一种基于MSPD法检测动物肌肉中六溴环十二烷手性异构体的方法与流程

本发明涉及一种基于MSPD法检测动物肌肉中六溴环十二烷手性异构体的方法。

背景技术：

六溴环十二烷(Hexabromocylcododecane，HBCD)是一种添加型溴系阻燃剂，常温常压下为白色固体，分子式为C₁₂H₁₈Br₆，相对分子质量641.70，溶点175-195℃，辛醇-水分配系数5.62(25℃)，在水中溶解度较小(20℃)为65.6ng/L，在乙腈、二氯甲烷等有机溶剂中溶解度较大。由于其溴含量较高(达74.7％)，作为一种优良的阻燃剂被广泛应用在聚苯乙烯泡沫、室内装潢纺织品和电子产品等领域，是挤塑保温板的专用阻燃剂。

有科学研究表明，HBCD在环境中呈现出持久性污染物的毒性、生物富集及难降解等特征，2009年已被列入斯德哥尔摩公约的候选名单。HBCD脂溶性的特点使其易于在动物体组织中蓄积，其在可食用的动物肌肉、脂肪组织中的积累现象已有报道，但目前没有统一适用的标准检测方法。因此，开发研究动物肌肉中HBCD的检测方法对于保障食品安全、保护老百姓的身心健康及社会稳定具有重要的意义。

HBCD商品主要由三种立体异构体(α-，β-和γ-HBCD)组成，且均为外消旋化合物，都具有手性异构体(即对映异构体)。立体异构体及其手性异构体结构如下：

HBCD的高沸点及气相色谱柱无法分离异构体等技术劣势导致气相色谱法不适用于HBCD的检测。已有文献报道，利用手性液相色谱柱或在流通相中加入环糊精等手性溶剂，利用高效液相色谱(HPLC)可以完成对映异构体的分离，但该法样品前处理复杂灵敏度较差，限制了其在动物肌肉中HBCD检测的应用。此外，已有的相关研究大部分仅针对HBCD的立体异构体，即α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD，实际上，每种立体异构体均可拆分为(+)与(-)两种手性异构体，且生物体内的吸收、代谢过程是有手性选择性的，但关于手性拆分分析方法的研究报道较少，因此，开发建立HBCD手性化合物的新检测方法有着重要的意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于基质固相分散(MSPD)法检测动物肌肉中六溴环十二烷手性异构体的方法。该方法能够简单、快速、准确的对动物肌肉中的HBCD异构体进行检测。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种通过响应面法优化MSPD提取动物肌肉中HBCD的方法，包括如下步骤：

(1)以MSPD法提取动物肌肉中HBCD所采用的分散剂和洗脱剂作为试验因素，进行单因素试验；

(2)根据单因素试验结果，选取反相材料C18、分散剂弗罗里硅土(Florisil)和洗脱剂乙腈(ACN)这三个因素，对因素水平进行设定，采用Box-Behnken Design进行建模，通过方差分析(ANOVA)验证模型的适用性与合理性，得到多元回归方程Y＝-2.24×10⁶+2.90×10⁵A+1.06×10⁶B+1.90×10⁶C+2.24×10⁵AB-7.33×10⁵AC+1.50×10⁵BC-2.66×10⁵A²-1.54×10⁵B²-8.75×10⁵C²；其中，Y：峰面积；A:C18质量；B：ACN体积；C:Florisil质量，确定模型预测的最优条件。

本发明的第二方面，提供一种动物肌肉中HBCD的提取方法，步骤如下：

将待提取的动物肌肉样品冷冻干燥，将干燥后的动物肌肉样品和Florisil按质量比为1：(1.5-3)混合，并研磨至混合均匀；然后转移至底层装有C18的聚乙烯柱中，采用乙腈进行洗脱，收集洗脱液；用高纯氮气将洗脱液吹至近干，即得。

优选的，干燥后的动物肌肉样品和Florisil按质量比为1：2混合。

优选的，干燥后的动物肌肉样品与C18加入的质量比为1：(2-3)；进一步优选为1：2.4。

优选的，干燥后的动物肌肉样品与乙腈使用量的比为：1g:(8-12)ml；进一步优选为：1g:10ml。

本发明的第三方面，提供一种动物肌肉中HBCD手性异构体的检测方法，步骤如下：

(1)按上述提取方法提取HBCD，用乙腈进行溶解，制备得到样品溶液；

(2)采用LC-MS/MS对样品溶液进行检测。

步骤(2)中，液相色谱条件为：色谱柱EC 200/4NUCLEODEXβ-PM柱，柱温为40℃，流动相：体积比80/20的乙腈/水溶液，流速：0.5mL/min。

