一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂及其制备方法、染色组合、应用及标记酶染色试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种敏感的用于辣根过氧化物酶染色的染色剂及其制备方法、染色组合、应用及标记酶染色试剂盒。

背景技术：

辣根过氧化物酶(HRP)，是生物、医学和药学实验和检测中最常用的定性和定量的一种标记酶，可以用于标记蛋白、核酸、病毒、肿瘤因子、药物、毒物、细胞因子、抗体、抗原、受体，以及血液、脑脊液、组织中的特定成分等。HRP本身没有颜色，要通过染色方法显色，才能对所检测物质的性质和含量进行定性或定量。

目前最为常用的HRP的染色方法为二氨基联苯铵染色法。但是该方法存在以下缺点：(1)该方法不敏感，对标记物的染色不深，不易染出少量的检测物质，易产生假阴性结果，得出没有被检物的错误结论；(2)该方法特异性差，没有标记物的部分也可能被染成黄色，将非特异性物质一并染出，易得出假阳性结果，造成误认为有被检物的错误结果；(3)该方法的步骤繁杂，操作麻烦，费时费力。总之，采用该方法对HRP的染色分辨率不高，极易造成错误判断。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合，该染色组合可用于制备记酶染色试剂盒。

本发明的第二目的在于提供一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合在制备标记酶染色试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种标记酶染色试剂盒，此试剂盒灵敏度和分辨率相比于传统检测方法高十倍以上。

本发明的第四目的在于提供一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合，此染色组合能够使HRP染色深度和分辨率明显提高，且可以减少假阴性和假阳性的误判。

本发明的第五目的在于提供一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备方法，该制备方法操作步骤简单可靠，操作更方便。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合，按重量份数计，染色组合包括以下试剂：二氨基联苯胺40-60份、硫酸镍铵10-20份、葡萄糖90-110份、氯化铵30-50份、葡萄糖氧化酶3-8份、醋酸5-15份、及醋酸钠10-30份。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合在制备标记酶染色试剂盒中的应用。

一种标记酶染色试剂盒，其包括用于辣根过氧化物酶染色的染色组合。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂，由用于辣根过氧化物酶染色的染色组合制成。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备方法，其包括：将二氨基联苯胺配制成二氨基联苯胺水溶液，作为第一混合物；将硫酸镍铵配制成硫酸镍铵配水溶液，作为第二混合物；将葡萄糖、氯化铵与葡萄糖氧化酶混合形成第三混合物；将醋酸及醋酸钠配制成醋酸钠水溶液，作为第四混合物；将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合。

本发明提供的一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂及其制备方法、染色组合、应用及标记酶染色试剂盒的有益效果是：

本发明提供的一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合主要由包括二氨基联苯胺40-60份、硫酸镍铵10-20份、葡萄糖90-110份、氯化铵30-50份、葡萄糖氧化酶3-8份、醋酸5-15份、及醋酸钠10-30份在内的试剂分别密封组成。其中各种试剂通过合理的配比能够协同配合产生化学反应，从而可用于制备记酶染色试剂盒。

本发明提供的一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合的应用，该应用可用于制备标记酶染色试剂盒。

本发明提供的一种标记酶染色试剂盒，包括用于辣根过氧化物酶染色的染色组合。该试剂盒相比于普通用于检测HRP的试剂盒的灵敏度和分辨率高十倍以上。

本发明提供的用于辣根过氧化物酶染色的染色剂，由本发明提供的用于辣根过氧化物酶染色的染色组合制成，由于敏感能够使HRP染色明显加深，减少假阴性结果。由于分辨率高，能抑制非特异染色，减少假阳性结果。因此染色效果更好，以减少误判。

