本发明涉及试剂技术领域，尤其是涉及一种血清铜离子定量检测试剂。
背景技术：
自1928年人们发现铜是日粮组成的必需成分以后，一直到1950年铜在动物营养中的作用才被逐渐地认识。铜是畜禽所必需的微量元素之一，它是酪氨酸酶、单胺氧化酶、超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶等多种含铜酶的组成成分，同时还参与细胞色素C、抗坏血酸氧化酶、半乳糖酶的合成，因而具有较广泛的生物学效应。血清铜是反映畜禽体内铜元素含量的一个重要参数，也是进行临床生化检验的一个重要指标。
铜在人体内含量约100—150mg，是人体中含量位居第二的必需微量元素，是一组重要酶的组成部分，包括铜蓝蛋白(亚铁氧化酶)，超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、赖氨酸氧化酶、多巴胺β-羟化酶以及酪氨酸酶。
血清铜增高见于：口服避孕药、雌激素治疗、霍奇金病、白血病及其他许多恶性病变、巨幼红细胞贫血、再生障碍性贫血、色素沉着病、风湿热、重型及轻型地中海贫血、创伤及胶原性疾病。
血清铜降低见于：威尔逊病(肝豆状核变性)、Menkes或丝卷综合症、烧伤患者、某些缺铁性贫血、蛋白质营养不良以及慢性局部缺血性心脏病等。
目前临床测定血清铜方法主要有原子吸收分光光度法和比色法。原子吸收法灵敏、特异，但需要昂贵的原子吸收分光光度计，并且操作繁琐、费时，临床应用较少。化学法操作简便，试剂易得，较易在临床推广使用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种血清铜离子定量检测试剂，它具有较为稳定，且与原子吸收法相关性较佳的特点。
本发明所采用的技术方案是：
血清铜离子定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其特征在于：
所述试剂R1包括：缓冲液50-200mmol、界面活性剂2.0-20.0g/L、反应促进剂2.0-12.0g/L、稳定剂0.1-20.0g/L、抑菌剂0.1-10.0g/L，其中，缓冲液的pH值为2.0-5.0；
所述试剂R2包括：缓冲液50-500mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.01-0.1g/L、电解质100-400mmol、稳定剂0.1-20.0g/L、抑菌剂0.1-10.0g/L，其中，缓冲液的pH值为6.0-9.0；
所述校准品包括：缓冲液20-300mmol、铜离子20-60μmol/L、抑菌剂0.1-10.0g/L，其中，缓冲液的pH值为6.0-8.0。
所述缓冲液为枸缘酸缓冲液、乙酸缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液中的一种。
所述界面活性剂为Tween 20、Tween40、Span20、Span40、Span80、TritonX-100、20AB中的一种。
所述反应促进剂为SDS、Brij 35、KAO 24B、甲醇中的一种或多种。
所述电解质为钠离子、钾离子、镁离子、钙离子中一种或多种。
所述稳定剂为尿酸、硫辛酸、抗坏血酸、抗坏血酸钠、盐酸羟胺中的一种或多种。
所述抑菌剂为甲醇、山梨酸钾、Proclin200、Proclin300、庆大霉素中的一种。
本发明所具有的优点是：
1、检测快速。利用本发明的血清铜离子定量检测试剂可以采用自动生化分析仪操作，可与其他检测项目同时进行，每个样本检测时间缩短到10min内，检测快速简便。
2、检测灵敏率高。本发明的血清铜离子定量检测试剂通过合理调整试剂缓冲液、界面活性剂等成分的配比，提高了反应的灵敏度。
3、线性范围宽。本发明的血清铜离子定量检测试剂的线性范围是3-78.5μmol/L，正常人群参考范围为男性：11.0-22.0μmol/L，女性：12.6-24.4μmol/L，儿童：12.6-29.9μmol/L，能够满足临床需要。
4、较为稳定。本发明的血清铜离子定量检测试剂各成分配比较优，试剂在2-8℃密闭条件下可稳定12个月，开盖后贮2-8℃，R1稳定20天，R2稳定20天。
5、相关性较佳。经过实际验证，本发明的血清铜离子定量检测试剂与原子吸收法的相关系数约为0.9658，说明该试剂与原子吸收法具有较佳的相关性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