步骤(2)中，MS/MS条件：大气压电喷雾电离源(ESI)，负离子模式采集，毛细管电压4Kv，干燥气流量为3.0L/min温度为280℃，雾化压力40psi，碰撞气体采用高纯度氮气(99.999％)、毛细管电压4Kv，碰撞电压90V。

本发明的有益效果：

(1)基质固相分散(MSPD)是一种非常有效的萃取净化技术，特别是在复杂基质如动物或植物组织中。该方法大大简化和缩短了提取过程，极大的降低了溶剂消耗并具有非常好的回收率，具有简单、廉价、样品范围广、萃取易于操作、回收率稳定等特点，因而得到广泛应用，并被许多国家作为标准方法。在MSPD中，萃取净化用分散吸附剂的种类及配比、洗脱溶剂种类及用量是得到最佳效果的关键。本发明通过单因素试验和响应面法对分散吸附剂和洗脱溶剂的种类、复合分散吸附剂的配比、洗脱溶剂的用量进行优化。建立的响应面法模型步骤简单，容易实现，根据精确数学模型的条件优化有利于提高生产效率和产品品质、降低运行成本、符合绿色化学要求。

(2)采用本发明优化后的提取条件对动物肌肉样品中的HBCD进行提取，其提取率达80.7～98.2％。

(3)本发明对HBCD的手性异构体进行了检测，检测过程简单，全部实验过程仅需15分钟，消耗溶剂少；而且检测方法的准确性好，本发明检测方法的线性范围0.5-100ng/g，相关系数大于0.98，LOD为0.056～0.18ng/g，LOQs为0.187～0.602ng/g，相对回收率为84.0％～117.3％，精密度RSD为4.6％～12.5％，完全满足国家标准《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T 27404-2008)的要求。该方法前处理简单快速，检测灵敏度高，结果准确可靠，环境友好，是一个具有实用价值的方法，对于保障食品安全、保护老百姓的身心健康及社会稳定具有重要的实际意义及社会效益。

附图说明

图1：单因素实验优化分散剂种类；

图2：单因素优化实验洗脱液种类；

图3a-图3c：HBCD峰面积响应面图，其中，图3a为C18用量和ACN交互的结果，图3b为Florisil用量和ACN体积交互的结果；3c为Florisil用量和C18用量交互的结果；

图4：实施例4中Sample2#样品色谱图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所用的试剂、材料与仪器如下：

六溴环十二烷三种异构体单体标准品(纯度均大于99％，100μg/mL)购自AccuStandards公司(New Haven,USA)。稳定碳同位素标记的六溴环十二烷三种异构体单体(¹³C-α-，¹³C-β-，¹³C-γ-HBCD，纯度大于98％)购自Cambridge Isotope实验室(Andover,MA,USA)，以上所有标样均用色谱纯甲醇稀释到2μg/mL放在-20℃冰箱中保存。甲醇、乙腈(ACN)和丙酮(色谱级)购自Tedia公司。N-丙基乙二胺(PSA，40-60μm)、C18(50μm)和弗罗里硅土(Florisil，60-100目)均购自Agela公司(天津)。中性氧化铝(Al2O3,100-200目)和无水硫酸镁(MgSO₄)购自Sinopharm Chemical Reagent公司(上海)。

安捷伦1200型液相色谱配6410型三重四级杆串联质谱仪(Palo Alto,California,USA)。

未进行说明的均为本领域的常规市售产品。

实施例1：响应面法优化MSPD提取动物肌肉中HBCD

1.样品制备：

选取空白样品(鸡肉)进行条件优化，样品购自济南一家超市的家禽供应商，现场宰杀以保证鸡肉样品新鲜。将鸡肉用绞肉机绞碎以保证均一性，并冷冻干燥去除水分。用索氏提取法测得鸡肉中脂肪含量为13.6％(干重比，做三组平行试验)。空白实验的结果表明，在鸡肉样品中没有检测到HBCD。通过加入用甲醇配制的HBCD标准储备液制备加标样品(浓度为10ng/g)，在通风条件下使甲醇自然挥发直至样品恢复干燥，将制备好的加标样品保持在冰箱中-20℃保存。

2.MSPD实验步骤：

1)装柱：将鸡肉样和分散剂放于玻璃研钵中用研杵研磨2分钟至混合均匀，转移至已在底层装有C18(用适量的甲醇活化后用氮气吹干)的聚乙烯小柱中。再用一个软棒压实填充物以防小柱中出现空隙。

2)洗脱：用洗脱剂对小柱进行淋洗，收集洗脱液于离心管中，并在45℃下用高纯氮气吹至近干，最后，用100μlACN复溶残留物，取10μl进行仪器分析。

3.单因素试验：

MSPD实验性能很大程度上取决于对目标物的提取效率和对杂质的净化效果。提取效率主要依赖于选取适当的萃取溶剂，净化效果主要受分散剂的影响。根据肌肉组织的特性，通常选用反相材料C18来去除多余的脂肪。对于分散剂与洗脱剂，本实施例利用单因素试验进行了比较选择。