本发明提供的一种用于辣根过氧化酶染色的染色剂的制备方法，包括：将二氨基联苯胺配制成二氨基联苯胺水溶液，作为第一混合物；将硫酸镍铵配制成硫酸镍铵配水溶液，作为第二混合物；将葡萄糖、氯化铵与葡萄糖氧化酶混合形成第三混合物；将醋酸及醋酸钠配制成醋酸钠水溶液，作为第四混合物；分别形成的四种混合物为进一步反应做准备，操作更有次序和条理。将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合。按照该顺序制备得到的染色剂，能够使HRP明显染色。由于敏感和分辨率高，能检测出被HRP标记的微量特异性物质，而抑制对非特异性物质的误染。该制备方法操作简单易行，结果可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的实验组1检测结果图；

图2为本发明实验例1提供的实验组2检测结果图；

图3为本发明实验例1提供的实验组3检测结果图；

图4为本发明实验例1提供的实验组4检测结果图；

图5为本发明实验例1提供的实验组5检测结果图；

图6为本发明实验例1提供的实验组6检测结果图；

图7为本发明实验例2提供的实验组1检测结果图；

图8为本发明实验例2提供的实验组2检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂及其制备方法、染色组合、应用及标记酶染色试剂盒进行具体说明。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色组合，本实施例中，按重量份数计，染色组合包括以下试剂：二氨基联苯胺40-60份、硫酸镍铵10-20份、葡萄糖90-110份、氯化铵30-50份、葡萄糖氧化酶3-8份、醋酸5-15份、及醋酸钠10-30份；优选地，考虑到使用方便，染色组合还包括：蒸馏水270-330份。

其中，蒸馏水可用于溶解二氨基联苯胺、硫酸镍铵、及醋酸和醋酸钠。本实施例中，二氨基联苯胺能够使HRP染色成棕色；硫酸镍铵可改变二氨基联苯胺的显色反应的颜色；葡萄糖、氯化铵及葡萄糖氧化酶在一起，可缓慢均匀地释放氧分子，从而彻底氧化二氨基联苯胺，使其显色更深；醋酸和醋酸钠可提供酸性环境，从而可把检测标本染出蓝黑色。

优选地，在本实施例中，葡萄糖为右旋葡萄糖。相比于左旋葡萄糖，右旋葡萄糖更易被葡萄糖氧化酶彻底氧化。

需要说明的是，上述各种试剂的配比及用量均经过科学设计，各种试剂之间按照一定的添加顺序进行混合，充分发挥试剂的效用，利用多步化学反应，使各试剂之间相互作用，制备得到高效的染色剂，有利于对HRP进行快速高效地染色。

需要说明的是，在本实施例中，为了避免试剂暴露在空气中发生挥发等物理反应或发生潮解等化学反应，从而失去染色的效能，需要对试剂进行妥善保存，优选地，将每种试剂进行单独密封保存在密封容器内。这里的密封容器不做具体限制，凡是能够实现试剂密封的容器均应包括在内。在本实施例中，优选地，为密封瓶。

进一步地，考虑到便于辨别各种试剂，优选地，在每个密封容器上先设置有标记，再将每种试剂密封在相应的密封容器中。这里的标记方式不做具体限制，包括图形、文字以及标号等各种形式。优选地，在本实施例中，采用标号的方式。

本实施例提供的用于辣根过氧化物酶染色的染色组合可用于制备标记酶染色试剂盒。

一种标记酶染色试剂盒，其包括本实施例提供的用于辣根过氧化物酶染色的染色组合。具体地，将装有试剂且设置有相应标号的密封玻璃瓶装入纸盒中，即得到该试剂盒。

在本实施例中，还提供了一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂，该染色剂由用于辣根过氧化物酶染色的染色组合制成。

该染色剂的具体制备方法如下：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水、第二份蒸馏水和第三份蒸馏水。三份蒸馏水分别用于溶解醋酸和醋酸钠的混合物、二氨基联苯胺、及硫酸镍铵。

