一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法与流程

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。

背景技术：

叶酸是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成的水溶性维生素。叶酸在人体内主要参与嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和转化，参与构成含铁的血红蛋白，参与蛋白质的代谢等，是细胞生长和繁殖所必需的物质。临床上可以用来预防神经管畸形，还可用于治疗慢性萎缩性胃炎、抑制支气管鳞状转化以及防治因高同型半胱氨酸血症引起的冠状动脉硬化症、心肌损伤与心肌梗塞等。研究表明，叶酸还能抑制肿瘤细胞中癌基因的表达，从而阻断恶性肿瘤的进展。目前叶酸在机体内的检测主要有微生物测定法、放射免疫测定法、色谱分析法等，这些方法都存在一定的局限性，而且也不能满足大批量样本的检测。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种重现性好、灵敏度高、分析速度快的检测血浆中叶酸浓度的方法，此法可用于药代动力学研究，为其临床给药提供有益的参考。

一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱-质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)血浆中叶酸浓度测定。

所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本，加入内标工作溶液沉淀蛋白，混匀后加超纯水混匀，低温离心，取上清液。

所述内标溶液中内标为格列本脲。

所述步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：

(a)液相色谱条件色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸-水(A)与乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B。

(b)质谱条件质谱采用Agilent 6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)。

所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为Thermo Accucore C18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃。

所述(b)质谱条件中，干燥气：N₂；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V。MRM监测方法参数如下：定量离子对叶酸：[M+H]+m/z 442.2/295.1，碎片电压：100V，碰撞能量：10eV；内标格列本脲：[M+H]+m/z 494.2/369.0，碎片电压：130V，碰撞能量：9eV。

所述(3)标准曲线制备的步骤包括：分别取100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/ml的叶酸标准溶液10μl加入大鼠空白血浆90μl，涡旋得10、25、50、100、250、500、1000ng/ml的标准样本溶液，按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的叶酸对应的峰面积；以叶酸和内标的峰面积比值为纵坐标，以叶酸的浓度为横坐标X，制备叶酸的线性回归方程。

所述(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定的步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录叶酸对应的峰面积，将叶酸和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到所述待测血浆中叶酸的浓度。

所述叶酸标准溶液配制：精密称取叶酸10mg，置10ml量瓶中，加5ml二甲亚砜超声溶解，然后用乙腈定容至刻度，配制1mg/ml的储备液，然后用乙腈稀释至100～10000ng/ml的系列标准溶液。

所述内标格列本脲标准溶液配制：精密称取10mg格列苯脲置10ml量瓶中，乙腈超声溶解并定容至刻度，配成浓度为1mg/ml的储备液，然后取0.5ml置10ml量瓶中，加乙腈定容至刻度得50μg/ml的内标溶液，最后取50μg/ml内标溶液250μl置250ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，得50ng/ml的内标工作溶液。

所述的混匀，为采用涡旋混匀1min。

所述的低温离心是低温4℃，12000r/min，离心5min。

本发明所述方法可用于叶酸片剂中叶酸的药代动力学研究。

本发明的有益效果：本发明首次基于HPLC-MS/MS法建立了大鼠血浆的采集、分离分析方法，并成功的应用于SD大鼠灌胃给药叶酸溶液后血浆中叶酸的浓度检测。此方法灵敏度高，重现性好，能满足大批量样本的检测。

附图说明

图1 SD大鼠空白血浆MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。

图2 空白血浆添加叶酸和内标的MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。

图3 大鼠灌胃给药2h后血浆样品添加内标的MRM质谱图。图中：A-叶酸，B-内标。

图4 大鼠灌胃给药后的药物浓度-时间曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明。下述内容仅用于说明本发明，但本发明不局限于此。

1仪器与试剂

Agilent 1260-6430液相质谱联用系统(LC-MS/MS，安捷伦科技有限公司)。包括G1379B型脱气机，G1312B型二元输液泵，G1367E型自动进样器，G1330B型控温模块，G1316A型柱温箱，6430MS/MS系统及Mass hunter数据采集软件。XL16K-T台式高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司。Advantage A10Milli-Q超纯水机，默克化工技术(上海)有限公司。Vortex Genius 3涡旋仪，广州仪科实验技术有限公司。

叶酸(纯度89.7％)和格列本脲(纯度99.5％)均购于中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯，Fisher scientific)。甲酸(色谱纯，Sigma-Aldrich)。水，Advantage A10Milli-Q超纯水机制备的超纯水。

2对照品溶液配制

2.1叶酸标准溶液配制

精密称取叶酸10mg，置10ml量瓶中，加5ml二甲亚砜超声溶解，然后用乙腈定容至刻度，配制1mg/ml的储备液，然后取叶酸1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得100μg/ml的对照品溶液(I)，然后加乙腈稀释成系列对照品储备液，见表1。

表1叶酸标准溶液配制

2.2格列本脲溶液配制

精密称取10mg格列苯脲置10ml量瓶中，乙腈超声溶解并定容至刻度，配成浓度为1mg/ml的储备液，然后取0.5ml置10ml量瓶中，加乙腈定容至刻度得50μg/ml的内标溶液，最后取50μg/ml内标溶液250μl置250ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，得50ng/ml的内标工作溶液。

3样本处理方法

血浆样本解冻后取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测。

4实验动物

SD大鼠6只，体重180～220g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，在温度25℃、湿度60％±5％条件下饲养一周后灌胃给药叶酸溶液，叶酸给药剂量为每1kg大鼠给药2.4mg。分别于给药前，给药结束0.5、1、2、4、6、8、24h颈静脉取血0.2ml，置1.5ml涂肝素钠的尖底离心管中，在4℃下4000r/min离心10min，取上层血浆-20℃冰箱中保存备用。

