本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人胃蛋白酶原ii的试剂盒。
背景技术：
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群1-5组分的免疫原性相同称pgi。主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌，组分6-7称pgii，由胃体的胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的brunner腺也能产生pgii，前列腺和胰腺也产生少量pgii。正常情况下约1％的pg进入血循环，进入的量十分稳定，因此血清pgi、ii反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反应胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清pg含量也随之改变。被称为胃黏膜的“血清学活检”。因此血清pgi反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。
国内外临床研究表示，pgi升高提示胃黏膜破损可能性高，萎缩性胃炎是胃癌的主要癌前病变，当发生萎缩性胃炎时，腺体和主细胞数量减少，引起胃蛋白酶原i分泌下降，而胃蛋白酶原ii含量保持稳定，因此血清胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值降低。胃溃疡患者血清胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值升高，但在癌变患者中胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值是降低的。由于在胃部感染-萎缩性胃炎-胃癌的发展过程中，均伴随着胃蛋白酶原的变化，胃蛋白酶原不仅成为这三种病变的良好诊断析指标，而且是治疗和预防干预过程中最要的监测指标。因此，检测血清胃蛋白酶原i与胃蛋白酶原ii的含量以及比值变化对胃部疾病的诊断具有多方面的临床意义。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种检测人胃蛋白酶原ii蛋白的试剂盒。
本发明至少包括样本稀释液、酶标液、胃蛋白酶原ii标准品、包被胃蛋白酶原ii抗体的酶联板、显色底物、洗涤液，酶联板上包被有动物抗人胃蛋白酶原ii多抗。动物抗人胃蛋白酶原ii多抗作为酶联包被捕获抗体，从而获得更多的表位，提高人胃蛋白酶原ii捕获率，酶标液为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人胃蛋白酶原ii蛋白单克隆抗体。另外用于免疫动物的人胃蛋白酶原ii蛋白先经过ph7.3～7.5的pbs预处理，使其弱碱性化，从而与人体血液中人胃蛋白酶原ii形态一致，从而其暴露表位与人体血液中人胃蛋白酶原ii，避免非特异位点暴露，提高特异性。另外本发明还可以包括2～4m硫酸作为终止液，使显色完成后，显色稳定方便检测。本发明为了提高检测的稳定性，将样本稀释液酸碱度调整为ph7.0～8.0的pbs缓冲体系，从而使之更加接近人体血液体系酸碱度。为了获得更加特异性的检测抗体，本发明使用人胃蛋白酶原ii免疫小鼠，获得鼠抗人胃蛋白酶原ii抗体。
本发明胃蛋白酶原i抗体采用以下方法获得：我们从临床标本中获得人胃蛋白酶原ii又称为胃蛋白酶原c(pepsinogenc，pgc)的编码基因，并将其克隆入大肠杆菌表达载体pet-28a，然后在大肠杆菌bl21[de3]中进行了诱导表达。sds-page的结果显示，我们在大肠杆菌表达体系中成功地表达了高水平的胃蛋白酶原ii。经鉴定，表达的胃蛋白酶原ii在大肠杆菌中以包涵体的形式存在。采用镍亲和层析纯化重组胃蛋白酶原ii。使用所获得的胃蛋白酶原ii免疫动物，制得动物抗人胃蛋白酶原ii多抗。单抗的制备及纯化，使用上述dna重组技术原核表达的胃蛋白酶原ii蛋白为抗原，分别免疫balb/c小鼠，按常规杂交瘤技术获得阳性克隆。经生物学特性鉴定后，将稳定传代和稳定分泌单抗的杂交瘤细胞腹腔注射balb/c小鼠制备腹水。腹水经50％饱和硫酸铵沉淀粗提，pbs透析后，再经proteinasepharose-4bfastflow柱层析纯化，获得胃蛋白酶原ii单抗。
本发明为了提高双抗夹心法信号强度采用了生物素与亲和素放大系统，使用亲和素标记辣根过氧化物酶，同时使用生物素标记抗人胃蛋白酶原ii单抗，然后按效价混合获得偶联物，将偶联物稀释到一定比例后使用，其中抗人胃蛋白酶原ii单抗优选为鼠抗人胃蛋白酶原i单抗。
本发明为了提高特异性反应减少反应过程中封闭蛋白释放从而导致酶标板固相载体表面非特异性吸附，在样本稀释液与酶标液中均加入了0.5％～1％的bsa作为反应过程封闭蛋白，降低非特异性吸附。