图1是本发明的血清铜离子定量检测试剂与对照试剂进行40份样本检测结果相关性测试的关系图。
具体实施方式
实施例1
血清铜离子定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
具体的：
试剂R1包括：缓冲液150mmol、界面活性剂5.5g/L、反应促进剂8g/L、稳定剂10g/L、抑菌剂0.8g/L。其中，缓冲液采用pH值为2.8的枸缘酸，界面活性剂采用Triton X-100，反应促进剂采用SDS，稳定剂采用抗坏血酸钠，抑菌剂采用甲醇。
试剂R2包括：缓冲液300mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.08g/L、电解质150mmol、稳定剂3g/L、抑菌剂0.9g/L。其中，缓冲液采用pH值为7.8的枸缘酸，电解质采用氢氧化钠，稳定剂采用抗坏血酸，抑菌剂采用甲醇。
校准品包括：缓冲液30mmol、铜离子50μmol/L、抑菌剂0.9g/L。其中，缓冲液采用pH值为7.8的枸缘酸，铜离子来自硫酸铜，抑菌剂采用甲醇。
使用方法：
仪器：日立7180自动生化分析仪；
测定方法：二点终点法；
检测波长：570nm；
反应方向：上升反应；
V样本:VR1:VR2＝15μl:240μl:60μl；
定标及校准方式：水与校准品定标后采用linear校准。
操作步骤：
样本和试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，读取第1读数点吸光度A1，随即加入试剂R2，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。
结果计算：
采用校准品与水(零点)进行定标，将两点的吸光度变化值(A校准-A空白)对其相应浓度做图，绘制定标曲线。根据样品的(A样品-A空白)值在定标曲线上求得样品中铜离子的含量。
从理论上讲，由于试剂R1提供了血清中铜离子与底物反应的液体环境，具有能使铜离子成为游离状态的特点。试剂R2具有使特定浓度的3,5-DiBr-PAESA在2-8℃保存条件下稳定保存的特点。尤其是3,5-DiBr-PAESA仅与铜离子反应，与其他离子不反应。该校准品中人铜离子来源于硫酸铜或者氯化铜。
具体使用时，该血清铜离子定量检测试剂采用比色法，反应原理为样本中的铜离子与试剂R1在液体中相遇后，与原本结合的物质解离，与试剂中相应底物(3,5-DiBr-PAESA)在液相中相遇并发生反应，使吸光度发生变化。该吸光度变化在足量底物存在时与样本中铜离子的浓度成比例，将吸光度变化与已知浓度的校准品比较，可以定量得出样品中铜离子的含量。
实施例2
血清铜离子定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
具体的：
试剂R1包括：缓冲液200mmol、界面活性剂7.0g/L、反应促进剂7g/L、稳定剂12g/L、抑菌剂0.8g/L。其中，缓冲液采用pH值为3.6的乙酸，界面活性剂采用20AB，反应促进剂采用SDS，稳定剂采用抗坏血酸，抑菌剂采用Proclin300。
试剂R2包括：缓冲液200mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.09g/L、电解质150mmol、稳定剂5g/L、抑菌剂0.9g/L。其中，缓冲液采用pH值为7.8的柠乙酸，电解质采用氢氧化钠，稳定剂采用尿酸，抑菌剂采用甲醇。
校准品包括：缓冲液30mmol、铜离子50μmol/L、抑菌剂0.9g/L。其中，缓冲液采用pH值为7.8的枸缘酸，铜离子来自硫酸铜，抑菌剂采用Proclin200。
使用方法、操作步骤、结果计算与实施例1相同。
实施例3
血清铜离子定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
具体的：
试剂R1包括：缓冲液50mmol、界面活性剂2.0g/L、反应促进剂2g/L、稳定剂0.1g/L、抑菌剂0.1g/L。其中，缓冲液采用pH值为2的枸缘酸，界面活性剂采用Tween 20，反应促进剂采用Brij 35、SDS，稳定剂采用硫辛酸，抑菌剂采用山梨酸钾。
