一种用于检测动物胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及一种用于检测动物胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法。本发明属于医药检测技术领域。

背景技术：

动物胶是以动物的皮或骨等为原料，将其中所含的胶原经过部分水解、萃取和干燥制成的蛋白质固形物，在食品、药品和化妆品等领域中有着广泛重要的用途。常见的动物胶包括阿胶、黄明胶、鲜阿胶(猪皮胶)、羊皮胶、马皮胶、龟甲胶、鹿角胶等等。其中阿胶作为一种传统名贵中药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润燥，止血的功效。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。从原料生物分类学上看，驴属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括关中驴、德州驴、广灵驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等众多地方品种。由于驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨，市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、骡皮、牛皮、猪皮等来取代驴皮进行熬制，有的甚至直接掺入工业明胶。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消费者利益，影响正规产品的信誉。

动物胶经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射、HPLC等方法对阿胶进行真伪鉴别常存在判断不准确、缺乏足够说服力等。目前已报道的鉴别阿胶中驴皮源成分含量的方法，基本都没有排除马皮源性成分，因此虽宣称为驴皮源成分，实则为驴与马共有。

因此，目前迫切需要提出一种能够快速、准确检测动物胶中驴皮源成分含量的方法，进而实现对含驴皮源的产品的真伪鉴别。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定动物胶中驴皮源成分含量的组合物。

本发明的另一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定动物胶中驴皮源成分含量的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定动物胶中驴皮源成分含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一种用于检测动物胶中驴皮源成分含量的组合物，所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成，其特征在于：所述多肽I的氨基酸序列为Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.1所示)，多肽II的氨基酸序列为Gly-Ile-Hyp-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO.2所示)，多肽III的氨基酸序列为Gly-Val-Val-Gly-Leu-Pro-Gly-Gln-Arg(SEQ ID NO.3所示)，对照品检测基质为鱼皮胶。

含有所述组合物的检测试剂盒也在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明还提出了一种用于检测动物胶中驴皮源成分含量的方法，具体包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀释至刻度；

2)对照品母液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，将称量好的的多肽I、多肽II和多肽III置于该量瓶中，用NH₄HCO₃溶液溶解并稀释至刻度；

3)对照品溶液制备：以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(2)待测动物胶溶液的制备

将称量好的待测动物胶置于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液，超声使动物胶完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(3)液质联用仪检测

将步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测动物胶溶液分别放入液质联用仪，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→830.4、927.5，m/z442.0→726.4、570.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中，m/z393.4→499.3，m/z634.7→830.4，m/z442.0→726.4分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测；

(4)动物胶中驴皮源成分含量的计算

以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，由此计算出动物胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量，从而计算出动物胶中驴皮源成分的含量，待检测动物胶中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，按下式计算出动物胶中驴皮源成分的含量：

驴皮源成分的含量(％)＝(M1/392.4–M2/633.7)×880/M3×100％

本发明的用于检测动物胶中驴皮源成分含量的方法，优选的，步骤(1)及步骤(2)所述的酶解温度为37℃。

本发明的用于检测动物胶中驴皮源成分含量的方法，优选的，步骤(3)中液质联用仪检测的液相条件为：C₁₈反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测。

优选的，所述动物胶为阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶或其他胶类中药。

再进一步的，本发明还提出了所述的组合物或所述的试剂盒在检测动物胶中的驴皮源含量中的应用。

直接对动物胶中驴皮源成分进行准确的含量检测，首先要找出能标志驴皮源成分且在不同生产工艺的纯品阿胶中含量相对稳定的物质，尤其要去除与驴亲缘关系较近的马、骡等的伪品成分；其次阿胶中的成分非常复杂，检测时信号不稳定，因此该物质要满足在检测时具有较高的信号响应、较低的噪音及其他物质干扰，还应考虑检测信号的稳定性；第三需要设立合适的对照品等。

对此，本发明通过选取驴皮源性特征性多肽，并采用多肽I的检测值减去多肽II的检测值，并利用多肽III的检测值来修正检测偏差，从而实现对动物胶中驴皮源成分的含量检测。实验证明，采用本发明的方法，能够准确地检测动物胶中驴皮源成分的含量，且操作简单，在动物胶产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→830.4、m/z442.0→726.4监测的质谱图；

图2是各种纯品动物胶溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→830.4、m/z442.0→726.4监测的质谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

1、材料和试剂

材料：各种纯品动物胶，包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、羊皮胶，鱼皮胶(对照品检测基质)分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、羊皮、鱼皮煎煮获得。

多肽I、多肽II、多肽III交由生物公司合成。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。

2、检测方法

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备：

称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀；

2)对照品母液的制备：

将称量好的0.05g对照品检测基质置于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.2mg的多肽III于该量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀释至刻度，摇匀；

