一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法与流程

本发明涉及检测分析领域，具体涉及一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法。

背景技术：

色谱柱是样品分离的场所，是色谱分离过程的核心，其稳定高效的性能是建立适用范围广范、重现性理想的分离方法的基础。其中，涂层毛细管开管柱在电泳中的应用已经非常明显，并且应用范围越来越广。同传统制备开管柱的方法(填充柱和整体柱)相比，开管柱以其操作简单、低柱压、高柱效等优点越来越受到人们重视。

开管柱的基材一般为毛细管，参照图1与图2所示，为裸柱内表面，开管柱在很多方面比传统的高效液相色谱和电色谱表现出色，但开管柱的最大缺点是柱容量低，且样品在流动相中的扩散较低，因此，它的制备关键是如何通过增大表面积来增大柱容量。为解决这一问题，科学家研究了很多开管柱制备方法，以达到增大其内表面积和柱容量的目的。主要的制备方法包括吸附、键合和交联、多孔层、蚀刻后化学键合、溶胶-凝胶法和分子印迹,利用上述方法制备的开管柱可大大提高分析物的柱效、分辨率，缩短分析时间等。

目前的制备方法一般为两种，第一种制备方法时在300-400℃下用氟化氢铵溶液刻蚀毛细管，表面积可以增大1000倍；第二种制备方法是先在内壁上键合一层多孔硅胶，即四乙氧基硅烷、乙醇、盐酸或氨水以一定比例混合，通过水解、缩聚反应，与毛细管内壁上的硅羟基相连，再在硅胶上引入其他官能团。化学键合和/或交联作用机理是改变了毛细管内壁的电荷量与符号或改变管壁的其他物理化学性质。

制备方法简便的物理吸附涂层柱存在不够确定的缺点，而稳定性较好、操作条件灵活的化学键合涂层柱由于制备的过程繁琐，操作的步骤较多等原因，成本很高，使其广泛应用收到限制。参照图3与图4所示，内壁上有一层涂层，但涂层表面不均一。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法，本发明操作简便，产品后处理简单，实验成本低，并使用寿命长。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)毛细管的预处理，首先截取一段毛细管，在HCl溶液冲洗1.8-2.2h，然后用超纯水冲洗至pH值为中性，接着采用NaOH溶液冲洗1.8-2.2h，然后用去离子水冲洗至pH值为中性，接着再用丙酮冲洗30min,最后放置到180℃环境下通N₂处理3h，得到预处理好的毛细管，备用；

步骤2)溶剂液体制备，先将DA.HCl溶于Tris-HCl溶液中,涡旋震荡器上混匀1min，即制得多巴胺溶液，然后将APS溶于Tris-HCl溶液中并放入4℃冰箱保存，得到过硫酸铵溶液，待用；接着按体积份数计，将203-230份Tris-HCl溶液、370-400份多巴胺溶液和385-410份过硫酸铵溶液混合，并放置在涡旋震荡器上混匀至颜色为红棕色，得到溶剂液体；

步骤3)吸取溶剂液体，以4-6μL/min的流速缓慢注入预处理好的毛细管中，使其缓慢流动60min后，将毛细管两端用硅胶密封，并置入40℃水浴锅中反应11-13h；

步骤4)反应结束后，将毛细管两端切口，用N₂吹掉残留未反应的液体，并置入40℃干燥箱内缓慢干燥9-11h；

步骤5)干燥结束后用Tris-HCl溶液冲洗掉毛细管内壁吸附的多巴胺溶液，然后用超纯水冲洗干净，在40℃下烘干即得到成品。

进一步的，所述步骤1中HCl溶液冲洗速度、超纯水冲洗速度、NaOH溶液冲洗速度、去离子水冲洗速度和丙酮冲洗速度均为10μL/min。

进一步的，所述步骤2中将25mg的DA.HCl溶于1mL的Tris-HCl溶液中，所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为8.5。

进一步的，所述步骤2中将10mg的过硫酸铵溶于1mL的Tris-HCl溶液中，所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为8.5。

进一步的，所述步骤5)中Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为7。

进一步的，所述步骤2)中按体积份数计，将217份Tris-HCl溶液、383份多巴胺溶液和400份过硫酸铵溶液混合。

本发明的有益效果是:

本发明制备的开管柱具有均一的膜表面，很好的覆盖住了毛细管内壁的硅羟基，减少了内壁对蛋白的吸附，对蛋白能达到很好的分离效果，并且制备方法简单、成本低，无安全隐患，产品后处理简单，使得实验成本低，并且使用寿命长。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是未处理的毛细管侧视图；

图2是未处理的毛细管内壁视图；

图3是现有技术处理的毛细管侧视图；

图4是现有技术处理的毛细管内壁视图；

图5是本发明处理的毛细管侧视图；

图6是本发明处理的毛细管内壁视图；

图7是本发明分离稀释鸡蛋清和所对应峰的标准蛋白电色谱图；

图8是本发明分离稀释脱脂牛奶和所对应峰的标准蛋白电色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法：

毛细管的预处理，首先截取一段毛细管，在HCl溶液冲洗2h，然后用超纯水冲洗至pH值为中性，接着采用NaOH溶液冲洗5h，然后用去离子水冲洗至pH值为中性，接着再用丙酮冲洗30min,最后放置到180℃环境下通N₂处理3h，得到预处理好的毛细管，备用；其中HCl溶液冲洗速度、超纯水冲洗速度、NaOH溶液冲洗速度、去离子水冲洗速度和丙酮冲洗速度均为10μL/min。

溶剂液体制备，溶剂液体制备与毛细管的预处理可以同时进行，也可以在毛细管的预处理前进行，先将25mg的DA.HCl溶于1mL的Tris-HCl溶液中，其中Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为8.5,放置在涡旋震荡器上混匀1min，即制得多巴胺溶液，然后将10mg的过硫酸铵溶于1mL的Tris-HCl溶液中，其中Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为8.5，并放入4℃冰箱保存，得到过硫酸铵溶液，待用，此处放置冰箱中为了避免配备的硫酸铵溶液快速反应，以降低效用或者直接失效的可能发生；接着按体积份数计，将217μL Tris-HCl溶液、383μL多巴胺溶液混合均匀，然后再加入400μL过硫酸铵溶液混合，最后放置在涡旋震荡器上混匀至颜色为红棕色，得到溶剂液体。

步骤3)用一次性注射器吸取溶剂液体，以5μL/min的流速缓慢注入预处理好的毛细管中，使其缓慢流动60min后，将毛细管两端用硅胶密封，并置入40℃水浴锅中反应12h；

步骤4)反应结束后，将毛细管两端切口，用N₂吹掉残留未反应的液体，并置入40℃干燥箱内缓慢干燥10h；

步骤5)干燥结束后用Tris-HCl溶液冲洗掉毛细管内壁吸附的多巴胺溶液，其中Tris-HCl溶液的浓度为10mM、PH值为7，然后用超纯水冲洗干净，在40℃下烘干即得到成品。

实施例二

实施例二与实施例一的区别在于，

步骤1)中HCl溶液冲洗1.8h，NaOH溶液冲洗1.8h；

步骤2)中将203份Tris-HCl溶液、370份多巴胺溶液和385份过硫酸铵溶液混合。

步骤3)中以4μL/min的流速缓慢注入预处理好的毛细管中，置入40℃水浴锅中反应11h；

步骤4)中置入40℃干燥箱内缓慢干燥9h；

步骤5)干燥结束后用Tris-HCl溶液冲洗掉毛细管内壁吸附的多巴胺溶液，然后用超纯水冲洗干净，在40℃下烘干即得到成品。

实施例三

实施例三与实施例一的区别在于，

步骤1)中HCl溶液冲洗2.2h，NaOH溶液冲洗2.2h；

步骤2)中将230份Tris-HCl溶液、400份多巴胺溶液和410份过硫酸铵溶液混合。

步骤3)中以6μL/min的流速缓慢注入预处理好的毛细管中，置入40℃水浴锅中反应13h；

步骤4)中置入40℃干燥箱内缓慢干燥11h；

步骤5)干燥结束后用Tris-HCl溶液冲洗掉毛细管内壁吸附的多巴胺溶液，然后用超纯水冲洗干净，在40℃下烘干即得到成品。

参照图5和图6所示，采用上述方法制备的开管柱内部具有均一的膜表面，很好的覆盖住了毛细管内壁的硅羟基，减少了内壁对蛋白的吸附，对蛋白能达到很好的分离效果，膜层厚度大约160nm。相对于图3和图4中的涂层表面来讲，十分粗糙和不平坦的的表面没有很好的屏蔽硅羟基，对蛋白不能达到很好的分离效果。并且采用本方法制得的涂层是一种正电荷涂层，进一步加强分离效果。