然后将二氨基联苯胺与第一份蒸馏水混合形成第一混合物；将硫酸镍铵与第二份蒸馏水混合形成第二混合物；将葡萄糖、氯化铵与葡萄糖氧化酶混合形成第三混合物；将醋酸、醋酸钠与第三份蒸馏水混合形成第四混合物。

需要说明的是，在本实施例中，为了充分溶解醋酸和醋酸钠的混合物、二氨基联苯胺、及硫酸镍铵，第一份蒸馏水、第二份蒸馏水和第三份蒸馏水的质量比为9-11:9-11:9-11。发明人根据自己的创造性劳动结合自身经验，得到优选值为：第一份蒸馏水、第二份蒸馏水和第三份蒸馏水的质量比为1:1:1。

接着，先将第一混合物与第二混合物混合，以使硫酸镍铵改变二氨基联苯胺的显色反应的颜色；再将其与第三混合物混合，第三混合物释放出来的氧分子能够彻底氧化二氨基联苯胺，使其显色更深；最后再与第四混合物混合。其中，第四混合物混合能够为染色剂提供酸性环境。优选地，该酸性环境的pH值为5.5-6.5。

最后，将染色剂与被检样品接触后观察颜色。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种标记酶染色试剂盒的制备：

将二氨基联苯胺40份、硫酸镍铵10份、右旋葡萄糖90份、氯化铵30份、葡萄糖氧化酶3份、醋酸5份、醋酸钠10份、及蒸馏水270份依次装入设置有标号为1-8的8个密封瓶中，再放入纸盒中得到试剂盒。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水90份、第二份蒸馏水90份和第三份蒸馏水90份；

然后将二氨基联苯胺40份与第一份蒸馏水90份混合形成第一混合物；将硫酸镍铵10份与第二份蒸馏水90份混合形成第二混合物；将右旋葡萄糖90份、氯化铵30份、及葡萄糖氧化酶3份混合形成第三混合物；将醋酸5份、醋酸钠10份与第三份蒸馏水90份混合形成第四混合物。

接着，将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合，得到染色剂。

实施例2

一种标记酶染色试剂盒的制备：

将二氨基联苯胺60份、硫酸镍铵20份、右旋葡萄糖110份、氯化铵50份、葡萄糖氧化酶8份、醋酸15份、醋酸钠30份、及蒸馏水330份依次装入设置有标号为1-8的8个密封瓶中，再放入纸盒中得到试剂盒。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水110份、第二份蒸馏水110份和第三份蒸馏水110份；

然后将二氨基联苯胺60份与第一份蒸馏水110份混合形成第一混合物；将硫酸镍铵20份与第二份蒸馏水110份混合形成第二混合物；将右旋葡萄糖110份、氯化铵50份、及葡萄糖氧化酶8份混合形成第三混合物；将醋酸15份、醋酸钠30份与第三份蒸馏水110份混合形成第四混合物。

接着，将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合，得到染色剂。

实施例3

一种标记酶染色试剂盒的制备：

将二氨基联苯胺50份、硫酸镍铵15份、右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、葡萄糖氧化酶5份、醋酸10份、醋酸钠20份、及蒸馏水300份依次装入设置有标号为1-8的8个密封瓶中，再放入纸盒中得到试剂盒。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水100份、第二份蒸馏水100份和第三份蒸馏水100份；

然后将二氨基联苯胺50份与第一份蒸馏水100份混合形成第一混合物；将硫酸镍铵15份与第二份蒸馏水100份混合形成第二混合物；将右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、及葡萄糖氧化酶5份混合形成第三混合物；将醋酸10份、醋酸钠20份与第三份蒸馏水100份混合形成第四混合物。

接着，将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合，得到染色剂。

实施例4

一种标记酶染色试剂盒的制备：

将二氨基联苯胺50份、硫酸镍铵15份、右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、葡萄糖氧化酶5份、醋酸10份、醋酸钠20份、及蒸馏水300份依次装入设置有标号为1-8的8个密封瓶中，再放入纸盒中得到试剂盒。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水90份、第二份蒸馏水100份和第三份蒸馏水110份；

