本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。
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：据报道，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。降低恶性肿瘤死亡率的主要途径是早期诊断和早期治疗。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清肿瘤标志物(tumormarker，TM)，由于TM的敏感性和特异性相对较高，较为经济，检查时痛苦少，且适合大批量标本检测，TM的临床应用受到了广泛的关注。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径的一个关键酶，它有四种同工酶，分别为L型、R型、Ml型和M2型，它们的分布具有相对的组织特异性，通常均以酶的活性四聚体形式存在。目前研究表明，几乎所有不同组织来源的肿瘤均伴有丙酮酸激酶的异构重整体M2-PK的过度表达,故称为肿瘤型M2-PK(TumorM2-PK，TUM2-PK)。在正常细胞中，M2-PK主要以三聚体的形式存在，而在肿瘤细胞中，M2-PK大量表达并转变为主要以二聚体的形式存在。三聚体的M2-PK与磷酸烯醇丙酮酸pep亲和力很高，而二聚体的M2-PK与pep的亲和力则低的多，后者因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞进行无氧糖酵解。TUM2-PK的升高可见于大多数癌症患者。尽管不同组织来源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其血中M2-PK的平均水平存在着一定的差别，但作为肿瘤标志物，M2-PK是很有应用价值的。尤其是肾癌，长期以来一直未发现较特异的肿瘤标志物,M2-PK很可能成为目前唯一可用于临床诊断肾癌的生化指标。早在1993年，在hamburg召开的(德国)第七界肿瘤标志物研讨会上，TUM2-PK就作为一种新的肿瘤标志物被提了出来。因此，监测血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TUM2-PK)可广泛应用于肿瘤的早期诊断、肿瘤预后判断以及评价肿瘤治疗疗效等方面。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种肿瘤型M2丙酮酸激酶(TUM2-PK)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TUM2-PK磁分离试剂，酶标记的TUM2-PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。.所述TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。所述酶标记的TUM2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TUM2-PK单克隆抗体和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。所述的标准品为不同浓度的TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品的50mmol/lPBS缓冲液，pH7.4。洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)TUM2-PK磁分离试剂的制备：采用化学交联法将TUM2-PK单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用70mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵、0.1mg/ml的吐温20和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至8.0即得；2)酶标记的TUM2-PK抗体溶液的制备：采用NaIO4法标记TUM2-PK单克隆抗体，反应后透析纯化，然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解，加入终浓度0.5mg/ml酪蛋白，调pH值至8.0即得；3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。在目前的TUM2-PK磁性微球相关免疫检测试剂盒中，稳定性是一个普遍存在的技术问题，导致相关试剂盒即使在4℃下保存期限也仅有九个月左右，而导致试剂盒失效的主要原因是磁分离试剂的稳定性较差，本发明通过大量试验摸索得到了一种效果极佳的磁分离试剂的稳定剂组方，从而使试剂盒的稳定性大幅提高。具体实施方式下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1试剂盒制备1)TUM2-PK磁分离试剂的制备：采用0.05mol/L的PBS缓冲液将聚苯乙烯磁性微球悬浮，磁性微球直径在1.0μm左右，磁性微球的质量分数为2.5％；然后向微球溶液中添加终浓度为1mg/ml的TUM2-PK单克隆抗体(所述单克隆抗体与下述酶标记用TUM2-PK单克隆抗体为配对抗体，购自上海研晶生物科技有限公司)，摇匀10分钟，然后向体系中加入2mg/ml碳亚二胺，摇床反应16小时，PBS缓冲液清洗两次，磁性分离，获得偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，然后将偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球分散在0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液中，调pH值为8.0，从而获得TUM2-PK磁分离试剂。2)酶标记的TUM2-PK抗体溶液的制备：采用常规NaIO4法标记TUM2-PK单克隆抗体，反应后透析纯化，然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解，加入终浓度1mg/mlBSA，调pH值至8.0即得；3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。制备后试剂盒组成如下：TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。酶标记的TUM2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TUM2-PK单克隆抗体和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。标准品为不同浓度的TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品的50mmol/lPBS缓冲液，pH7.4。洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。实施例2试剂盒检测方法a.向微孔板分别加入血清样本和TUM2-PK标准品，每孔20μl；b.依次向每孔加入酶标记的TUM2-PK抗体溶液和TUM2-PK磁分离试剂各50μl，振荡30s后，置37℃水浴30分钟。c.采用磁分离器，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。d.加200μl洗涤液至每孔中，振荡混匀30s，磁分离去洗涤液，重复三次。e.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。实施例3TUM2-PK磁分离试剂的稳定性考察采用不同的溶液组成的磁分离试剂，在37℃下以60转/分钟摇动放置一个月，采用实施例2的方法测定TUM2-PK标准品(浓度5U/ml)，其他检测试剂同实施例1，计算不同放置时间测定的化学信号值与0天时测定的化学信号值的百分比。各组磁分离试剂组成如下：组1：同实施例1组2：TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.2mg/ml的吐温20，0.3mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。组3：TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.2mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。组4：TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.2mg/ml的吐温20的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。具体结果如下：N＝5组1组2组3组45天99.4％80.9％90.2％85.1％15天98.6％69.2％81.7％75.5％30天97.1％52.5％67.6％60.3％实施例4TUM2-PK试剂盒性能考察采用实施例1制备的TUM2-PK检测试剂盒进行下列测定：1)分别取TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品；按照实施例2的方法进行测定，以化学发光值(RLU)为Y轴，以标准品浓度为x轴，绘制标准曲线；结果表明：本发明实施例1试剂盒线性良好，线性方程为y＝36537X+1762；线性系数R>0.999。2)对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度，结果表明实施例1试剂盒灵敏度为0.031U/ml实施例5实施例1试剂盒其他性能指标精密性：批内变异CV％≤3.6％；批间变异CV％≤5.2％线性系数：r≥0.9990线性范围：0.50-64U/ml本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页1 2 3