将本产品使用到具体分离真实样品的处理中，真实样品采用鸡蛋清蛋白和牛奶；

1、将新鲜鸡蛋(从本地超市购买)的蛋清和蛋白分离，然后用10mM，pH＝7.30Tris-HCl缓冲液将鸡蛋清稀释20倍，冰浴搅拌6h，在4℃的离心机下，10,000rpm，离心30min，离心后的上层清液用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液置于冰箱中冷藏备用。鸡蛋清蛋白的电泳分离采用pH＝3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，用Tris-HCl缓冲液从鸡蛋中提取出来的鸡蛋清中主要含有三种蛋白：卵清蛋白(OVA,pI＝5)，伴清蛋白(Con A，pI＝6)以及溶菌酶(Lysozyme，pI＝11)，如图7所示，卵清蛋白最先迁移出来，随后是伴清蛋白A，最后出峰的是溶菌酶。在鸡蛋清中，卵清蛋白质占据了主要部分[100]，其含量大约为54％，伴清蛋白的含量约为12％，溶菌酶所占的含量比较少约为3.4％，因而溶菌酶的出峰面积也是最小的，伴清蛋白是一个宽的峰型。其中，电泳条件：毛细管，50μm i.d.×39.2cm(29.2cm有效长度)；电泳缓冲溶液，40mM pH＝3.0磷酸氢二钠-柠檬酸；分离电压，-20kV；进样条件，0.5psi for 5s；温度，25℃；检测波长，214nm.峰：(1)卵清蛋白，(2)伴清蛋白，(3)溶菌酶。

2、鲜牛奶购自当地超市，首先它在4℃的离心机下，以9,000rpm离心30min去除鲜牛奶中的脂类物质，取上层清液用20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液稀释十倍，然后稀释的脱脂牛奶通过0.45μm的过滤膜过滤，电泳分析待用。脱脂鲜牛奶中主要含有以下两大类蛋白质。一类是不溶于水的酪蛋白，另一类是可溶于水的乳清蛋白，乳清蛋白主要含有乳白蛋白和乳球蛋白。如图8所示，是用本开管柱(4.0mg mL-1APS)分离脱脂鲜牛奶和对应蛋白标准品的电泳谱图。结果显示涂层毛细管在20mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中能将β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、α-乳球蛋白六种蛋白质有效分离(这六种蛋白质都属于酸性蛋白，在酸性环境下带正电。与未涂覆的毛细管内壁解离的硅羟基(带负电)存在静电相互作用，从而在裸柱上无法实现分离)。其中，电泳条件：毛细管，50μm i.d.×39.2cm(29.2cm有效长度)；电泳缓冲溶液，40mM磷酸氢二钠-柠檬酸；分离电压，-20kV；进样条件，0.5psi for 5s；温度，25℃；检测波长，214nm.峰：(1)β-酪蛋白，(2)κ-酪蛋白，(3)α-酪蛋白，(4)α-乳白蛋白，(5)牛血清白蛋白，(6)α-乳球蛋白。

本开管柱用于食品蛋白(鸡蛋清和脱脂牛奶)的分离，实验结果表面该涂层在分离复杂样品鸡蛋清蛋白质和脱脂鲜牛奶蛋白时都取得了较理想的分离效果。该涂层具有很好的稳定性，从而实现了对鸡蛋清样品和脱脂牛奶中主要蛋白的分离分析。

本开管柱能够很好的屏蔽硅羟基且有效地控制EOF(电渗流)的大小并抑制蛋白质的吸附。从而实现对五种标准蛋白的基线分离，具有理想的分离效率和重现性。此外，还研究通过在不同pH值条件和不同缓冲溶液浓度条件下对蛋白分离的情况，实验结果表明本开管柱能有效地控制EOF的大小和很好地抑制蛋白质的吸附，具有良好的稳定性。能很好地应用于蛋白质的电泳分离，能有效地抑制蛋白质的吸附，且具有很好的稳定性。因而，该涂层能应用于复杂生物样品的分离。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。