一种川芎饮片全时段多波长叠加指纹图谱的构建及应用的制作方法

本发明属于一种中药材和中成药的质量检测技术领域，具体是一种川芎饮片全时段多波长叠加指纹图谱的构建及应用。

背景技术：

中药川芎为伞形科(Umbelliferae)藁本属(Ligusticum)多年生草本植物川芎(Ligusticum chuanxiongHort.)的根茎，主产于四川省，云南、贵州、甘肃等省也有栽培。川芎具有活血行气、祛风止痛等功效，常用于胸痹心痛、胸胁刺痛、月经不调等的治疗。现代化学和药理研究表明，川芎的化学成分主要包括挥发油、酚酸类、生物碱类和内酯类等。

由于中药指纹图谱具有完整性、特异性和再现性的特点，已在中药材质量控制和模式识别研究中得到了广泛应用，并且世界卫生组织和中国国家食品药品监督管理局也推荐使用色谱指纹图谱作为中药质量控制与评价的手段。但是由于中药材化学成分复杂多样，当前常用的单波长检测下的指纹图谱很难反映全部成分信息。

波长叠加法是波谱学和光谱学定量分析中常用的方法，在钯、乙醇和槲皮素等含量的测定中表现良好。据此我们提出了多波长叠加指纹图谱的新方法，并在川芎饮片中得到了良好的效果，该方法可为川芎饮片的质量控制和评价提供科学依据。

技术实现要素：

根据以上技术问题，本发明提供一种川芎饮片全时段多波长叠加指纹图谱的构建及应用，其特征在于包括以下顺序进行的步骤：

(1)进行供试液制备

精确称量0.5g川芎饮片粉末，加入10mL的70％甲醇水溶液，300W水浴超声30min，然后将其摇匀，摇匀后静置，静置30-60min，摇匀，静置30-60min，上清液过0.2μm滤膜至进样瓶；

(2)色谱条件

仪器：LC-20A高效液相色谱仪，配备DGU-20A3在线脱气机、SPD-20A紫外检测器、LC-20AB高压输液泵、CTO-10AS柱温箱和SIL-20A自动进样器(Shimadzu Corporation，Japan)；

色谱柱：安捷伦Poroshell 120 EC-C18(4.6mm×100mm，2.7μm)接安捷伦Eclipse XDB-C18保护柱(4.6mm×12.5mm，5μm)；检测波长为230、260、290、320nm，总流速为0.8mL/min，柱温35℃；流动相：A为0.1％磷酸的水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～20min，10～32％的B；20～25min，32～46％的B；25～36min，46～55％的B；36～60min，55～80％的B；60～63min，80～10％的B；63～70min，10％的B；

(3)全时段多波长叠加指纹图谱的建立

选定多波长叠加的检测波长为230、260、290、320nm；分别从Shimadzu Labsolution色谱工作站中导出不同检测波长下的AIA格式数据文件；使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件转换为TXT格式；然后利用EXCEL2013对TXT格式数据中的检测信号值进行全时段多波长叠加，指纹图谱采用平均数法并另存为TXT格式；最后将TXT格式文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软作图；以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为变量，利用SPSS23.0进行数据处理，斯皮尔曼相关系数表示样品与指纹图谱的相似度；

(4)主成分分析和聚类分析

以样品多波长叠加图谱全时段的检测信号值为原始数据，用SPSS23.0进行主成分分析；以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为原始数据，导入SPSS23.0软件进行聚类分析，采用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析。

本发明的有益效果为：本发明为一种川芎饮片全时段多波长叠加指纹图谱的构建及应用的方法，该方法结合了现代测试分析技术和信息处理方法，为传统大宗中药材川芎的质量控制提供一种全面、稳定、可靠的评估方法。

波长叠加法是定量分析中常用的方法，在钯、乙醇和槲皮素等含量的测定中表现良好。据此本发明首次提出了多波长叠加指纹图谱的新方法，并在川芎饮片中得到了良好的效果，该方法可为川芎饮片的质量控制和评价提供科学依据。本发明核心技术为多波长叠加技术的应用，具体为：选定多波长叠加的检测波长为230、260、290、320nm。分别从Shimadzu Labsolution色谱工作站中导出不同检测波长下的AIA格式数据文件；使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件转换为TXT格式；然后利用EXCEL2013对TXT格式数据中的检测信号值进行全时段多波长叠加，指纹图谱采用平均数法并另存为TXT格式；最后将TXT格式文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软作图。以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为变量，利用SPSS23.0进行数据处理，斯皮尔曼相关系数表示样品与指纹图谱的相似度。

附图说明

图1是不同波长检测下的样品色谱图；

图2是多波长叠加指纹图谱；(C：川芎饮片，G：藁本饮片，D：当归饮片)

