轮状病毒抗原ELISA定量检测方法与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其病毒抗原定量检测方法。

背景技术：

人轮状病毒（Human Rotavirus, HRV）自上世纪70年代发现以来，至今仍是造成婴幼儿腹泻最主要的病原体。每年全球感染轮状病毒的人数约为1.1亿，其中近200万患者需要住院治疗，病死人数约60万，还包括2400万门诊病例。自上世纪80年代初，科学家即开始着手研制抗轮状病毒感染的疫苗，疫苗研制的种类主要是减毒活疫苗，重组减毒活疫苗，灭活疫苗及基因工程组分疫苗等。

轮状病毒是一种基因组为双链分节段的RNA病毒，属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，呈球形，大小约70nm，有三层病毒衣壳蛋白包裹着11条基因片段组成的基因组。基因组约为18,500 bp，11个基因片段分别编码6个结构蛋白（VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7），和6个非结构蛋白（NSP1,NSP2, NSP3,NSP4, NSP5/6）^[6]。轮状病毒感染也是中国儿童秋冬季门诊和住院的主要病因。据监测资料显示，门诊腹泻患儿轮状病毒检出率为15~35%，住院患儿轮状病毒检出率为16~60%。本课题组对一些地区连续5年住院患儿轮状病毒检测发现，平均检出率为40%，相对寒冷地区检出率为45%，亚热带地区的轮状病毒检出率也在20~30%。人轮状病毒的血清型G型及P型随时间的推移，其造成流行的型别也会有所变化。世界上最常见的轮状病毒感染型主要是G1、G2、G3和G4型轮状病毒，P型主要为P[8]型占大多数，曾经G1为主要流行型，2006年后G3型成为主要流行株，近年检测发现G9型增多[11]，也许是未来一段时间优势流行毒株。P[8]型为流行的主要毒株约为74%，其次为P[4]型7.6%，P[9]型0.5%[8]。

目前还没有轮状病毒灭活疫苗上市，美国CDC的Baoming Jiang博士团队[12]用源于人分离到的毒株CDC-9(G1P[8])和CDC-66（G2P[4]）开展了灭活疫苗的实验室研究。其结果表明，经灭活后的疫苗具备良好的免疫原性，在无菌猪中做了攻击保护试验，其结果表明，接种疫苗后的实验动物获得有效保护[12-14]。另外，中国医学科学院医学生物学研究所自2006年“863”项目自启动即开始研究轮状病毒灭活疫苗并对中试到规模化制备的各个环节做了系统的研究。本研究利用具有自主知识产权毒株，经纯化和制备免疫抗血清，并以此

技术实现要素：

本发明的目的是建立轮状病毒G1P[8]型抗原定量ELISA方法，为轮状病毒灭活疫苗提供质控方法。

本发明公开了一种轮状病毒抗原ELISA定量检测方法，其特征在于采用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释山羊抗轮状病毒多克隆抗体至终浓度2.0 ug/ml包被抗原板，100ul/孔，4^oC过夜；洗板3次，拍干，加入含3% BSA的PBST封闭液，200ul/孔，37^oC孵育2h；洗板3次，拍干，加入稀释的轮状病毒样品，100ul/孔，37^oC孵育1h；洗板3次，拍干，加入酶标记兔抗轮状病毒G1P[8]型多抗，1：2000稀释，100ul/孔，37^oC孵育1h；洗板3次，拍干，TMB显色5min, 2 mol/L H₂SO₄终止反应，读取A₄₅₀吸光度值，计算轮状病毒抗原含量。

在轮状病毒结构与非结构蛋白中，第六基因片段编码的VP6为轮状病毒共有的组蛋白抗原，组抗原特异性抗体可识别不同组（群）轮状病毒，以往研究认为VP6不诱导机体产生保护性抗体，第4基因片段编码的VP4和第9基因片段编码的VP7是轮状病毒主要的诱导机体产生中和抗体的成分。到目前为止，根据VP6蛋白的抗原性差异可将轮状病毒分为A~G7个组（群），其中A、B、C三个组轮状病毒可引起人类感染致病。A组轮状病毒是婴幼儿感染和致病的主要病原体，B组轮状病毒曾在成人中引起爆发式流行，C组轮状病毒感染致病较为少见。在A组轮状病毒中依据VP7（糖蛋白，37kDa）和VP4（蛋白水解酶敏感蛋白，86~88kDa）的差异，目前已知的人轮状病毒被分为19种G型和28种P型。

