MRM)模式。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明巧妙利用胺基与化合物结构中的羧基反应，生成稳定而又离子化效率较高的酰胺化合物，衍生化反应前，齐墩果酸和熊果酸在电喷雾离子源(负离子模式)中离子化效率差，且在串联质谱碰撞池中不易碎裂，而衍生化反应后，其衍生产物在电喷雾离子源(正离子模式)中离子化效率提高，且碎片离子生成效率亦有显著提高，从而大幅提高质谱响应信号，降低目标分析物的检出限，准确性和重复性良好，有效克服了采用串联质谱分析齐墩果酸和熊果酸时离子化效率差和碎片离子生成效率差、信号响应弱的技术难题。
2.在串联质谱分析中，本发明采用的多反应监测模式(MRM)将选定的特异性母离子进行碰撞诱导解离，去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集，灵敏度高，且能有效排除假阳性现象。
3.质谱检测时，存在的基质可能影响到分析物的离子化，从而影响检测的定量结果，通常要加入内标物来进行分析，而内标物的选择通常选择其同位素，难获取且价格昂贵；而本发明无需获得每种标品的同位素内标，而是通过衍生，一方面向目标分子中引入稳定同位素作为内标物，可不需另加内标物来降低复杂样品的基质效应带来的误差，另一方面大幅提高质谱响应信号，降低目标分析物的检出限。
4.本发明样品取样量少，且前处理简单、快速，不需要复杂的净化、浓缩步骤。对于草药原材料样品，只需要用有机溶剂提取就可衍生分析；对于膏状样品，仅需要用水等化开后用有机溶剂提取即可衍生分析。
综上所述，本发明在前处理中使用一对稳定同位素衍生化试剂，N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N,N-二甲基乙二胺(d4-DMED)，无需另外加入内标物，并与高效液相色谱-串联质谱结合，建立了复杂样品中齐墩果酸和熊果酸的检测方法。该方法简单、快速，灵敏度高，准确性和重复性良好，可通过衍生化提高分析的灵敏度，对中药中齐墩果酸与熊果酸的分离分析具有重要意义。
附图说明
图1为齐墩果酸和熊果酸的衍生化反应原理。
图2为实施例1中齐墩果酸和熊果酸的标准曲线，其中a为齐墩果酸，b为熊果酸。
图3为实施例1中齐墩果酸和熊果酸的多反应监测色谱图。
图4为实施例2中齐墩果酸和熊果酸的标准曲线，其中a为齐墩果酸，b为熊果酸。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例中，所采用的定容溶剂为高效液相色谱的流动相，具体为0.1％甲酸水：乙腈＝47:53(v/v)，甲酸水的浓度0.1％为体积浓度。
实施例1
一种枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g枇杷膏于250mL容量瓶中，饱和食盐水稀释至刻度；取1mL稀释液，加入200μL乙酸乙酯，涡旋5min，5000rpm离心取上清液，即得到齐墩果酸和熊果酸的提取液；
(2)用乙腈作为溶剂配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μg/L系列浓度的齐墩果酸和熊果酸的混合标准溶液；分别取200μL各标准溶液，加入10μL 20μmol/mL的三乙胺和10μL 20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL DMED，于40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的标准样品；
(3)取200μL 10ng/mL标准溶液，加入10μL 20μmol/mL的TEA和10μL20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL d4-DMED，40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的内标溶液；
(4)将步骤(1)所得提取液中加入10μL 20μmol/mL的三乙胺和10μL 20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL DMED，于40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的待测样品；
(5)为了保证各样品之间的平行性，将步骤(2)所得衍生后的待测样品、步骤(3)所得衍生后的标准样品、步骤(4)所得衍生后的内标溶液分别用氮气吹干，然后加入100μL流动相复溶；
(6)将步骤(5)重新定容后的内标溶液10μL平行加入到重新定容后各衍生后的标准样品和衍生后的待测样品中，混匀后分别进入高效液相色谱-三重四极杆质谱分析；
(7)根据标准样品所得多反应监测色谱图，以齐墩果酸和熊果酸的DMED衍生物与其d4-DMED衍生物的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线(如图2所示)；
(8)根据待测样品的所得多反应监测色谱图(如图3所示)，将其峰面积比值代入步骤(7)所得标准曲线，内标法计算提取液中齐墩果酸和熊果酸的含量，并换算为原待测样品枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸的含量。
本实施例中，具体的液相色谱及质谱参数如下：
液相色谱条件：液相色谱分离采用InertSustain C18Column(2.1mm I.D.×250mm L.,3μm)色谱柱；流动相为0.1％甲酸水：乙腈＝47:53(v/v)，等度洗脱；流速为0.25mL/min；柱温箱为35℃。
质谱条件：采用正离子监测模式，雾化气流速为2.0L/min；加热气流速为10.0L/min；接口温度为300℃；脱溶剂管温度为250℃；加热模块温度为400℃；干燥气流速为10.0L/min；扫描模式为多反应监测(MRM)，其它质谱参数见表1。
表1质谱参数信息
注：表中前体离子、产物离子及MRM参数均为其衍生物数据；*表示定量离子
本实施例中按照上述步骤检测某品牌枇杷膏，平行测定5次，测得该待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量分别为7.40和23.6mg/Kg。
为了验证本发明的精密度，平行配制了齐墩果酸和熊果酸浓度均为0.5μg/L的混合标液6份，进行衍生化反应后进行定量检测，结果如表2所示，齐墩果酸和熊果酸的峰面积比的相对标准偏差4.01～5.84％之间，方法精密度良好。
表2方法精密度结果
实施例2
一种测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的定量检测方法，包括以下操作步骤：
(1)准确称量0.5g枇杷叶置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，转移至10mL离心管中，加入5mL乙腈，超声提取30min，5000rpm离心取200μL上清液，即得到齐墩果酸和熊果酸的提取液；
(2)用乙腈作为溶剂配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μg/L系列浓度的齐墩果酸和熊果酸的混合标准溶液；分别取200μL各标准溶液，加入10μL 20μmol/mL的三乙胺和10μL 20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL DMED，于40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的标准样品；
(3)取200μL 10ng/mL标准溶液，加入10μL 20μmol/mL的TEA和10μL20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL d4-DMED，40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的内标溶液；
(4)将步骤(1)所得提取液中加入10μL 20μmol/mL的三乙胺和10μL 20μmol/mL的CMPI，涡旋5min，再加入10μL40μmol/mL DMED，于40℃1500rpm振荡1h进行衍生化反应，得到衍生后的待测样品；
(5)为了保证各样品之间的平行性，将步骤(2)所得衍生后的待测样品、步骤(3)所得衍生后的标准样品、步骤(4)所得衍生后的内标溶液分别用40℃氮气吹干，然后加入100μL流动相复溶；
(6)将步骤(5)重新定容后的内标溶液10μL平行加入到重新定容后各衍生后的标准样品和衍生后的标准样品中，混匀后分别进入高效液相色谱-三重四极杆质谱分析；
(7)根据标准样品所得多反应监测色谱图，以齐墩果酸和熊果酸的DMED衍生物与其d4-DMED衍生物的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线(如图4所示)；
(8)根据待测样品的所得多反应监测色谱图(如图3所示)，将其峰面积比值代入步骤(7)所得标准曲线，内标法计算提取液中齐墩果酸和熊果酸的含量，并换算为原待测样品枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量。
本实施例中按照上述步骤检测某枇杷叶，平行测定5次，测得该枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量分别为0.42和1.97mg/kg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。