一种测定尿微量白蛋白的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定尿微量白蛋白的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液、加速剂、无机盐离子、防腐剂，试剂R2：缓冲液、助悬剂、表面活性剂、无机盐离子、防腐剂、抗白蛋白抗体，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。本发明具有操作方便、准确度高等优点。
【专利说明】
一种测定尿微量白蛋白的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定尿微量白蛋白的试剂 盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白，白蛋白是一种血液中的正常蛋白质， 但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白，微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。
[0003] 尿微量白蛋白，是糖尿病肾病、高血压肾病等疾病的早期肾脏受损的表征，无论哪 种疾病引起的尿微量白蛋白都是因起始原因不同造成的肾脏固有细胞的损伤，使肾脏固有 细胞的结构发生改变，功能随结构的变化而变化，在尿液中的体现。
[0004] 人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，具体到每升尿白蛋白不超过20mg，所以 叫微量白蛋白，如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，就属于微 量白蛋白尿，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻底修复肾小 球，消除蛋白尿，尿常规尿蛋白的显示为阴性(_)或(+_)，而当尿中微量白蛋白超过200mg/L 时，就应该引起注意了，此时证明肾病患者已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，尿 常规测试尿蛋白阳性(+)_(+++)，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。
[0005] 微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的"窗口"，因 为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。2型糖尿病中，尿白蛋白量为死亡的危险因子。 随着尿白蛋白浓度的增加，患者存活率下降，微量白蛋白尿是糖尿病肾病最早期的临床证 据。
[0006] 定期检测尿微量白蛋白，普通人应当每年一次，而已增高的患者应每3个月测试一 次。这样，对于肾病的预防及早期治疗都起的了积极作用。
[0007] 目前市场上的测定尿微量白蛋白的试剂普遍存在操作不便、测定准确度低的缺 陷，因此需要进行改进。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺 陷，而提供一种测定尿微量白蛋白的试剂盒及其制备方法。
[0009] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定尿微量白蛋 白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 30~150 mmol/L 加速剂 30~70 g/L 无机盐离子 3CK200 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 30~150 mmol/L 助悬剂 10.0~30.0 ml/L 表面活性剂 6~18 mL/L 无机盐离子 150~250 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 抗白蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L 其溶剂为纯化水。
[0010]作为优选，本发明公开了一种测定尿微量白蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂 R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 90mmol/L 加速剂 50g/L 无机盐离子 100 mmol/L 防腐剂 0.4 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 90 mmol/L 助悬剂 20 ml/L 表面活性剂 12 mL/L 无机盐离子 200 mmol/L 防腐剂 0.4 g/L 抗白蛋白抗体 11 ml/L 其溶剂为纯化水。
[0011]作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲 液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、 聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、 氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一 种或多种的组合。
[0012] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲 液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用阿拉伯胶、海藻酸 钠、胶体二氧化硅、甘油中的一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯 苯基醚中的一种，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合， 所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。
[0013] 作为优选，本发明还公开了上述测定尿微量白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方 法，包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: 缓冲液 30~150 mmol/L 加速剂 30~70 g/L 无机盐离子 30~200 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 30~150 mmol/L 助悬剂 10.0~30.0 ml/L 表面活性剂 6~18 mL/L 无机盐离子 150~250 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 抗白蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。
[0014]作为优选，步骤(b)中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
[0015] 作为优选，步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1: 5到1:300之间。
[0016] 本发明的检测原理是:样品中的尿微量白蛋白可与试剂R2中的抗白蛋白抗体发生 特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体免疫复合物，形成浊度，其浊度高低与样本中尿微量 白蛋白含量成正相关。通过测定浊度并与mALB校准曲线进行换算，求出样品中尿微量白蛋 白的含量。
[0017] 样本中尿微量白蛋白的活性
式中：A At以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值 A As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值 Cs校准液中mALB的浓度。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益优点:本试剂中添加了助悬剂和加速剂，助 悬剂有利于抗体的分散和稳定，加速剂则可以加速抗原抗体的反应，即使较微弱的变化也 可以检测出来，提高了试剂分析灵敏度。
【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
[0020] 实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: PBS 缓冲液 90mmol/L 聚乙二醇-8000 50g/L 氯化钠 100 mmol/L 叠氮钠 0.4 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: PBS缓冲液 90 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐温-80 12 mL/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 0.4 g/L 抗白蛋白抗体 11 ml/L 其溶剂为纯化水。
