一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体及其酶联免疫检测方法与流程

本发明属于毒素检测技术领域。更具体地，涉及一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体及其酶联免疫检测方法。

背景技术：

细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid，tea)是链格孢霉的主要有毒代谢产物之一，其分子结构式为c9h13o3n(如表2所示)，分子量为197。tea被美国食品药物管理局(foodanddrugadministration，fda)列入有毒化学物，其作为最重要的链格孢霉毒素于1979年被美国国家职业安全及健康组织列入有毒化学物质登记册(《registryoftoxiceffectsofchemicalsubstance》)中(杨欣，2000)。链格孢霉毒素在世界范围内造成经济作物和食物的广泛污染，其中tea在甜瓜、苹果、苹果制品、橘子、橄榄、青椒、红辣椒、番茄、番茄制品、葵花籽、高粱、小麦、食用油(包括橄榄油、菜子油、香油、葵花籽油)等食品中污染较高。目前已知有70多种链格孢霉毒素具有明显毒性，而tea是其中唯一的含氮代谢产物，毒性居链格孢霉毒素之首。并且，有研究表明tea具有多种毒性，tea给人类健康带来了巨大的潜在威胁。

因此，建立快速、简便、灵敏的细交链孢菌酮酸检测方法尤为重要。

目前，对tea的检测主要以仪器法为主，仪器法的准确度和灵敏度都比较高，是一种可靠的检测方法。但是仪器检测需要耗费较多的时间，操作过程比较繁琐外，还需要较大的资金投入，因此较难满足大批量样品的现场筛选需求。

另外，目前关于tea快速检测的报道也不多，且检测对象多是tea的衍生物，衍生过程比较繁琐，给实际样品的检测带来诸多不便。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体及其酶联免疫检测方法，该酶联免疫检测方法具有准确、灵敏、快速、简便的优点，能够高效检测细交链孢菌酮酸，为细交链孢菌酮酸快速检测产品的开发提供了一定的理论指导，对食品安全的监控具有重要意义。

本发明的目的是提供一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体在检测细交链孢菌酮酸中的应用。

本发明的再一目的是提供一种细交链孢菌酮酸的酶联免疫检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种细交链孢菌酮酸的单克隆抗体，是以半抗原tea-cmo偶联血蓝蛋白klh得到的产物tea-cmo-klh作为免疫原，通过动物免疫和杂交瘤技术获得细交链孢菌酮酸单克隆抗体，其中，tea-cmo的结构如下所示：

优选地，所述动物为6月龄的雌性balb/c小鼠。

优选地，制备所述单克隆抗体所用的免疫方法：首次免疫后，过3周进行第2次免疫，此后每隔2周进行1次免疫。

更优选地，所述首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫原，之后的免疫采用等体积弗氏不完全佐剂乳化免疫原，免疫剂量为100μl。第3次免疫后第7天测定抗血清的效价和抑制率，第4次免疫和第5次免疫后同样测定抗血清的效价和抑制率。在细胞融合前3天要加强免疫，每只小鼠不加弗氏佐剂，直接注射100μl免疫原。

优选地，所述杂交瘤技术中将扩大培养的杂交瘤细胞注入10周龄以上且提前7～15d注射500μl石蜡的小鼠体内，然后收集腹水，转速12000r/min离心10min，通过辛酸-硫酸铵法纯化得到细交链孢菌酮酸的单克隆抗体。优选地，所述半抗原tea-cmo是由以下方法制备得到：将相同质量的细交链孢菌酮酸tea与羧甲基羟胺半盐酸盐cmo分别按质量体积比23～27mg：1ml(优选为25mg：1～2ml)溶于混合溶剂a中，然后将cmo溶液加入tea溶液中，混合均匀后，于60～80℃回流加热10～20h(优选为70℃回流加热15h)，减压干燥，加入2～4ml浓度为1～3mol/l(优选为3.0ml2mol/l)的hcl溶解，二氯甲烷萃取减压浓缩得浅棕色油状物，二氯甲烷/正己烷重沉淀纯化油状物，得到粉末tea-cmo；所述混合溶剂a为甲醇、吡啶和水按体积比1：3～5：1(优选为1：4：1)的比例混合而得。

