一种全面检测肉制品中N‑亚硝胺含量的方法与流程

本发明涉及食品安全领域，具体是一种全面检测肉制品中n-亚硝胺含量的方法。

背景技术：

酒类、肉及鱼类腌制品、豆制品等食品中含有n-亚硝胺类化合物，该化合物为剧毒有机化合物，具有强烈的致癌、致畸和致突变性，是四大食品污染物之一。新鲜的食品中，亚硝胺类化合物的含量很低，但在运输、加工、储存等过程中很容易因缺氧、积热、微生物、霉变等因素产生各种各样的n-亚硝胺化合物；食品的来源不同、微生物种类不同、存放的时间不同，产生的n-亚硝胺化合物种类也会不同。

近年来，我国虽然制定了n-亚硝胺检测方法，即gb／t5009.26-2003《食品中n-亚硝胺类的测定》。但该测定方法主要存在以下不足：（1）该方法只针对有限的4种亚硝胺化合物，而在食品中最为常见的n-亚硝胺有9种之多，因此现有的国家标准不能有效满足食品安全监测的需要。（2）该标准中样品的提取采用水蒸气蒸馏法，该方法作为传统的前处理技术，能较好的完成目标成分的分离，但通常要多次萃取、长时间蒸馏才能保证回收率，并且需要进一步的转移、浓缩，操作较为繁琐。（3）该测定方法采用的是热能分析仪法和高分辨质谱法，对仪器的特异性要求高，且价格较为昂贵，不便于该方法的推广及应用。随着对食品安全关注度的日益提高，建立一种高效快捷、覆盖全面、高灵敏度和高选择性的n-亚硝胺检测方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明针对现有亚硝胺检测方法存在的问题，提供一种耗时少、抗干扰性强、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本较低、准确度高可同时检测肉类制品中9种n-亚硝胺含量的方法。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种全面检测肉制品中n-亚硝胺含量的方法，包括以下步骤：

（1）样品提取：称取mg粉碎好的肉制品，加入乙腈、正己烷及无水硫酸镁，涡旋1-3min，超声提取10-30min，离心5-10min，倾出上清液，保留乙腈层弃去正己烷层，再用乙腈重复提取肉制品1-3次，合并提取液，减压旋蒸至近干，再用乙腈定容至vml；

（2）净化：量取定容后的溶液至装有c18/psa粉末的具塞离心管中，涡旋1-3min，离心3-5min，收集的上清液即为待测液样品；

（3）定性定量分析测定：取待测液样品进样，用气相色谱串联质谱仪分析检测，扫描n-亚硝胺的特征离子，得到待测样品的离子流色谱图，以n-亚硝胺的特征离子的保留时间和响应丰度比作为定性分析依据，以n-亚硝胺的特征离子响应强度作为定量分析依据；

（4）配制标准溶液：配制浓度为1.0ng/ml~1000ng/ml的n-亚硝胺系列标准溶液，取标准溶液进样到气相色谱串联质谱仪，根据检测结果绘制标准曲线，以外标曲线法计算样品中的n-亚硝胺的浓度c；

(5)结果计算：按以下公式计算肉制品中n-亚硝胺的含量x，x的单位为µg/kg；

。

进一步地，以上所述肉制品包括畜肉、禽肉、鱼肉的腌制品或熏制品。

进一步地，以上所述乙腈与正己烷的体积比0.5-2:1。

进一步地，以上所述肉制品与无水硫酸镁的质量比为2-4:1。

进一步地，以上所述c18/psa粉末中c18粉末与psa粉末的的质量比为0.5-2:1。

进一步地，以上步骤（1）所述减压旋蒸的温度为50-60℃。

进一步地，以上步骤（1）所述超声提取的温度为35-40℃，超声频率为50-70khz。

进一步地，以上步骤（1）所述离心的转速为3000-5000rpm；步骤（2）所述离心的转速为8000-12000rpm。

进一步地，以上所述气相色谱串联质谱仪为气相色谱三重四级杆质谱联用仪。

进一步地，以上采用气相色谱串联质谱仪检测时质谱单元的离子源采用ei源模式，离子源的温度为230-300℃，扫描模式采用srm模式；气相色谱单元的进样口温度为200-300℃，初始温度设定为35-40℃，保温3min，以10℃/min升温至100℃，保温5min,再以20℃/min升温至220℃，保温7min，10℃/min升温至240-250℃，以氦气作为载气，恒流模式进行色谱分离，不分流进样，进样量为1-2µl。