(1)分散剂的考察

根据HBCD脂溶性高的特点、相关文献及“相似相溶”原理，试验中选取三种分散剂进行了比较，包括Forisil、PSA和Al₂O₃(使用量均为1g)，对HBCD的峰面积结果进行比较(见图1)。从中可以看出Forisil比其它两种分散剂得到更高的峰面积，回收率最高。因此，在接下来的试验中选用Forisil作为分散剂。

(2)洗脱剂的考察

根据文献报道，生物样品中HBCD提取溶剂常用正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。对于动物组织中极性化合物的分析，在洗脱目标物之前先用诸如正己烷等非极性溶剂去除脂肪，而HBCD易溶解于正己烷，故在MSPD中不能使用正己烷洗脱。因此，最终选用甲醇(MA)，乙腈(ACN)，乙酸乙酯和二氯甲烷(DCM)作为洗脱溶剂进行对比。实验结果发现乙酸乙酯和二氯甲烷洗脱后溶有很多脂肪残留，不可用于仪器分析，用ACN和MA洗脱后溶液较为清澈，HBCD的峰面积结果见图2。虽然(+)β-HBCD在使用MA时获得了较高的回收率，但是其它异构体的回收率较低，特别是(+)α-HBCD异构体，MA回收率仅为ACN的20％。综合考虑，ACN为洗脱实验的最佳选择。

4.响应面法优化

利用Box–Behnken设计对C18、Florisil和乙腈的使用量进行优化与研究，该方法通过正交设计的响应面(RSM)可以较为简便的实现参数的优化，RSM再通过方差分析(ANOVA)进行验证，通常基于Design-Expert software(version 8.0)软件来完成。优化级别和实验设计见表1。根据ANOVA结果(见表2)，在回归曲线置信区间95％内，多元回归模型是显著的，回归系数为0.965，表明96.5％的变量适用于本模型，失拟分析非显著也说明模型对于优化实验参数具有适用合理性。图3(a-c)为HBCD峰面积响应面图，依次分别为C18用量、Florisil用量和ACN体积三者两两交互的结果。从中可以看出，萃取效率随着ACN体积的增加而增加，随着Florisil的用量增加而增加，最终在5mLACN和1gFlorisil的条件下得出最高峰值。随后，回收率降低。同理在另外两张响应面图中，1.2gC18获得了更高的效率。综合以上结果，MSPD的最佳条件为：5mLACN、1gFlorisil和1.2gC18。

表1 正交实验响应面优化设计矩阵

表2 方差分析(ANOVA)结果汇总表

实施例2：自制动物肌肉标准样品中HBCD的提取

1.试验样品：

以不含HBCD的鸡肉作为空白样品，加入用甲醇配制的HBCD标准储备液制备成加标样品(浓度为10ng/g)，在通风条件下使甲醇自然挥发直至样品恢复干燥。

2.按照实施例1优选的提取条件对加标样品中的HBCD进行提取，具体提取方法如下：

1)装柱：将0.5g加标鸡肉样和1g弗罗里硅土(Florisil)放于玻璃研钵中用研杵研磨2分钟至混合均匀，转移至已在底层装有1.2gC18(用适量的甲醇活化后用氮气吹干)的10ml聚乙烯小柱中。再用一个软棒压实填充物以防小柱中出现空隙。

2)洗脱：用5mlACN对小柱进行淋洗，收集洗脱液于离心管中，并在45℃下用高纯氮气吹至近干，最后，用100μlACN复溶残留物，取10μl进行仪器分析。

经检测，采用本发明优化后的提取条件对动物肌肉样品中的HBCD进行提取，6种HBCD异构体的平均提取率为87.4％。

将加标鸡肉样品和Florisil加入的质量比在1：(1.5-3)范围内进行调整，将加标鸡肉样品与乙腈使用量在1g:(8-12)ml范围内进行调整，经检测，多个加标样品的提取率范围为80.7～97.5％。

对比例1：自制动物肌肉标准样品中HBCD的提取

试验样品的制备方法同实施例2；

对试验样品中的HBCD进行提取，提取方法如下：

1)装柱：将0.5g加标鸡肉样粉碎，转移至已在底层装有1.2gC18(用适量的甲醇活化后用氮气吹干)的10ml聚乙烯小柱中。再用一个软棒压实填充物以防小柱中出现空隙。

2)洗脱：用5ml正己烷-二氯甲烷(1：1，V/V)对小柱进行淋洗，收集洗脱液于离心管中，并在45℃下用高纯氮气吹至近干，最后，用100μlACN复溶残留物，取10μl进行仪器分析。