优选地，所述免疫原是由以下步骤制备得到：

s11：将半抗原溶于n,n-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入二环已基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，4℃下搅拌过夜；离心，取上清液记为a液；其中半抗原、二环已基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺三者的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5(优选为1：1.5：1.5)。

s12：取载体蛋白溶解于0.1mol/lpbs中，完全溶解后记为b液；其中载体蛋白与pbs的质量体积比为1mg：0.1～0.2ml(优选为1mg：0.1ml)。

s13：搅拌下将a液滴入b液中，4℃反应10～15h(优选12h)，反应完后离心取上清液，然后4℃下用pbs溶液透析2～4d(优选3d)，每天更换3次透析液，得到细交链孢菌酮酸的免疫原。

优选地，步骤s12中所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白中的一种。

更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白。

具体地，所述细交链孢菌酮酸的单克隆抗体的制备步骤为：

(1)用免疫原tea-cmo-klh免疫小鼠，使得小鼠能够产生有较高抑制率的抗血清；

(2)取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；

(3)将扩大培养的杂交瘤细胞注入小鼠体内，收集腹水，得到单克隆抗体。

优选的，步骤(2)中选取的小鼠为效价和抑制率高的，细胞融合前三天要加强免疫，每只500μl完全抗原。

优选的，步骤(2)中筛选杂交瘤细胞，大概需要3-5次有限稀释。

优选的，步骤(3)中获得的杂交瘤细胞注入小鼠体内后，要经过腹水收集、离心、纯化才能得到单克隆抗体。

优选的，步骤(3)中小鼠为10周龄以上，提前7-15天注射过石蜡，剂量为500μl/只。

优选的，所述离心方法为转速12000r/min，离心10min。纯化方法采用辛酸-硫酸铵法。

另外，上述单克隆抗体在直接检测细交链孢菌酮酸或制备细交链孢菌酮酸直接检测试剂盒中的应用，也都在本发明的保护范围之内。

一种细交链孢菌酮酸的酶联免疫检测方法，该检验方法是以上述细交链孢菌酮酸单克隆抗体建立的酶联免疫法。

优选地，所述的酶联免疫检测方法，具体包括以下步骤：

s1.包被：将1mg/ml的包被原用包被缓冲液稀释1000倍，并做空白对照组，每孔100μl，37℃孵育过夜；

s2.洗涤：倾去孔内液体，洗涤液洗涤2次，甩干；

s3.封闭：每孔加120μl封闭液，37℃封闭3h，甩干，倒置于37℃下1h；

s4.加样及孵育：将标准品细交链孢菌酮酸溶于甲醇配制成1.0mg/ml的溶液，用0.01mol/l的pbs将其稀释到对应浓度0.00098μg/l、0.00391μg/l、0.01563μg/l、0.0625μg/l、0.25μg/l、1μg/l、4μg/l作为标准品溶液；每孔加入50μl标准品溶液和50μl的抗血清(稀释64000倍)，震荡混匀，37℃反应40min后，洗涤5次，甩干；

s5.加二抗：每孔加入100μl以pbs稀释5000倍的hrp-羊抗鼠igg，37℃反应40min，洗涤5次；

s6.显色：每孔加入100μl显色液，37℃显色10min，然后每孔加入50μl的10％h2so4终止反应；

s7.读数测定：450nm波长下测吸光值；选择吸光度值在1.0～1.5区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出；

s8.计算：用origin8.6的四参数拟合模块计算抑制曲线的ic50值。

本发明还涉及制备的单克隆抗体、免疫原、包被原、半抗原在检测细交链孢菌酮酸中的应用。

优选地，将所述单克隆抗体、免疫原、包被原和半抗原应用于制备细交链孢菌酮酸的直接检测试剂盒与胶体金试纸条方面。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的抗细交链孢菌酮酸单克隆抗体，与其他结构类似物没有交叉反应，特异性好，建立的酶联免疫检测方法可以实现对细交链孢菌酮酸的直接检测，方便快捷。

(2)本发明建立的间接酶联免疫检测方法的标准曲线，检出限(ic10)为1.00ng/ml，ic50＝18.50ng/ml，线性检测范围为3.56～96.24ng/ml。在果汁、啤酒样品中的添加回收率在85.5％～119.7％之间，与hplc方法检测结果相关性良好(r²＝0.9132)，表明本发明建立的icelisa检测方法可以应用于实际样品的检测。

(3)本发明以免疫原tea-cmo-klh制备的单克隆抗体作为包被原，建立了细交链孢菌酮酸检测的icelisa方法，为检测食品中细交链孢菌酮酸的含量提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低，对于细交链孢菌酮酸快速检测试剂盒、胶体金试纸条的研发有重要意义。

附图说明

图1为细交链孢菌酮酸人工抗原tea-cmo-klh的紫外吸收光谱图。

图2为细交链孢菌酮酸人工抗原tea-cmo-bsa的紫外吸收光谱图。

图3为细交链孢菌酮酸的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1细交链孢菌酮酸免疫原的制备和表征