轮状病毒灭活疫苗作为一个尚无参照标准的新疫苗，如何确定其有效免疫剂量是疫苗质量控制中的重要研究内容。在这一工作中，我们研究工作从两个方面探索了该疫苗如何作为有效制品的抗原定量问题和这种定量与其刻意诱导集体产生有效免疫反应的相关关系。对此，我们参照了SFDA《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》（国食药监注[2005]493号）、《中国药典》三部（2010版）、《中国药典》三部（2015版）的相关要求和“甲型肝炎灭活疫苗”、“脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin株）”、“肠道病毒71型灭活疫苗”的研究经验，初步确定了轮状病毒灭活疫苗原液、成品及病毒抗原含量的检定方法，并建立了抗原含量检测参比品。

针对ELISA定量检测方法，核心部分为抗原检测内参品，及酶标记抗体。本技术方案均对内参品和酶标记抗体做了鉴定和定量分析，研究了其稳定性、特异性属性。本研究建立了G1P[8]型轮状病毒抗原ELISA定量检测方法，测试并通过了该方法的精密性、稳定性、特异性试验，其性能良好，能够为基于G1P[8]型轮状病毒灭活疫苗提供质控方法。

说明书附图

图1兔抗轮状病毒G1P[8]型多抗Western Blotting验证；

图2轮状病毒G1P[8]型病毒内部参考品透射电镜显微形态；

图3稳定性验证；

图4特异性验证。

具体实施方式

实施例1、

材料：轮状病毒ZTR-68株（G1P[8]型），轮状病毒Wa株（G1P[8]型），轮状病毒SA-11株（G3P[2]型），轮状病毒Gottfried株（G6P[4]型）；Vero细胞、Sabin IPV I型脊髓灰质炎病毒、EV71型病毒均由中国医学科学院医学生物学研究所制备并保存，专利涉及毒种轮状病毒ZTR-68株保藏自中国微生物菌种保藏管理委员会（保藏号：CGMCC5265）。山羊抗轮状病毒抗体（AB1129），PROSEP-G抗体纯化试剂盒（LSK2ABG20）购自Millipore公司。上述材料要公开来源，写明保藏单位和标号，或者购买渠道。

具体步骤如下：

步骤1、轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品制备：采用浓缩层析纯化制备病毒内部参考品，并对制备的参考品进行HPLC纯度和透射电镜分析；

步骤2、抗轮状病毒G1P[8]型多抗制备和纯化：采用轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品作为免疫原，与1:1弗氏完全佐剂混合，皮下多点注射免疫大白兔和豚鼠，500 ug/只。初免后2、4周采用相同剂量与1:1弗氏非完全佐剂混合，皮下多点注射免疫，2周后分别采血，分离血清，采用PROSEP-G (ProteinG)亲和层析纯化试剂盒，分离纯化抗轮状病毒G1P[8]多抗；

步骤3、抗体效价、纯度、特异性：采用ELISA法鉴定抗体效价，用纯化的轮状病毒抗原包被ELISA板，包被浓度0.2 ug/孔，加入2倍梯度稀释后的纯化抗体，100ul/孔，37^oC结合1h；加入HRP标记的山羊抗兔（1:2000稀释）和HRP标记的兔抗豚鼠（1:2000稀释）分别检测兔和豚鼠多抗；TMB显色5min，检测波长450nm处读取A₄₅₀值，阴性A₄₅₀读值减去空白值的2.1倍作为cutoff阈值，大于cutoff值判为阳性反应，阳性反应的最大稀释度倒数值为抗体ELISA效价。采用SDS-PAGE和Western Blotting方法验证抗体纯度和特异性。病毒内部参考品经10% SDS-PAGE电泳后，转膜，10%脱脂牛奶封闭室温1h后，加入兔抗轮状病毒G1P[8]多抗（1:500稀释）室温孵育1h后；加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1:2000稀释）室温孵育1h后；洗膜，DAB显色，记录；