经检测，采用本发明优化后的提取条件对动物肌肉样品中的HBCD进行提取，其提取率为42.5％。

对比例2：自制动物肌肉标准样品中HBCD的提取

试验样品的制备方法同实施例2；

对试验样品中的HBCD进行提取，提取方法如下：

1)装柱：将0.5g加标鸡肉样和2g弗罗里硅土(Florisil)放于玻璃研钵中用研杵研磨2分钟至混合均匀，转移至已在底层装有0.5gC18(用适量的甲醇活化后用氮气吹干)的10ml聚乙烯小柱中。再用一个软棒压实填充物以防小柱中出现空隙。

2)洗脱：用10mlACN对小柱进行淋洗，收集洗脱液于离心管中，并在45℃下用高纯氮气吹至近干，最后，用100μlACN复溶残留物，取10μl进行仪器分析。

经检测，采用本发明优化后的提取条件对动物肌肉样品中的HBCD进行提取，其提取率为69.4％。

对比例3：自制动物肌肉标准样品中HBCD的提取

试验样品的制备方法同实施例2；

对试验样品中的HBCD进行提取，提取方法如下：

1)装柱：将0.5g加标鸡肉样和0.5g弗罗里硅土(Florisil)放于玻璃研钵中用研杵研磨2分钟至混合均匀，转移至已在底层装有1.5gC18(用适量的甲醇活化后用氮气吹干)的10ml聚乙烯小柱中。再用一个软棒压实填充物以防小柱中出现空隙。

2)洗脱：用2mlACN对小柱进行淋洗，收集洗脱液于离心管中，并在45℃下用高纯氮气吹至近干，最后，用100μlACN复溶残留物，取10μl进行仪器分析。

经检测，采用本发明优化后的提取条件对动物肌肉样品中的HBCD进行提取，其提取率为70.5％。

实施例3：动物肌肉样品中HBCD的检测方法的方法学验证

采用LC-MS/MS法对动物肌肉样品中的HBCD进行检测，检测条件如下：

液相色谱条件：色谱柱：EC 200/4NUCLEODEXβ-PM柱(200mm×4.6mm，5μm)，柱温度为40℃。流动相：乙腈/水溶液(80/20，V/V)；流速：0.5mL/min；进样体积：10μL。

MS/MS条件：大气压电喷雾电离源(ESI)，负离子模式采集，毛细管电压4Kv，干燥气流量为3.0L/min温度为280℃，雾化压力40psi，碰撞气体采用高纯度氮气(99.999％)、毛细管电压4Kv，碰撞电压90V。HBCD异构体和其同位素标记的内标化合物母离子和子离子分别为640.7→(80.9,78.9)和652.8→(80.9,78.9)。

在上述最佳条件下，对检测方法的线性、加标回收率、检出限、定量限及精密度等方法学指标进行的试验研究，并按国家标准《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T27404-2008)进行了评价，最终结果见表3。线性范围0.5-100ng/g内的相关系数在0.996到0.999之间，线性良好，满足国标中“校准曲线相关系数不低于0.98”的要求。以3倍信噪比计算，最低检出限(LOD)在0.056～0.18ng/g之间，以10倍信噪比计算，得出定量限(LOQs)在0.187～0.602ng/g之间。八组平行试验计算得出三个水平(5，20和100ng/g)的加标回收率和精密度，结果表明目标物的平均回收率在84.0％～117.3％之间，相对标准偏差(RSD)值为4.6％～12.5％之间，完全满足国标中“回收率60～120％，变异系数小于15％”的要求。

表3 MSPD-LC-MS/MS方法检测HBCD方法学参数(ng/g)

需要说明的是：现有的对HBCD立体异构体的分析检测，并未涉及对手性HBCD进行分析，其报道的分析方法的检测限和定量限可能比较低。但是，本发明的检测方法同时对HBCD三种异构体的手性异构体进行检测，检测的难度显著高于单纯进行HBCD立体异构体的检测，这两种检测方法的方法学参数不具有可比性。而采用本发明的检测方法所达到的定量限、精密度和加标回收率结果已明显优于国标要求，取得了意想不到的效果。

实施例4：实际样品的检测

为了验证本发明的检测方法的有效性，选取从溴代阻燃剂主要生产地-山东省广饶市购买的两只公鸡(Sample1#～2#)、两份猪肉(Sample3#～4#)为实验对象进行检测，结果见表4(以干重计)，Sample2#样品色谱图见图4。在鸡肉Sample1#和Sample2#样中均检出(±)α-HBCD和(±)γ-HBCD，没有发现(±)β-HBCD，而两份猪肉中均未检出HBCD，说明在HBCD生产区已有动物源农产品受到了污染威胁。

表4 六溴环十二烷异构体及其对映体在实际鸡肉样品中的分析结果(干重，ng/g)

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。