1、细交链孢菌酮酸半抗原的制备

将50mg细交链孢菌酮酸(tea，mw＝197.1)和50mg羧甲基羟胺半盐酸盐(cmo，mw＝109.3)分别溶于4.0ml、2.0ml的混合溶剂(甲醇:吡啶:水＝1:4:1)中，然后将溶解后的cmo溶液缓慢加入溶解后的tea溶液中，混合均匀后，置于油浴锅中70℃回流加热15h。反应结束后(监控tea是否反应完全，如未反应完全可继续反应)，将混合物减压干燥，加入3.0ml2mol/l的hcl溶液溶解干燥物。用二氯甲烷多次萃取水相中的合成物，合并有机相，减压浓缩得浅棕色油状物。通过二氯甲烷/正己烷重沉淀纯化，得到浅棕色粉末，即为半抗原tea-cmo。tea的结构如下所示：

2、细交链孢菌酮酸免疫原和包被原的制备

称取半抗原(tea-cmo)0.1mmol溶于0.5mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶剂中，搅拌加入0.0309g(0.15mmol)二环已基碳二亚胺(dcc)和0.0173g(0.15mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，4℃下搅拌反应过夜，离心后上清液为记为a液。称取载体蛋白(klh/bsa/ova)0.02g溶于2ml浓度为0.01mol/l的pbs(ph值7.4)中，充分溶解后标记为b液。磁力搅拌下，将a液慢慢的逐渐滴入b液中，4℃下反应12h。反应完后离心去上清液，即为偶联了载体蛋白的完全抗原溶液，然后4℃下用pbs溶液透析3d，每天更换3次透析液，除去小分子杂质，得到免疫原和包被原。将免疫原和包被原以1mg/ml的浓度分装于1.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。

3、细交链孢菌酮酸免疫原和包被原的表征

(1)免疫原与包被原的鉴定采用紫外扫描的方法，在200～400nm波长范围内测定免疫原和包被原的紫外吸收光谱，比较不同物质的扫描曲线，鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功。由于载体蛋白和半抗原在紫外光谱条件下都具有最大吸收峰，如果偶联成功，特征吸收峰会相互叠加，从而导致最大吸收峰的蓝移。

(2)如图1、图2所示，在280nm左右有载体蛋白特征吸收峰，免疫原的特征吸收峰都出现了明显的蓝移，所以从紫外光谱扫描结果可以证明tea免疫原与包被原合成成功。

实施例2细交链孢菌酮酸单克隆抗体的制备

1、动物免疫

6月龄的雌性balb/c小鼠首次免疫时，注射免疫原的量为0.1ml/只，取1mg/ml的免疫原加等体积的弗氏完全佐剂，乳化充分后的液体在小鼠背部腹部皮下多点注射，每点约200μl；21天后进行第2次免疫，免疫剂量0.1ml/只，用弗氏不完全佐剂乳化；以后每隔14天加强免疫2次，一般共免疫5次。本实验在第3次免疫和第5次免疫后，间隔7天后采血进行抗血清效价测定。细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，直接腹腔注射0.1ml免疫原(不加佐剂)。小鼠免疫后，做好动物编号、管理和记录，注意小鼠的健康状况。免疫方案见表1所示。

表1balb/c小鼠免疫方案

2、抗血清效果分析

(1)第3次和第5次加强免疫后的第7天，小鼠尾部采血200μl，37℃温育30min，6000r/min离心10min，取上清液，加等体积甘油，-20℃保存备用。

(2)采用间接elisa法测定抗血清的效价和特异性，其步骤如下：

s1.包被：将1mg/ml的包被抗原用包被缓冲液稀释1000倍，并做空白对照组，100μl/孔加入到96孔酶标板中，置于37℃水浴箱中孵育过夜。

s2.洗涤：倾去孔内液体，设定洗板机参数每孔加洗涤液300μl，洗板2次，然后甩干洗涤液。

s3.封闭：每孔加120μl封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，置于37℃烘箱1h至烘干。

s4.加抗血清及标准品：将抗血清梯度稀释；将细交链孢菌酮酸标准品溶于适量甲醇配制成1.0mg/ml的标准品溶液，4℃保存备用。效价列：每孔加50μl的空白稀释液和50μl梯度稀释的抗血清，最后两孔加一抗稀释液作空白对照；抑制列：每孔加50μl的标准品溶液和50μl梯度稀释的抗血清，最后两孔加标准品稀释液作空白对照；37℃温育40min，洗板5次。

s5.加二抗：每孔加入100μlhrp-羊抗鼠igg(pbs稀释5000倍)，37℃恒温水浴箱反应40min，洗涤5次。

s6.显色：将显色试剂盒中的a液和b液等体积混合，每孔加入100μl，置于37℃恒温水浴箱显色10min，然后每孔加入50μl的终止液(10％h2so4)。

s7.读数测定：在波长450nm条件下用酶标仪读取吸光值(od)。

(3)选择吸光度值在1.0～1.5区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出。抑制率的计算公式如下：