5方法学验证

5.1 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：液相采用Agilent 1260高效液相，色谱柱为Thermo Accucore C18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)；流动相：0.1％甲酸-水(A)与乙腈(B)；洗脱梯度：0～0.5min，5％B；2.2～3.2min，95％B；3.21～6min，5％B。样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃。

质谱条件：离子化方式：电喷雾-正离子(API-ES)；干燥气：N₂；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V。监测方式：MRM。定量离子对叶酸：[M+H]⁺m/z 442.2/295.1，碎片电压：100V，碰撞能量：10eV；内标格列本脲：[M+H]⁺m/z 494.2/369.0，碎片电压：130V，碰撞能量：9eV。

5.2专属性

取30μl空白血浆，加入150μl乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，得空白血浆质谱图(如图1)；取1000ng/ml叶酸标准溶液10μl，加空白血浆90μl，涡旋后取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，得分析物质谱图(如图2)；取给药后2h的血浆样品30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，得血浆样品质谱图(如图3)。

5.3残留效应

在标准曲线最高浓度进样后进大鼠空白血浆，评价方法和仪器的残留，结果表明，叶酸的残留量小于定量下限的10％，表明残留不影响叶酸的准确定量。

5.4线性和定量下限

别取100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/ml叶酸标准溶液10μl加入空白血浆90μl，涡旋得10、25、50、100、250、500、1000ng/ml标准样本溶液，取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测。以叶酸的浓度为横坐标X，叶酸与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权最小二乘法(权重为1/X²)进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。回归方程为Y＝0.1361X+0.0023，r＝0.9985。叶酸在10～1000ng/ml范围内线性关系良好。

取10ng/ml标准样本溶液30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，平行6个样本。结果准确度为89.1％，精密度为6.0％。均符合生物样本的检测要求。因此10ng/ml作为定量下限。

5.5准确度和精密度

分别取100、200、800、8000ng/ml叶酸标准溶液10μl，加空白血浆90μl，涡旋得定量下限(10ng/ml)、低(20ng/ml)、中(80ng/ml)、高(800ng/ml)4个浓度的标准样本溶液，每一浓度5个平行样本，取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测。以标准曲线算得叶酸的浓度，并计算其批内准确度和精密度。连续处理3个分析批，计算叶酸的批间准确度和精密度。结果见表2。

表2叶酸的批内和批间准确度与精密度

5.6回收率和基质效应

分别取200、800、8000ng/ml叶酸标准溶液10μl，加乙腈90μl，涡旋得低(20ng/ml)、中(80ng/ml)、高(800ng/ml)3个浓度的标准溶液，每一浓度6个平行样本，取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，得到的峰面积计为set1。

分别取200、800、8000ng/ml叶酸标准溶液10μl，加空白血浆90μl，涡旋得低(20ng/ml)、中(80ng/ml)、高(800ng/ml)3个浓度的标准样本溶液，每一浓度6个平行样本，取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测，得到的峰面积计为set2。

取6份大鼠空白血浆40μl，加200μl乙腈，涡旋混匀2min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液作为空白基质溶液；分别取200、800、8000ng/ml混合对照溶液10μl，加乙腈90μl，涡旋得低(20ng/ml)、中(80ng/ml)、高(800ng/ml)3个浓度的标准溶液，每一浓度6个平行样本，取30μl加150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)，然后加180μl空白基质溶液，涡旋混匀后，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样。峰面积计为set3。

以set3/set1计算基质效应；set2/set3计算提取回收率。结果见表3。

表3叶酸和内标的回收率和基质效应

5.7稳定性考察

分别取200、800、8000ng/ml叶酸标准溶液20μl，加空白血浆180μl，涡旋得低(10ng/ml)、中(100ng/ml)、高(800ng/ml)3个浓度的标准样本溶液，每一浓度6个平行样本，分别考察室温短期6h稳定性、长期30d稳定性、冻融循环稳定性和样品制备后24h自动进样器稳定性。结果见表3。

表3叶酸的稳定性

5.8大鼠血浆样本测定结果

大鼠血浆样本从冰箱取出解冻，然后取30μl置于1.5ml离心管中，加入150μl内标工作溶液(含内标50ng/ml)沉淀蛋白，涡旋混匀1min，加超纯水180μl，涡旋混匀1min，低温4℃，12000r/min离心5min，取上清液进样检测。结果见图4。

6讨论

(1)样本处理优化，叶酸是水溶性维生素，极性相对较大，仅采用常规的有机溶剂沉淀蛋白的方法叶酸的回收率不足10％，影响方法的重现性。而固相萃取方法虽能满足方法学要求，但处理过程繁琐，耗时，成本高。研究中发现在蛋白沉淀后添加适量的纯化水，即能大大提高叶酸的回收率。因此本发明中样本处理方法采用在蛋白沉淀后添加水的方式，回收率由不足10％，提高到80.0％以上，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。

(2)灵敏度高，叶酸的最低定量限为10ng/ml。

(3)专属性强，采用Thermo Accucore C18色谱柱，梯度洗脱，叶酸保留时间2.6min，格列本脲保留时间3.6min，分析时间仅5min，内源性物质不影响叶酸的准确定量。

(4)样本用量小，该方法血浆用量仅30μl，既能满足检测需求，避免了采血过多，对大鼠造成伤害，为小动物血浆药物浓度检测提供参考。

(5)色谱柱，Thermo Accucore C18色谱柱是由表面多孔填料颗粒填充而成，这种填料具有实心内核(1.6μm)和表面多孔层，多孔外层的扩散路径为0.5μm；该色谱柱的优点是具有与亚二微米填料相媲美的柱效，而产生的反压却明显低于后者，同时还具有峰容量高的优点。