[0021] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: Tris缓冲液 150 mmol/L 聚乙二醇-2000 35 g/L 氯化钠 30 mmol/L 苯酚 0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 32 mmol/L 阿拉伯胶 19 ml/L 聚氧乙稀苯基醚 10mL/L 氯化钾 178 mmol/L 苯甲酸钠 0.2 g/L 抗白蛋白抗体 3.0 ml/L 其溶剂为纯化水。 实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: PBS 缓冲液 90mmol/L 聚乙二醇-8000 50g/L 氯化钠 100 mmol/L 叠氮钠 0.4 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: PBS缓冲液 90 mmol/L 甘油 20 ml/L 吐温-80 12 mL/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 0.4 g/L 抗白蛋白抗体 11 ml/L 其溶剂为纯化水； 2、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长340nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 3、 检测步骤 (a) 取225yl试剂R1与15yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min;
(c) 加入75yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 A A = A2-A1； (d)根据样本中尿微量白蛋白的活性 （g/L)计算出样本中的尿微 量白蛋白的浓度。
[0022] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 150 mmol/L 聚乙二醇-2000 35 g/L 氯化钠 30 mmol/L 苯酚 0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 32 mmol/L 阿拉伯胶 19 ml/L 聚氧乙稀苯基醚 10mL/L 氯化钾 178 mmol/L 苯甲酸钠 0.2 g/L 抗白蛋白抗体 3.0 ml/L 其溶剂为纯化水； 2、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长340nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d)反应方向：正反应； 3、检测步骤 (a) 取225yl试剂R1与15yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min;
(c) 加入75yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1; (d) 根据样本中尿微量白蛋白的活性 丨（g/L)计算出样本中的尿微 量白蛋白的浓度。
[0023]表1为实施例1所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定尿 微量白蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的尿微量白蛋白的浓 度为30 mg/L，测定结果见表1:
由表1可知，本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较 小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0024] 表2为实施例1所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定尿微量 白蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的尿微量白蛋白的浓度为 86 mg/L，测定结果见表2:
由表2可知，本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较 小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0025] 表3为实施例3所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次 反复测定以及实施例4所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反 复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
由表3可知本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可 知，实施例3为最优的选择。
[0026]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定尿微量白蛋白的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双 液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 30~150 mmol/L 加速剂 30~70 g/L 无机盐离子 30~200 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 30~150 mmol/L 助悬剂 10.0~30.0 ml/L 表面活性剂 6~18 mL/L 无机盐离子 150~250 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 抗白蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立 的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 90mmol/L 加速剂 50g/L 无机盐离子 100 mmol/L 防腐剂 0.4 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 90 mmol/L 助悬剂 20 ml/L 表面活性剂 12 mL/L 无机盐离子 200 mmol/L 防腐剂 0.4 g/L 抗白蛋白抗体 11 ml/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒，其特征在于:所述的试 剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液 中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷 酮中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种 的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒，其特征在于:所述的试 剂R2中，所述的缓冲液采用Tri s缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液 中的一种或多种的组合，所述的助悬剂采用阿拉伯胶、海藻酸钠、胶体二氧化硅、甘油中的 一种或多种的组合，所述的表面活性剂采用吐温-80、聚氧乙烯苯基醚中的一种，所述的无 机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用苯酚、苯 甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种的组合。5. 根据权利要求1或2所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法， 其特征在于:包括以下步骤： (a) 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: 缓冲液 30~150 mmol/L 加速剂 30~70 g/L 无机盐离子 30~200 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 30~150 mmol/L 助悬剂 10.0~30.0 ml/L 表面活性剂 6~18 mL/L 无机盐离子 150~250 mmol/L 防腐剂 0.1~0.7 g/L 抗白蛋白抗体 3.0~18.0 ml/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d )根据吸光度变化值计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。6. 根据权利要求5所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其 特征在于:步骤(b)中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。7. 根据权利要求5所述的一种测定尿微量白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其 特征在于:步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:300 之间。
【文档编号】G01N33/68GK106053368SQ201610547107
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司