本发明为了满足定量检测及质控需求，在试剂盒中加入了胃蛋白酶原ii标准品，根据正常人分布区间，在正常人分布区间上两端0～10ng/ml、15～25ng/ml进行分布设计有一个标准品，从而使之达到对正常人区间质控，同时可以用于制作定量曲线计算样本浓度，另外胃蛋白酶原ii标准品优选为5个标准品，一个低值标准品，浓度≤5ng/ml，优选2.5ng/ml、一个高值标准品，浓度≥20ng/ml，优选25ng/ml一个中值标准品，浓度10～15ng/ml之间，优选12.5ng/ml，两个正常区间端值标准品，浓度区间分别5～10ng/ml、15～25ng/ml，优选7.5ng/ml，20ng/ml。
具体实施方式
实施例1：
一种由样本稀释液、酶标液、胃蛋白酶原ii标准品、包被胃蛋白酶原ii抗体的酶联板、
tmb显色底物、洗涤液组成的试剂盒，其组分配方如下：
样本稀释液：ph7.0～8.0的pbs加入1％的bsa，0.05％吐温-20；
酶标液：hrp标记的亲和素-生物素化的鼠抗人胃蛋白酶原ii抗体，经过ph7.3-7.5的pbs稀释后得到；
包被胃蛋白酶原ii抗体的酶联板：使用兔抗人胃蛋白酶原ii多抗包被的酶联板；
tmb显色底物：sigma商品化tmb显色底物
洗涤液：ph7.3-7.5的pbs加入0.05％吐温-20。
胃蛋白酶原ii标准品：重组胃蛋白酶原ii蛋白溶于ph7.3-7.5的pbs，0.05％吐温-20，2份，浓度分别为7.5ng/ml、20ng/ml；
经过对试剂盒进行线性、最低检出限和准确度评估：
1)采用阴性山羊血清作为稀释液将胃蛋白酶原ii配制成浓度为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5ng/m的标准浓度样本，通过试剂盒进行检测，在7.5～20ng/ml区间内其线性r＞0.99，在25～25ng/ml区间内其线性r＞0.99；
2)采用阴性山羊血清作为0ng/ml标准品进行10复孔检测，其最低检出限为0.77ng/ml；
3)采用10次复孔检测确定胃蛋白酶原ii浓度为2ng/ml的人血清样本，分别分装为50ul每支，分别加入50ul浓度为5、10、20ng/ml，配制成理论浓度分别为3.5、6、11ng/ml的样本，另取一份加入50ul浓度为0ng/ml的阴性山羊血清作为基础浓度，所有样本进行3复孔同步检测其浓度，计算回收率，
回收率＝2×(理论浓度-基础浓度)/加入浓度
回收率依次为：88.0％、93.0％、95.0％、100.0％
实施例2：
一种由样本稀释液、酶标液、胃蛋白酶原ii标准品、包被胃蛋白酶原ii抗体的酶联板、
tmb显色底物、洗涤液、终止液组成的试剂盒，其组分配方如下：
样本稀释液：ph7.3-7.5的pbs加入1％的bsa，0.05％吐温-20；
酶标液：hrp标记的鼠抗人胃蛋白酶原ii抗体，经过ph7.3-7.5的pbs稀释后得到；
包被胃蛋白酶原ii抗体的酶联板：使用兔抗人胃蛋白酶原ii多抗包被的酶联板，其中免抗人胃蛋白酶原ii多抗由重组人胃蛋白酶原ii经过ph7.35的pbs碱性化后免疫家兔，取血清经过纯化后获得多抗；
tmb显色底物：sigma商品化tmb显色底物
洗涤液：ph7.3-7.5的pbs加入0.05％吐温-20。
终止液：2m硫酸
胃蛋白酶原ii标准品：重组胃蛋白酶原ii蛋白溶于ph7.3-7.5的pbs，0.05％吐温-20，5份，浓度分别为2.5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/ml、20ng/ml、25ng/ml；
经过对试剂盒进行线性、最低检出限和准确度评估：
1)采用阴性山羊血清作为稀释液将胃蛋白酶原ii配制成浓度为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5ng/m的标准浓度样本，通过试剂盒进行检测，在7.5～20ng/ml区间内其线性r＞0.99，在25～25ng/ml区间内其线性r＞0.99；
2)采用阴性山羊血清作为0ng/ml标准品进行10复孔检测，其最低检出限为0.693ng/ml；
3)采用10次复孔检测确定胃蛋白酶原ii浓度为2ng/ml的人血清样本，分别分装为50ul每支，分别加入50ul浓度为5、10、20ng/ml，配制成理论浓度分别为3.5、6、11ng/ml的样本，另取一份加入50ul浓度为0ng/ml的阴性山羊血清作为基础浓度，所有样本进行3复孔同步检测其浓度，计算回收率，
回收率＝2×(理论浓度-基础浓度)/加入浓度
回收率依次为：98.0％、97.0％、105.0％、109.0％
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明。
本说明书中所用的术语“抗体”旨在包括嵌合或重组抗体以及单克隆抗体和多克隆抗体或其蛋白水解片段，例如片段fab或f(ab’)2等。此外，编码抗体的可变区的dna能够被插入到另外的抗体中，以通过此方式产生嵌合抗体。简单链抗体(scfv)能够是由具有抗体的与抗原结合的特征性能力且包含一对与免疫球蛋白的轻链和重链可变区同源或类似的氨基酸序列(vh-vl或scfv键)的简单链形成的多肽。抗体的轻链和重链可变区的多肽类似物，如果需要，能够通过连接多肽结合。产生抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且被包括在现有技术中。