图3是主成分分析得分图；

图4是聚类分析图(C：川芎饮片，G：藁本饮片，D：当归饮片)。

具体实施方式

根据实施例所示，对本发明进行进一步说明：

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述川芎饮片全时段多波长叠加指纹图谱的构建及应用方法，以下实例包括了该方法的精密度、稳定性、重复性试验。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

1.样品来源和试剂

16个川芎饮片购自国内各大药店。为验证指纹图谱可靠性和专一性，同时随机采购2个来源的藁本饮片和2个来源的当归饮片作为外类群。所有样品分析前40℃烘干至恒重，粉碎过50目筛，保存于-20℃的冰箱中。乙腈(色谱纯，Fisher Scientific，USA)；磷酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；超纯水(Millipore，USA)自制。

2.供试液的制备

精确称量0.5g川芎饮片粉末，加入10mL的70％甲醇水溶液，300W水浴超声30min，摇匀，静置，上清液过0.2μm滤膜至进样瓶。

3.色谱条件

仪器：LC-20A高效液相色谱仪，配备DGU-20A3在线脱气机、SPD-20A紫外检测器、LC-20AB高压输液泵、CTO-10AS柱温箱和SIL-20A自动进样器(Shimadzu Corporation，Japan)。

色谱柱：安捷伦Poroshell 120 EC-C18(4.6mm×100mm，2.7μm)接安捷伦Eclipse XDB-C18保护柱(4.6mm×12.5mm，5μm)。检测波长为230、260、290、320nm，总流速为0.8mL/min，柱温35℃。流动相：A为0.1％磷酸的水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～20min，10～32％的B；20～25min，32～46％的B；25～36min，46～55％的B；36～60min，55～80％的B；60～63min，80～10％的B；63～70min，10％的B。

4.方法学考察

精密度：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录主要色谱峰的峰面积积分值，结果峰面积的RSD为0.85-2.53％，符合指纹图谱技术要求。

稳定性：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，分别于制样后0、2、4、6、8、12h进样测定，记录主要色谱峰的峰面积积分值，结果峰面积的RSD为0.36-1.84％，说明供试品溶液在12h内稳定，符合指纹图谱技术要求。

重复性：取样品C1共6份，按上述方法制备供试液并上机检测，记录主要色谱峰的峰面积积分值，结果峰面积的RSD为0.74-2.84％，符合指纹图谱技术要求。

5.全时段多波长叠加指纹图谱的建立

选定多波长叠加的检测波长为230、260、290、320nm。分别从Shimadzu Labsolution色谱工作站中导出不同检测波长下的AIA格式数据文件；使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件转换为TXT格式；然后利用EXCEL2013对TXT格式数据中的检测信号值进行全时段多波长叠加，指纹图谱采用平均数法并另存为TXT格式；最后将TXT格式文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软作图。以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为变量，利用SPSS23.0进行数据处理，斯皮尔曼相关系数表示样品与指纹图谱的相似度。

根据上述方法将不同检测波长下的色谱图进行叠加，所得的样品叠加图谱的峰数量和峰面积都有所增加，能更加全面的反应川芎饮片化学成分。利用16个不同来源的川芎饮片叠加图谱建立指纹图谱，样品图谱与指纹图谱的相似度在0.940～0.995之间，表明指纹图谱建立成功。此外，川芎饮片多波长叠加指纹图谱与川芎同属中药材藁本和近缘种中药材当归的相似度较低在0.235～0.725之间，表明该指纹图谱具有一定的鉴定识别作用，可作为川芎饮片辨别伪品的手段。

6.主成分分析和聚类分析

以样品多波长叠加图谱全时段的检测信号值为原始数据，用SPSS23.0进行主成分分析。结果表明前2个主成分特征值都大于1，累积方差贡献率达到93.134％，表明前2个主成分可以把20个样品的化学特征的93.134％反映出来。样品主成分分析得分图结果表明样品明显集中在2个区域内，其中一个全部为川芎饮片样品，另一个为藁本和当归样品。也表明叠加图谱能反映川芎饮片真实的化学特征，对鉴定识别也具有一定作用。

以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为原始数据，导入SPSS23.0软件进行聚类分析。采用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析。该部分结果与主成分分析结果有一致性，聚类树分成了两个主支，其中一支全部为川芎饮片样品和拟合的指纹图谱(R)，另一支为藁本和当归样品。在对川芎饮片一支分析可发现，不同的次级分支在药材来源上无一致性，表明市除四川作为川芎主产区外虽有湖北、贵州、安徽、重庆等省的小产区但市售川芎饮片与川芎产地关系不一致，也表明川芎饮片的市场和商品流通都是复杂多样的。

本发明利用全时段多波长叠加法得到的指纹图谱不仅可以用于川芎饮片的指纹定性分析，还可以用于其它中药材、中成药等的指纹定性分析。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。