进一步地，本发明方法可同时检测肉制品中多种n-亚硝胺含量，所述n-亚硝胺包括n-亚硝基二甲胺、n-亚硝基甲乙胺、n-亚硝基二乙胺、n-亚硝基二丙胺、n-亚硝基二丁胺、n-亚硝基二苯胺、n-亚硝基吡咯烷、n-亚硝基哌啶和n-亚硝基吗啉。

进一步地，以上9种n-亚硝胺的气相色谱串联质谱特征离子及碰撞电压参数如下：

注：标注*的离子为定量离子。

与现有技术相比，本发明的优点及效益效果为：

1、本发明方法通过将肉类制品经用乙腈提取样品中的目标亚硝胺，用正己烷除去样品中的油脂，浓缩，浓缩液经c18/psa分散固相萃取净化后，采用气相色谱串联质谱仪测定。本方法具有耗时少、干扰性小、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备成本较低、准确度高可全面检测肉类制品中n-亚硝胺含量，方便推广应用。

2、本方法采用c18/psa粉末分散固相萃取净化，有效的去除干扰物质，比常见的蒸馏净化时间短，且除去干扰物质能力强，回收率高。

3、本发明利用超声波的空化作用来提取肉制品的n-亚硝胺，不仅可提高提取效率，还可提高n-亚硝胺的提取率，进而提高测定结果的准确度。

4、本发明采用气相色谱低分辨串联质谱法测定，串联质谱独特的srm扫描方式，可以避免相同质量数离子的干扰，增强了对n-亚硝胺检测的特异性和准确性，且对仪器的要求低，成本低。

5、本发明方法中n-亚硝胺的定量限为0.06~0.5µg/kg，检出限为0.02~0.2µg/kg，完全可以满足国家标准对肉类制品中n-亚硝胺的限量要求。

附图说明

图1为实施例1中n-亚硝胺标准品的总离子流色谱图；

图2a、2b、2c和为实施例1中n-亚硝胺标准品的定量定性离子提取色谱图；

图3a-3i为实施例1中n-亚硝胺标准品的标准曲线图；

图4为实施例2中空白肉制品加9种n-亚硝胺标准品的总离子流色谱图；

图5a、5b、5c为实施例2中空白肉制品加9种n-亚硝胺标准品的定量定性离子提取色谱图；

图6为实施例2中空白肉类制品的总离子流色谱图；

图7a、7b、7c为实施例2中空白肉类制品的定量定性离子提取色谱图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明进一步说明，但不限于本发明的保护范围。

实施例1

一种全面检测肉制品中n-亚硝胺含量的方法，包括以下步骤：

（1）样品提取：称取10g粉碎好的市售腊肠，加入20ml乙腈、10ml正己烷及2g无水硫酸镁，在转速为1000rpm涡旋1min，在温度为35℃、超声频率为60khz下超声提取15min，5000rpm下离心5min，倾出上清液，保留乙腈层弃去正己烷层，再用乙腈重复提取肉制品2次，合并提取液，50℃下减压旋蒸至近干，再用乙腈定容至5ml，摇匀；

（2）净化：量取定容后的溶液1.5ml至装有c18/psa粉末的2ml具塞离心管中，其中c18粉末为100mg、psa粉末为50mg，涡旋1min，12000离心3min，收集的上清液即为待测液样品；

