本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒。
背景技术：
肉制品中有毒代谢物的残留问题越来越多的引起国际社会的关注，为了实现效益最大化，一些不法商贩在动物饲料中非法添加玉米赤霉醇等激素类药物，促进动物机体蛋白质的合成，提高饲料利用率，从而产生促增重作用，获得更多经济回报。玉米赤霉醇及其代谢产物具有雌激素类物质的生物活性，对促性腺激素结合受体、体外肝脏激素结合受体均有抑制作用。雌激素类物质的残留会引起人体性激素机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，可能致癌。
目前，玉米赤霉醇的测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法等，其检测结果准确可靠，但仪器设备比较昂贵，操作繁琐，耗时，且样本前处理过程相对复杂，对操作人员要求较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种低成本、快速而准确的食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒，包括酶标板、玉米赤霉醇标准品、玉米赤霉醇抗体工作液、玉米赤霉醇酶标二抗工作液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液；所述的玉米赤霉醇抗原的制备，是通过玉米赤霉醇半抗原与兔血清白蛋白偶联得到，具体步骤为：取0.05mmol玉米赤霉醇半抗原与兔血清白蛋白按6：1的结合比混合在0.06mol/L的pH值9.0的碳酸盐缓冲液中，然后加入0.12mmol碳化二亚胺，搅拌置于室温条件下反应20h，再于0.16～0.18mol/L的pH值7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存，得玉米赤霉醇抗原。
作为本发明进一步的方案：所述的玉米赤霉醇半抗原是采用混合酸酐法将玉米赤霉醇与鸡卵清白蛋白偶联得到，具体步骤为：将0.5mmol玉米赤霉醇溶于12～15ml无水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室温下反应2.5～3.0h，离心，将下层固体溶于14～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸异丁酯，继续反应2.0～2.5h；将上述反应液加入到12～14ml含有6～8mg/ml鸡卵清白蛋白的磷酸缓冲液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲液透析4～5次，冷冻干燥，得到玉米赤霉醇半抗原。
作为本发明进一步的方案：所述的酶标板的制备，步骤为：用0.055～0.058mol/L的pH值9.2～9.4的碳酸盐缓冲液作为包被液，将玉米赤霉醇抗原稀释成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5wt.%兔血清白蛋白封闭液，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
作为本发明进一步的方案：所述的玉米赤霉醇标准品的的浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.32ng/mL、0.64ng/mL、1.28ng/mL、2.56ng/mL。
作为本发明进一步的方案：所述的底物A液为含有0.60～0.65mmol/L的过氧化氢的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；所述的底物B液为四甲基联苯二胺溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。
作为本发明进一步的方案：所述的浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，其为0.06～0.08mol/L的pH值7.3～7.4的磷酸盐缓冲液；所述的浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.6～0.7wt.%吐温-20、0.012～0.15mol/L的pH值7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。
利用所述的食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
（1）预处理待测样品：将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；
（2）检测：取包被有玉米赤霉醇抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、玉米赤霉醇酶标二抗工作液、玉米赤霉醇抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应35～40min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤2～3次，每次间隔10s，拍干后加入底物A液50μL/孔，底物B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置常温避光环境中反应10～12min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于350nm处或双波长350/620nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以标准品浓度的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；
（3）分析结果：对照标准曲线计算样品中玉米赤霉醇的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用样品中的玉米赤霉醇与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中玉米赤霉醇的含量。如果样品中的玉米赤霉醇含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒，包括酶标板、玉米赤霉醇标准品、玉米赤霉醇抗体工作液、玉米赤霉醇酶标二抗工作液、底物A液、底物B液、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液；底物A液为含有0.62mmol/L的过氧化氢的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；底物B液为四甲基联苯二胺溶液；终止液为2mol/L的盐酸溶液；浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，其为0.07mol/L的pH值7.3的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.64wt.%吐温-20、0.014mol/L的pH值7.4的磷酸盐缓冲液。
1、玉米赤霉醇抗原的制备
（1）采用混合酸酐法制得玉米赤霉醇半抗原
将0.5mmol玉米赤霉醇溶于14ml无水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室温下反应2.8h，离心，将下层固体溶于14～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸异丁酯，继续反应2.4h；将上述反应液加入到14ml含有7mg/ml鸡卵清白蛋白的磷酸缓冲液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲液透析5次，冷冻干燥，得到玉米赤霉醇半抗原，备用。
（2）玉米赤霉醇半抗原与兔血清白蛋白偶联得到玉米赤霉醇抗原
取0.05mmol玉米赤霉醇半抗原与兔血清白蛋白按6：1的结合比混合在0.06mol/L的pH值9.0的碳酸盐缓冲液中，然后加入0.12mmol碳化二亚胺，搅拌置于室温条件下反应20h，再于0.17mol/L的pH值7.3的磷酸盐缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存，得玉米赤霉醇抗原，备用。
2、玉米赤霉醇抗体的制备
选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取玉米赤霉醇抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合，采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量玉米赤霉醇抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞9天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000rpm离心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20℃保存，得玉米赤霉醇抗体，备用。
3、酶标板的制备
用0.056mol/L的pH值9.3的碳酸盐缓冲液作为包被液，将玉米赤霉醇抗原稀释成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5wt.%兔血清白蛋白封闭液，150μL/孔，37℃放置2h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板置于常温条件下晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
4、玉米赤霉醇标准品的配制
将玉米赤霉醇配制成浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.32ng/mL、0.64ng/mL、1.28ng/mL、2.56ng/mL的玉米赤霉醇标准品。
5、玉米赤霉醇抗体工作液的制备
采用玉米赤霉醇人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：40000比例，得到玉米赤霉醇抗体工作液。
6、玉米赤霉醇酶标二抗工作液的制备
由酶标二抗加稀释液稀释成1：4000比例，得到玉米赤霉醇酶标二抗工作液。
利用所述的食品中玉米赤霉醇的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
（1）预处理待测样品：将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；以固态样品为例，具体预处理的一种操作为：研磨待测样品，过筛，称取5g研磨过滤后的样品加入50mL、体积浓度为70%的甲醇溶液，在密封的容器里混合震荡10min，离心取上清液用样品稀释液稀释成1：20比例，混匀待测。
（2）检测：取包被有玉米赤霉醇抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、玉米赤霉醇酶标二抗工作液、玉米赤霉醇抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应38min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤3次，每次间隔10s，拍干后加入底物A液50μL/孔，底物B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置常温避光环境中反应12min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于350nm处或双波长350/620nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以标准品浓度的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）分析结果：对照标准曲线计算样品中玉米赤霉醇的含量。
本发明利用样品中的玉米赤霉醇与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中玉米赤霉醇的含量。如果样品中的玉米赤霉醇含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。