然后将二氨基联苯胺50份与第一份蒸馏水90份混合形成第一混合物；将硫酸镍铵15份与第二份蒸馏水100份混合形成第二混合物；将右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、及葡萄糖氧化酶5份混合形成第三混合物；将醋酸10份、醋酸钠20份与第三份蒸馏水110份混合形成第四混合物。

接着，将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合，得到染色剂。

实施例5

一种标记酶染色试剂盒的制备：

将二氨基联苯胺50份、硫酸镍铵15份、右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、葡萄糖氧化酶5份、醋酸10份、醋酸钠20份、及蒸馏水300份依次装入设置有标号为1-8的8个密封瓶中，再放入纸盒中得到试剂盒。

一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备：

首先将蒸馏水分为第一份蒸馏水110份、第二份蒸馏水100份和第三份蒸馏水90份；

然后将二氨基联苯胺50份与第一份蒸馏水110份混合形成第一混合物；将硫酸镍铵15份与第二份蒸馏水100份混合形成第二混合物；将右旋葡萄糖100份、氯化铵40份、及葡萄糖氧化酶5份混合形成第三混合物；将醋酸10份、醋酸钠20份与第三份蒸馏水90份混合形成第四混合物。

接着，将第一混合物与第二混合物混合后与第三混合物混合、最后再与第四混合物混合，得到染色剂。

实验例1

1、实验材料：等量的二氨基联苯胺染色剂及实施例1-5提供的染色剂。

2、实验分组：将实施例1-5提供的染色剂及二氨基联苯胺染色剂分别分为实验组1-6组。

3、实验处理方法：

(1)实验动物：SD大鼠1只，体重200-250g，由第一军医大学实验动物中心提供。

(2)GABA(γ-氨基丁酸)免疫组织化学组：大鼠经腹腔注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉。开胸后剪开右心耳，经左心室插管至升主动脉，快速输入0.9％生理盐水100ml，将血液冲洗干净。快速灌注含2.5％戊二醛和10g/L焦亚硫酸钠的0.1mol/L二甲砷酸溶液500ml。开颅取脑后置于上述固定液中后固定约2h。再置于含30％蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液中(4℃，pH7.4)直至沉底。恒冷箱切片机在-20℃条件下进行连续切片6片，依次进行编号1-6号，切片厚度为5μm，将切片收集于0.1mol/L磷酸缓冲液中备用。

(3)免疫组化：

1-6号切片分别经二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，PBS清洗5min×3次；如果切片中内源性过氧化物酶较多，以3％H₂O₂孵育切片10min(室温)，用PBS清洗5min×3次(抗原修复在此步后进行)；以封闭剂加切片，并在37℃湿盒中温育20min(湿盒温度在37℃平衡，以下同)；吸去封闭剂，勿洗；加入兔抗大鼠GABA(Chemicon，美国)抗体在湿盒中4℃孵育48h，0.01mol/L的PBS清洗5min×3次；加入加生物素化二抗，0.01mol/L的PBS清洗5min×3次；再加入辣根过氧化酶标记的联袂卵白素工作液，37℃温箱孵育20min，0.01mol/L的PBS清洗5min×3次。

(3)显色反应

将实验组1-6提供的染色剂分别对1-6号切片进行显色，约4分钟。各切片用0.1％明胶裱于载玻片上，室温下干燥。依次经(体积比为70％、75％、85％、90％、95％及100％)酒精脱水。二甲苯透明、DPX封片。OLYMPUS显微镜下观察照相。

4、观察指标：

由图1-6可知，实验组6显色的6号切片呈现出背景色棕黄色，并未见GABA受体；实验组1-5显色的1-5号切片出现明显的蓝黑色颗粒状染色部分，该部分即为GABA受体。由此可见，采用本发明提供的试剂盒配置的染色剂用于辣根过氧化酶的染色分辨率和灵敏度明显优于二氨基联苯胺染色法。