步骤4、酶标抗体的制备：采用HRP标记试剂盒（购自北京）对兔抗轮状病毒G1P[8]多抗进行标记，操作按说明书进行；

步骤5、轮状病毒G1P[8]抗原ELISA定量方法：将山羊抗轮状病毒多抗和兔抗轮状病毒HRP标记抗体分别采用1:200开始2倍梯度稀释棋盘滴定，确定包被抗体和酶标检测抗体工作浓度，本研究参考《中国药典》三部（2015板）通则213技术指南 9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行验证；

步骤6、线性范围及灵敏度：将轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品用含1%BSA的PBST稀释至200、100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6ng/ml 8个浓度，每个浓度做2个复孔，重复检测5次，计算线性范围；

步骤7、准确度：将轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品用含1%BSA的PBST稀释至高、中、低3个浓度：0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml，每个浓度做2个复孔，重复检测5次，计算回收率；

精密度：板内精密度使用同一片酶标板，轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品用含1%BSA的PBST稀释到0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml浓度，采用建立的方法重复5次测试，每个浓度2个复孔。板间精密度采用同一批包被的酶标板，重复5次，检测轮状病毒G1P[8]病毒内部参考品用含1%BSA的PBST稀释到0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml高、中、低3个浓度，每个浓度12个复孔。计算变异系数CV值；

稳定性：包被酶标板置于37^oC孵育 0、7天，将抗原内部参考品稀释至0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml3个浓度，用建立的方法检测不同浓度抗原样品，计算酶标板37^oC放置7天后稳定性的CV值；

特异性：用建立的方法检测采用相同纯化工艺制备的轮状病毒ZTR-68株（G1P[8]型），轮状病毒Wa株（G1P[8]型），轮状病毒SA-11株（G3P[2]型），轮状病毒Gottfried株（G6P[4]型），以及Vero细胞培养冻融上清液、Sabin IPV -I型脊髓灰质炎病毒、EV71型病毒。

结论：

状病毒G1P[8]型病毒内部参考品鉴定，Western Blotting 和透射电镜分析显示，轮状病毒G1P[8]内参抗原与轮状病毒阳性鉴别血清发生特异性反应，相对分子量38kDa有明显组抗原VP6蛋白条带，大小与预期相符，见图1；轮状病毒G1P[8]内参抗原有较多完整病毒颗粒，颗粒大小直径为70~75 nm，完整度较好，见图2。

纯化轮状病毒G1P[8]型抗体鉴定，轮状病毒特异性抗体ELISA检测结果显示，兔抗轮状病毒G1P[8]型效价为1：5120，1：2000为适宜的反应稀释度。

轮状病毒G1P[8]型抗原ELISA定量检测方法建立，经过对ELISA检测条件的优化，建立了轮状病毒G1P[8]型抗原定量ELISA检测方法：采用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释山羊抗轮状病毒多克隆抗体至终浓度2.0 ug/ml包被抗原板，100ul/孔，4^oC过夜；洗板3次，拍干，加入含3% BSA的PBST封闭液，200ul/孔，37^oC孵育2h；洗板3次，拍干，加入稀释的轮状病毒样品，100ul/孔，37^oC孵育1h；洗板3次，拍干，加入酶标记兔抗轮状病毒G1P[8]型多抗，1：2000稀释，100ul/孔，37^oC孵育1h；洗板3次，拍干，TMB显色5min, 2 mol/L H₂SO₄终止反应。读取A₄₅₀吸光度值，计算轮状病毒抗原含量。

ELISA定量检测方法准确度和精密度验证，轮状病毒G1P[8]型内部参考品高、中、低三组剂量浓度样品回收率分别为94.6~102.0%、90.6~108.3、93.3~111.8，表面该方法准确度良好，见表1。

ELISA定量检测方法稳定性和特异性验证，稳定性结果显示，建立的ELISA系统保存7天后，检测值间无显著性差异（P>0.05）（图3）。特异性结果显示，建立的ELISA系统与轮状病毒外抗原均无交叉反应，与不同型别轮状病毒抗原存在交叉反应，能检出抗原量（图4）。