试剂R2包括：缓冲液50mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.01g/L、电解质100mmol、稳定剂0.1g/L、抑菌剂0.1g/L。其中，缓冲液采用pH值为6.0的HEPES缓冲液，电解质采用氢氧化钾，稳定剂采用盐酸羟胺，抑菌剂采用庆大霉素。
校准品包括：缓冲液20mmol、铜离子20μmol/L、抑菌剂0.1g/L。其中，缓冲液采用pH值为6.0的PIPES，铜离子来自硫酸铜，抑菌剂采用庆大霉素。
使用方法、操作步骤、结果计算与实施例1相同。
实施例4
血清铜离子定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
具体的：
试剂R1包括：缓冲液160mmol、界面活性剂20.0g/L、反应促进剂12g/L、稳定剂20g/L、抑菌剂10g/L。其中，缓冲液采用pH值为5.0的乙酸，界面活性剂采用Tween 40，反应促进剂采用KAO 24B、SDS，稳定剂采用任意比例组合的硫辛酸和尿酸，抑菌剂采用山梨酸钾。
试剂R2包括：缓冲液500mmol、3,5-DiBr-PAESA 0.1g/L、电解质400mmol、稳定剂20.0g/L、抑菌剂10g/L。其中，缓冲液采用pH值为9.0的HEPES缓冲液，电解质采用氢氧化镁，稳定剂采用任意比例组合的尿酸、硫辛酸、抗坏血酸、抗坏血酸钠、盐酸羟胺，抑菌剂采用Proclin300。
校准品包括：缓冲液300mmol、铜离子60μmol/L、抑菌剂10g/L。其中，缓冲液采用pH值为8.0的PIPES，铜离子来自硫酸铜，抑菌剂采用庆大霉素。
使用方法、操作步骤、结果计算与实施例1相同。
实施例5
与实施例1的区别仅在于：界面活性剂采用Span20，反应促进剂采用任意比例组合的SDS、Brij 35、KAO 24B，电解质采用氢氧化钙。
实施例6
与实施例2的区别仅在于：界面活性剂采用Span40，反应促进剂采用任意比例组合的SDS、Brij 35、KAO 24B、甲醇，电解质采用任意比例组合的氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁。
实施例7
与实施例3的区别仅在于：界面活性剂采用Span80，反应促进剂采用任意比例组合的SDS、甲醇，电解质采用任意比例组合的氢氧化钾、氢氧化钙，稳定剂采用任意比例组合的尿酸、硫辛酸、抗坏血酸、抗坏血酸钠、盐酸羟胺。
效果例
1、稳定性考察：
将实施例1的试剂开盖，定标后置于仪器试剂仓，每天测定同一质控品，测定24天。结果如表1，显示本发明血清铜离子定量检测试剂开盖20天后，测定质控仍在范围内，符合临床使用需要。
表1：本发明试剂开盖稳定性评价
根据前述方法，对实施例2至7的试剂进行相同的实验，结果类似于表1，说明实施例2至7的试剂同样具有较佳的稳定性。
2、相关性考察
本效果例中，相关分析是用相关系数(r)来表示两个变量间相互的直线关系，并判断其密切程度的统计方法。相关系数r没有单位，在-1—+1范围内变动，其绝对值愈接近1，两个变量间的直线相关愈密切，愈接近0，相关愈不密切。相关系数若为正，说明一变量随另一变量增减而增减，方向相同；若为负，表示一变量增加、另一变量减少，即方向相反，但它不能表达直线以外(如各种曲线)的关系。相关系数r＝0—0.3表示相关程度低于普通，相关系数r＝0.3—0.5表示相关程度普通，相关系数r＝0.5—0.7表示相关程度显著，相关系数r＝0.7—0.9表示相关程度高，相关系数r＝0.9—1.0表示相关程度极高。
取实施例2的试剂，与原子吸收法进行比对试验，对照试剂按照说明书设置参数，分别使用各自检测系统，对相同40份血清样本中铜离子定量检测。结果如表2和图1所示，涉及的40例样本，相关系数为0.9658，显示本发明血清铜离子定量检测试剂与对照试剂相比，具有良好的相关性。
表2：本发明试剂与对照试剂(原子吸收法)40份样本检测结果
根据前述方法，对实施例1以及实施例3至7的试剂进行相同的实验，结果类似于表2，说明实施例1以及实施例3至7的试剂同样具有良好的相关性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容及附图所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。