（3）定性定量分析测定：取1.0µl待测液样品进样，用气相色谱串联质谱仪分析检测，扫描n-亚硝胺的特征离子，得到待测样品的离子流色谱图，以n-亚硝胺的特征离子的的保留时间和响应丰度比作为定性分析依据，以n-亚硝胺的特征离子响应强度作为定量分析依据。

检测时质谱型号为thermofishertrace1300/tsq8000evo，离子源采用ei源模式，离子源的温度为250℃，扫描模式采用srm模式。9种目标n-亚硝胺的气相色谱串联质谱特征离子及碰撞电压参数如下：

注：标注*的离子为定量离子。

气相色谱单元中采用的气相色谱柱为db-wax毛细管色谱柱，规格为30m柱长×0.25mm内径×0.25µm膜厚；进样口温度250℃；初始温度35℃，保持3min，10℃/min升温至100℃，保持5min，20℃/min升温至220℃，保持7min，10℃/min升温至240℃，保持5min；氦气作载气，恒流模式进行色谱分离；不分流进样，进样量为1µl。

(4)标准曲线的制作：分别取10µl、50µl、100µl、200µl、400µl、800µl、1000µl、2000µl、4000µl、8000µl、10000µl浓度为1µg/ml的9种n-亚硝胺混合标准使用液至11个10ml量瓶中，再用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的9种n-亚硝胺混合系列标准溶液。每个标准品分别取1.0µl进样至气相色谱串联质谱仪进行检测，检测方法与检测条件与步骤（3）相同。经过检测分析，9种n-亚硝胺标准品的总离子流色谱图、定量定性离子提取色谱图和标准曲线方程分别如图1、图2a-2c、图3a-3i所示。从图2a-2c可以看出各目标物的分离度高、峰形好、定量定性离子响应良好。从图3a-3i可以看出：9种亚硝胺在1ng/ml-1000ng/ml浓度范围内线性良好，。各标准曲线的曲线方程如下表所示：

注：上表中x代表浓度，ng/ml，y代表定量离子峰面积。

（5）根据步骤（4）所得的标准曲线以外标法计算步骤（2）待测样品中n-亚硝胺的浓度c，根据公式计算待测样品中的9种n-亚硝胺的含量x，x的单位为µg/kg；然后再根据样品的稀释倍数x=c×5ml/10g=c/2计算出肉质品中n-亚硝胺含量。

经过计算实施例1肉质样品中9种n-亚硝胺的含量如下表所示：

注：n.d.表示未检出。

实施例2

取空白肉制品10g，加入20µl浓度为1µg/ml的9种n-亚硝胺混合标准使用液，得到肉制品加标样。再按照实施例1的步骤（1）-（3）操作。空白肉制品加9种n-亚硝胺标准品的总离子流色谱和定量定性离子提取色谱图分别如图4、图5a、图5b、图5c所示。空白肉制品不加n-亚硝胺标准品的总离子流色谱图、定量定性离子提取色谱图如图6、图7a、图7b和图7c所示。从图中可以看出，综合图5a-5c和图7a-7c，目标峰与杂质峰的分离度高、不受杂质峰干扰，说明本方法可靠、有效。

质量控制:a.肉制品加标样的n-亚硝胺定性离子与定量离子的响应丰度比，以标准溶液的响应丰度比为参考，偏差在欧盟(2002/657/ec)要求范围内；b.加标浓度为0.5-2.0μg/kg时，9种n-亚硝胺的回收率在60%-120%范围内，rsd≤10%。

根据待测样液中的n-亚硝胺定量离子峰面积，结合实施例1的标准曲线，计算得到待测样液中n-亚硝胺的含量cng/ml，并按以下公式计算得到肉制品加标样液中n-亚硝胺的含量xµg/kg。

x=c×5ml/10g=c/2

肉制品加标样重复步骤（3）连续进样6次，测定值以及回收率、相对标准偏差计算结果如下表所示：

从上表可得知肉制品加标样的回收率高于95%，相对标准偏差在5%范围之内，因此本方法具有很高的准确度和精确度。