抗体效果可通过对一定浓度药物的抑制率来表示：相同的药物浓度下，抑制率越高，则抗体对此药物的灵敏度越高。

3、细胞融合和阳性杂交瘤的筛选

(1)复苏骨髓瘤细胞：将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻，融化后1000r/min离心7min，在超净工作台中处理上清液，并在细胞沉淀中加入完全培养液约1ml，吹散细胞，用移液枪取出和完全培养基混均后放入9cm培养皿中，并扩大至5～6皿，其间需换液1～2次，当每个培养皿的细胞铺满底部时，可用于细胞融合。

(2)饲养细胞制备：在细胞融合前1d摘眼球取血，处死昆明小鼠，后经过80％酒精浸泡5min后移入超净工作台进行解剖。小心剪开腹部，勿剪破腹肌，再剥离腹部皮肤，暴露腹肌，用小镊子挑起腹膜，在小鼠腹膜上开一个小口，注入3mlhat完全培养基，用移液枪来回吹打反复抽吸冲洗，并使用移液枪将腹腔里包含饲养层细胞的培养基取出，与培养皿里的培养基混合，操作如此步骤2～3次，以保证得到足够的饲养层细胞。

(3)脾细胞制备：将已多次免疫并检血合格的balb/c小鼠眼眶放血，收集血清，后在80％酒精浸泡5min，消毒体表，移入超净工作台进行解剖。无菌取出脾脏，脾脏周围一般会粘附白色结缔组织，需用剪刀剔除，用rpmi-1640基础培养基冲洗后置于培养皿中待用。用一次性注射器吸取培养基，左手用镊子夹住取下的脾脏，右手将注射器插入脾脏，缓慢注入培养基，以将脾脏里的细胞洗出。反复进行直至脾脏由深红色转为无色透明状，弃脾脏。将混合的培养基收集到50ml离心管中，封口后离心，转速1000r/min共8min。离心后弃去上清液，待用。

(4)细胞融合：将离心去上清液的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞按1:5左右混合于离心管内，加入25ml的基础培养基，封口后离心，转速1000r/min共8min。离心后弃上清，待用。将经离心混合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞弃上清，离心管口朝下用枪吸掉的多余的培养基。因为过多残留的培养基会影响peg的作用效果。将沉淀的细胞用手指轻轻弹松，把离心管置于37℃温水中，用枪头吸取预热至37℃的peg0.8ml，在1min内将peg缓慢加入到沉淀的细胞中，每加一滴peg就用枪头轻柔搅拌一下以混均，但用力不宜过猛，静置1min，预热好完全培养基，在2min内加入10ml，伴随轻轻搅拌，沿着壁加入，千万不要吹散，使peg分开。离心管封口1000r/min离心10min，离心后，倒掉上清，加入hat培养基，用弯头吸管轻轻吸液放液，轻柔搅拌，取出离心管中的hat培养基和大约75ml左右hat新鲜培养基混合，均匀加入到前一天准备的10块含有饲养细胞的96孔培养板里。保持每孔中添加饲养细胞的hat培养基和含有融合细胞的hat培养基体积相同，每板共使用hat培养基大约24ml左右。

(5)阳性杂交瘤的筛选：融合后7～10天内使用hat培养基，再使用ht培养基换液，过渡一周，14天后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时(一般细胞融合12天左右即可)，抽取多孔培养板中里的上清，用间接elisa检测培养液中的特异性抗体，进行效价和抑制率的测定，选择效价高和对药物抑制强的阳性杂交瘤细胞，筛选出融合效果最好的阳性孔，做好标记。在无菌条件下，用显微镜挑取阳性孔中团簇生长的细胞，移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，icelisa检测，同样以效价和抑制率做为行量指标，取呈阳性强者利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3～4轮(注意每轮挑出的阳性孔细胞需扩大培养，后冻存备用)，直至每板每个孔都为阳性且经检测效价和抑制相近，至此杂交瘤细胞系建立成功，得到能稳定分泌均一抗体的杂交瘤细胞系。挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或细胞培养皿中扩大培养，及时冻存。

