专利名称：纯化白蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于纯化白蛋白、其变体或片段)，含白蛋白、其变体或片段的融合蛋白，或者含白蛋白、其变体或片段)的缀合物的方法。白蛋白可以是获得自动物或微生物如酵母的血清白蛋白，如人血清白蛋白。
背景技术：
白蛋白用于治疗有严重烧伤，休克或失血的病人。它也用于补充培养高等真核细胞的培养基和作为药理学活性化合物(其中许多需要稳定化)的赋形剂。白蛋白融合蛋白是一种蛋白与白蛋白或与其变体或片段的融合体，并且提高所述蛋白的半衰期，如增加的体内半衰期。目前，白蛋白是从血液产品，如血清中获得，或在微生物，如酵母中或由转基因植物或动物重组产生。为了提供足够纯的产品以满足使用者的需要和/或获得高产量的产品，白蛋白必须从生产源中纯化出来。目前白蛋白产品的一个问题是所需的纯化方法。能够获得高纯度但是这需要多个费时和/或昂贵的层析纯化步骤。例如，WO 2000/044772中描述的纯化方法包括三步骤的方法阳离子交换层析然后是阴离子交换层析然后是染料结合(亲和)层析。因此，需要一种更简单的纯化方法。
发明内容
本发明提供一种更简单的白蛋白纯化方法。因此本发明涉及一种用于纯化白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法，该方法包括(i)用包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样于包含结合在固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质；(ii)洗涤所述基质以除去至少一些杂质；并(iii)从基质上洗脱白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物，获得纯化的白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。发明人已鉴定了可以用一种单一亲和步骤代替先前白蛋白纯化中使用的公知的分离步骤，如阳离子交换和染料结合方法，所述单一亲和步骤相对于这些公知步骤提高了不想要的蛋白的清除和/或提高了产量。在整个本说明书中，术语“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白和其变体，如天然的或工程化的变体。变体包括多态性，片段如结构域和亚结构域，片段和/或融合蛋白。白蛋白可与SEQ ID No. 1具有至少40，50，60，70，80，90，95，96，97，98，99%的相似性或同一性。附图简述
图1. Prosaptide白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。
泳道样品上样
1.rHA1昭
2.上样1/100
3.上样1/1000
4.穿透(Flow Through)nt.
5.洗涂1nt.
6.洗涤2nt.
7.洗涤3nt.
8.洗涤4nt.
9.洗脱1/1000
10.rHA1昭图2显示T20白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。
泳道样品上样
1.上样1/100
2.上样1/1000
3.穿透Nt
4.洗涤1Nt
5.洗涤2Nt
6.洗涤3Nt
7.洗涤4Nt
8.洗脱1/100
9.洗脱1/1000
10.rHA1昭图3显示ILlRA白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。泳道样品上样
1.上样1/100
2.上样1/1000
3.穿透nt
4.洗涤1nt
5.洗涂2nt
6.洗涂3nt
7.洗涤4nt
8.洗脱1/100
9.洗脱1/1000
10.rHA1昭图4显示AlbuPureTM纯化的动物白蛋白的SDS-PAGE，见实施例8。
IB泳道 2B样品3B上样
_1__SeeBlue Plus2 MW 标准品__5|iL
2__兔血清白蛋白__2|ig3__小鼠血清白蛋白__2昭
_4__大鼠血清白蛋白__2\ig
5__狗血清白蛋白__2|ig
_6__人血清白蛋白__2μ§,_
_7_I SeeBlue Plus2 MW 标准品5|iL图5显示AlbuPureTM纯化的白蛋白片段的SDS-PAGE，见实施例8。
泳道_样品___
J__人血清白蛋白__Ipg
_2__人血清白蛋白结构域1+2__l|igJ__人血清白蛋白结构域2+3__l|ig
_4__人血清白蛋白结构域1+3__l|ig
J__人血清白蛋白结构域3__l|ig
_6_I SeeBlue Plus2 MW 标准品5|iL发明详述本发明涉及一种纯化白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋
白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法。在本申请和权利要求中，术语“纯化”意
指一种方法，通过该方法至少一种不希望得到的化合物，如细胞碎片、其他血浆或宿主细胞
蛋白、盐、脂质碳水化合物等，相对于希望得到的化合物减少了。取决于用于此方法的起始
材料，可从希望得到的化合物，白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋
白中完全地或部分地除去不希望得到的化合物。
作为血浆的最丰富的蛋白质，白蛋白是本领域已知的，人们已经从大量哺乳动物和禽类中描述和表征了白蛋白，并认为其在维持正确的渗透压中具有作用并且其在转运血流中多种化合物中也具有作用。原则上本发明的方法可用于纯化任何已知白蛋白，例如源自人、狗、绵羊、山羊、牛 (bovine)、奶牛(cow)、驴、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸡(chicken)的白蛋白。优选的白蛋白是人血清白蛋白，尤其是具有SEQ ID NO 1中公开的序列的人血清白蛋白。本发明所述的白蛋白变体意指具有白蛋白整体结构但与亲本白蛋白相比已改变了至少一个氨基酸残基的化合物。其中亲本白蛋白是理解为天然的未改变的白蛋白化合物。变体可与亲本白蛋白在多于一个位置上不同，而且原则上只要变体保持白蛋白的整体结构，对于改变的数目没有确定的上限，所述改变包括氨基酸残基的取代、缺失或插入以及化学修饰。在一个优选实施方案中，与亲本白蛋白相比白蛋白变体包含1个改变，优选地至少2个改变，更优选至少5个改变，更优选至少10个改变，甚至更优选至少20个改变，以及最优选具有至少25个改变。白蛋白变体与亲本白蛋白优选地具有至少60%的序列同一性，优选地至少70% 的序列同一性，更优选至少80%的序列同一性，甚至更优选至少90%的序列同一性，甚至更优选至少95%的序列同一性，最优选与亲本白蛋白具有至少98%的序列同一性。在一个优选实施方案中，白蛋白或其片段或变体与SEQ ID No. 1具有至少40，50， 60，70，80，90，95，96，97，98，99% 的序列同一性。同一性两条氨基酸序列之间或两条核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。就本发明而言，两条氨基酸序列之间的同一性的程度是使用如EMBOSS程序包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277)(优选版本3. 0. 