实验例2

1、实验材料：等量的二氨基联苯胺染色剂及实施例3提供的染色剂。

2、实验分组：将实施例3提供的染色剂及二氨基联苯胺染色剂分别分为实验组1组和2组。

3、实验处理方法：

(1)实验动物：SD大鼠1只，体重200-250g，由第一军医大学实验动物中心提供。

(2)OT(鼠抗催产素)免疫组织化学组：大鼠经腹腔注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉。开胸后剪开右心耳，经左心室插管至升主动脉，快速输入0.9％生理盐水100ml，将血液冲洗干净。快速灌注含2.5％戊二醛和10g/L焦亚硫酸钠的0.1mol/L二甲砷酸溶液500ml。开颅取脑后置于上述固定液中后固定约2h。再置于含30％蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液中(4℃，ph7.4)直至沉底。恒冷箱切片机在-20℃条件下对下丘脑进行连续切片2片，依次进行编号1和2号，切片厚度为5μm，将切片收集于0.1mol/L磷酸缓冲液中备用。

(3)免疫组化：

1号切片和2号切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，PBS清洗2次×5min；如果切片中内源性过氧化物酶较多，以3％H₂O₂孵育切片10min(室温)，用PBS清洗2次×5min(抗原修复在此步后进行)；以封闭剂加切片，并在37℃湿盒中温育20min(湿盒温度在37℃平衡，以下同)；吸去封闭剂，勿洗；加一抗稀释液配制的鼠抗OT抗体工作液，37℃，60min湿盒湿育或湿盒中4-8℃过夜，用PBS清洗2次×5min；加生物素化二抗，37℃湿盒中湿育30min，用PBS清洗2次×5min；加入辣根过氧化酶标记链亲素，37℃湿盒中湿育30min，用PBS清洗2次×5min。

(3)显色反应

将实验组1和2提供的染色剂分别对1和2号切片进行显色，约4分钟。各切片用0.1％明胶裱于载玻片上，室温下干燥。依次经(体积比为70％、75％、85％、90％、95％及100％)酒精脱水。二甲苯透明、DPX封片。OLYMPUS显微镜下观察照相。

4、观察指标：

由图7和8可知，实验组2显色的2号切片呈浅棕色，可见染色的阳性反应细胞和纤维不多；实验组1显色的1号切片出现明显的蓝黑色染色部分，染出的阳性神经细胞和纤维量远远超过二氨基联苯胺染色法。由此可见，采用本发明提供的试剂盒配置的染色剂用于辣根过氧化酶的染色分辨率和灵敏度高，明显优于二氨基联苯胺染色法。

综上所述，本发明提供的一种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂及其制备方法、染色组合、应用及标记酶染色试剂盒具有以下优点：

(1)用于辣根过氧化物酶染色的染色组合可应用于制备标记酶染色试剂盒。

(2)标记酶染色试剂盒的灵敏度高，该试剂盒配制的用于辣根过氧化物酶染色的染色剂用于辣根过氧化酶的染色，其灵敏度高出现有方法的10倍以上，可检测出现有方法不能检测的极微量的分子以及蛋白等，避免产生假阴性结果。

(3)标记酶染色试剂盒的分辨率高，该试剂盒配制的用于辣根过氧化物酶染色的染色剂用于辣根过氧化酶的染色，其能够避免将非特异性物质染色，防止错染或误染等情况，避免产生假阳性结果。

(4)这种用于辣根过氧化物酶染色的染色剂的制备步骤简单可靠，容易操作；得到的染色剂染色速度快，能够加速检测时间。

因此本发明提供的标记酶染色试剂盒，是高质量的检测HRP的手段。可避免一些由于假阳性和假阴性检测结果造成的错误危害。在医学实验和生物学实验的研究上具有广泛应用前景，具有可靠及巨大的社会和经济效益。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。