实施例3细交链孢菌酮酸单克隆抗体的大量制备

1、抗体分泌表达

在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆后，通常以体外培养法和动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单克隆抗体。常规的做法是：提前在十多只8周龄以上的balb/c小鼠的腹腔内注射液体石碏，剂量为0.5ml/只，1～2两周后在小鼠的腹腔注射杂交瘤细胞。接种细胞后每天观察小鼠状态，特别是从第七天开始，小鼠的精神会出现萎靡，腹腔会胀大，这时更要密切关注小鼠的状态，在小鼠死亡前用一次性注射器无菌采取腹水，将采集的腹水12000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白，收集中间层，用icelisa法测定其效价和抑制率，在-20℃保存备用。

2、抗体纯化

本发明利用的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体方法如下：

(1)取腹水4℃12000r/min离心15min，去除杂质。

(2)取腹水：醋酸盐缓冲溶液按体积比1:2混合，室温搅拌下加入正辛酸。每毫升腹水加入33μl正辛酸，调整ph到4.8。

(3)室温搅拌混合30min，4℃静置2h，使其充分沉淀。

(4)4℃、12000r/min离心15min，弃沉淀。

(5)上清经砂芯漏斗或125μm的尼龙网过滤后，加入1/10体积的0.1mol/lph7.4的pbs，用2mol/lnaoh调ph值至7.4。

(6)冰浴下于30min内加入0.277g/ml的硫酸铵，使其饱和度为45％。

(7)4℃静置1h以上，然后4℃、10000r/min离心30min，弃上清。

(8)沉淀用适量ph7.4的pbs溶解，于5lpbs(0.0lmol/l，ph7.4)中4℃透析3天，每天换3次液；透析完毕后分装，后置-20℃保存备用。

实施例4间接竞争酶联免疫测定细交链孢菌酮酸方法的建立

1、间接竞争酶联免疫(icelisa)反应具体包括以下步骤：

s1.包被：用包被液将包被原稀释至合适浓度，加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃水浴箱中过夜。

s2.洗涤：倾去孔内液体，洗板2次，每孔加洗涤液300μl，甩干。

s3.封闭：每孔加入120μl封闭液，37℃封闭3h，甩干，倒置于37℃烘箱中1h备用。

s4.加样及孵育：每孔加入50μl稀释一定倍数的抗体和50μl药物稀释液；震荡混匀，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μl，甩干。

s5.加入二抗：每孔加入100μl稀释5000倍的hrp-羊抗鼠-羊抗兔igg，37℃水浴箱中反应40min，后洗板5次，甩干。

s6.显色：每孔加入显色液100μl，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μl终止液(10％h2so4)。

s7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔a450nm的吸光值。

s8.计算：用origin8.6的四参数拟合模块计算抑制曲线的ic50值。

2、配制0.00098μg/l、0.00391μg/l、0.01563μg/l、0.0625μg/l、0.25μg/l、1μg/l、4μg/l的细交链孢菌酮酸标准品溶液，建立间接酶联免疫检测方法的标准曲线。

方法检出限为(ic10)为1.00ng/ml，ic50＝18.50ng/ml，线性检测范围为3.56～96.24ng/ml。

实施例5抗体交叉反应率的测定与加样回收率的测定

1、按实施例4中所得最佳包被抗原浓度和最佳抗血清稀释倍数，以tea、ame、aoh、itea、don、afb1、oa、ob、t-2、zea结构类似物为竞争抗原，进行间接竞争elisa实验，检测细交链孢菌酮酸单克隆抗体的特异性，其半数抑制浓度(ic50)和交叉反应率(cr)数值在表2中列出。

表2细交链孢菌酮酸icelisa的抗体特异性(n＝3)

实验结果表明，抗tea的抗体与其余9种链格孢霉毒素结构类似物均无交叉反应(应ic50均大于1000ng/ml，交叉反应率均小于0.1％)，说明该单克隆抗体在实际应用中对tea的特异性较好，该icelisa检测方法特异性好。

2、加样回收率测定：

加标苹果汁、葡萄汁、啤酒汁样品回收后进行icelisa测定。结果见表3。

表3细交链格孢菌酮酸icelisa样品添加回收实验(n＝3)

实验结果表明，三种样品的添加回收率在85.5％～119.7％之间，cv<15％，方法准确度好，说明该单克隆抗体与icelisa检测方法可适用于实际样品中tea的检测。