3)对照品溶液的制备：

采用分步稀释的方法，以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释1000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(2)待测纯品动物胶溶液的制备

称量待测纯品动物胶0.05g置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使纯品动物胶完全溶解，加1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(3)液质联用仪检测

将步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待测纯品动物胶溶液分别取5μl放入液质联用仪检测，液相条件为：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→830.4、927.5，m/z442.0→726.4、570.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中，m/z393.4→499.3，m/z634.7→830.4，m/z442.0→726.4分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测；

(4)动物胶中驴皮源成分含量的计算

图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→830.4、m/z442.0→726.4监测的质谱图；图2是各种纯品动物胶溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z393.4→499.3、m/z634.7→830.4、m/z442.0→726.4监测的质谱图。

以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，各多肽的线性相关系数R≥0.9992，由此计算出动物胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量，从而计算出动物胶中驴皮源成分的含量，待检测动物胶中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，按下式计算出动物胶中驴皮源成分的含量：

驴皮源成分的含量(％)＝(M1/392.4–M2/633.7)×880/M3×100％

其中，各样品中驴皮源成分的含量：

阿胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2411/392.4–0/633.7)×880/0.5418×100％＝99.79％≈100％

马皮胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0/392.4–0/633.7)×880/0.5367×100％＝0％

黄明胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2420/392.4–0.3896/633.7)×880/0.5422×100％＝0.31％≈0％

猪皮胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0/392.4–0/633.7)×880/0.5486×100％＝0％

羊皮胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2697/392.4–0.4333/633.7)×880/0.5592×100％＝0.56％≈0％

上述计算结果表明：阿胶中驴皮源成分的含量100％，马皮胶、黄明胶、猪皮胶和羊皮胶中驴皮源成分的含量为0％。这与实际情况相符，表明该方法能检测动物胶中驴皮源成分的含量。

实施例2

1、材料和试剂

材料：混合胶样品：由实施例1中的纯品胶样品分别加入不同质量百分数的阿胶制成，包括含15％阿胶的黄明胶、含30％阿胶的黄明胶、含60％阿胶的黄明胶、含30％阿胶的马皮胶、含30％阿胶的猪皮胶,分别命名为样品1、样品2、样品3、样品4以及样品5。

多肽I、多肽II、多肽III，鱼皮胶(对照品检测基质)按照实施例1方法制备。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。

2、检测方法

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备：

称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀；

2)对照品母液的制备：

将称量好的0.05g对照品检测基质置于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，称取15.3mg的多肽I、24.7mg的多肽II和17.2mg的多肽III于该量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀释至刻度，摇匀；

3)对照品溶液的制备：

采用分步稀释的方法，以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液分别稀释500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(2)待测动物胶溶液的制备

称量待测混合动物胶0.05g置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使混合动物胶完全溶解，加1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(3)液质联用仪检测

将步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测动物胶溶液分别取5μl放入液质联用仪检测，液相条件为：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→40min，流动相A 100％→50％，流动相B 0％→50％。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z393.4→499.3、643.3，m/z634.7→830.4、927.5，m/z442.0→726.4、570.3作为检测离子对进行MRM扫描，其中，m/z393.4→499.3，m/z634.7→830.4，m/z442.0→726.4分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测；

(4)动物胶中驴皮源成分含量的计算

以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，各多肽的线性相关系数R≥0.9992，由此计算出混合动物胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量，从而计算出混合动物胶中驴皮源成分的含量，待检测动物胶中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3，按下式计算出混合动物胶中驴皮源成分的含量：

驴皮源成分的含量(％)＝(M1/392.4–M2/633.7)×880/M3×100％

含15％阿胶的黄明胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2493/392.4–0.3425/633.7)×880/0.5369×100％＝15.55％

含30％阿胶的黄明胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2467/392.4–0.2732/633.7)×880/0.5473×100％＝31.77％

含60％阿胶的黄明胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.2430/392.4–0.1564/633.7)×880/0.5416×100％＝60.52％

含30％阿胶的马皮胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.0749/392.4–0/633.7)×880/0.5587×100％＝30.06％

含30％阿胶的猪皮胶中驴皮源成分的含量(％)＝(0.0719/392.4–0/633.7)×880/0.5391×100％＝29.91％

上述计算结果表明：利用本发明的检测方法得到的样品1-5的驴皮源检测含量与实际情况相符，表明该方法能准确检测动物胶中驴皮源成分的含量。

综上所述，利用本发明公开的三个多肽以及对照品检测基质，采用液质联用仪，能准确检测动物胶中驴皮源成分的含量。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

序列表

<110> 东阿阿胶股份有限公司

<120>一种用于检测动物胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法

<130> KLPI161254

<160> 3

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽I

<400> 1

Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Val Arg 9

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 多肽II

<400> 2

Gly Ile Hyp Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽III

<400> 3

Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg 9