0或更新的版本)中的Needle程序所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)来确定的。 使用的可选参数是缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0. 5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的 EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，其是如下计算的(相同的残基数XlOO)/(比对的长度-比对中的缺口总数)。在描述本发明的多种变体时，应用下述的命名法以便参考。在所有的情况中，应用了公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。取代对于氨基酸取代，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，取代的氨基酸]。因此，苏氨酸在位置2 用丙氨酸取代记为“Thr2^Ala”或“T226A”。多个位置突变通过加入标记(“ + ”)分开，例如，“Gly205Arg+kr411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在位置205用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和在位置411用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸( 的突变。缺失对于氨基酸缺失，采用了如下命名法[原始氨基酸，位置 。因此，在位置 195缺失甘氨酸记为“Glyl95*”或“G195*”。多个缺失通过加入标记(“ +，，)分开，例如， "Glyl95*+Ser4ir” 或 “G195*+S411*，，。插入对于氨基酸插入，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸]。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸记为“Glyl95GlyLys”或 “G195GK”。多个氨基酸插入记为[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸#1， 新插入的氨基酸#2 ；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为 “Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA，，。在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为
权利要求
1.一种用于纯化白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法，所述方法包括(i)用含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样包含结合在固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质；( )洗涤所述基质以除去至少一些杂质；并(iii)从所述基质上洗脱白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物，以提供纯化的白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。
2.依照权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白源自哺乳动物，如人、兔、小鼠、山羊、 绵羊、牛；或者源自禽类，如鸡。
3.依照权利要求1或2所述的方法，其中所述白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物含有与HSA的序列(SEQ ID NO 1)具有至少60 %序列同一性，优选至少70 %，优选至少80 %，优选至少85 %同一性，更优选至少90%同一性，甚至更优选至少95%同一性，甚至更优选至少97%的序列同一性， 以及最优选至少99%序列同一性的序列。
4.依照权利要求3所述的方法，其中与HSA具有至少80%序列同一性的序列包含至少10个连续的氨基酸，更优选至少25个氨基酸，更优选至少50个氨基酸，以及最优选至少 100个氨基酸。
5.依照权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白特异性配体是2-氯-4，6-二O’-硫代苯胺)-S-三嗪。
6.依照权利要求1所述的方法，其中所述包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白(或其变体或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其变体或片段)的缀合物的水溶液选自发酵上清液、部分纯化的发酵上清液、血清、血清级分或者部分纯化的血清或血清级分、转基因原料的乳或者转基因植物的提取物。
7.依照权利要求1或权利要求6所述的方法，其中上样到所述基质上的包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液具有4-9. 5，更优选pH4-9，甚至更优选4-8，以及最优选4_7的pH。
8.依照权利要求1所述的方法，其中所述洗涤是通过具有连续升高的PH的一次或多次洗涤进行的。
9.依照权利要求8所述的方法，其中第一次洗涤具有在pH4.0-6.0的范围内的pH。
10.依照权利要求8或9所述的方法，其中最后一次洗涤具有在pH7.0-8. 0的范围内的pH。
11.依照权利要求8-10所述的方法，其中在第一次和最后一次洗涤步骤之间具有至少一次额外的洗涤步骤。
12.依照权利要求1所述的方法，其中使用含有脂肪酸的盐或硫氰酸盐的水溶液，或者在PHlO或更高的条件下，从所述基质上洗脱所述白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。
13.依照权利要求12所述的方法，其中所述的脂肪酸的盐在水中具有大于IOmM的溶解度。
14.依照权利要求13所述的方法，其中所述的脂肪酸盐是选自丁酸、戊酸、己酸、庚酸、 辛酸、壬酸、癸酸的盐。
15.依照权利要求12-14所述的方法，其中洗脱缓冲液中所述脂肪酸盐的浓度是在 5mM-0. 5mM的范围内，优选在IOmM-IOOmM的范围内。
16.依照权利要求12所述的方法，其中所述硫氰酸盐是选自钠、钾、铵、钡或其他1族或 2族碱金属的盐。
17.依照权利要求12或16所述的方法，其中所述硫氰酸盐以5mM-lM的范围内，优选 10mM-500mM的范围内的浓度使用。
全文摘要
公开了一种改进的纯化白蛋白(或其变体或片段)、含白蛋白(或其变体或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其变体或片段)的缀合物的方法。
文档编号C07K14/765GK102549012SQ201080019924
公开日2012年7月4日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者J.卡梅隆, L.E.布拉克威尔, M.J.伯顿, P.H.莫顿, R.A.多德, S.J.伯顿 申请人:普罗米蒂克生物科学有限公司, 诺维信生物制药丹麦公司